專利名稱：水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白的新用途，特別是涉及一個水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10在抑制基因沉默中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因沉默現(xiàn)象普遍存在于動、植物體中?，F(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的模型中，沉默基因被降解的途徑主要有PTGS、VIGS等。現(xiàn)有的PTGS模型認(rèn)為系統(tǒng)沉默的產(chǎn)生是由于在引發(fā)基因沉默的區(qū)域產(chǎn)生系統(tǒng)基因沉默信號，該信號具有序列特異性，并且能夠經(jīng)植物的胞間連絲和微管系統(tǒng)傳播到植株的各部分?，F(xiàn)在還認(rèn)為雙鏈RNA的產(chǎn)生是引發(fā)PTGS的必要條件。并且認(rèn)為系統(tǒng)基因沉默信號的產(chǎn)生位點在PTGS的起始階段，即形成dsRNA之前(11.Hamilton，A.，Voinnet，O.，Chappell，L.，and D.C.Baulcombe.2002.Two classes of short interfering RNA in RNA silencing.EMBOJ.174671-4679；Mallory，A.C.，Mlotshwa，S.，Bowman，L.H.，Vance，V.B.2003.The capacity of transgenic tobacco to send a systemic RNA silencingsignal depends on the nature of the inducing transgene locus.Plant J.35，82-92；Susi，P.，M.Hohkuri，T.Wahlroos，and N.，J.，Kilby.2004.Characteristics of RNA silencing in plantssimilarities and differencesacross kingdoms.Plant Mol.Bil.54157-174；Voinnet，O.，Baulcombe，D.C.1997.Systemic signalling in gene silencing.Nature 389，553.Hamilton，A.，Voinnet，O.，Chappell，L.，Baulcombe，D.，2002.Two classes of shortinterfering RNA in RNA silencing.EMBO J.21，4671-4679；Voinnet，O.，Lederer，C.and Baulcombe，D.C.2000.A viral movement protein prevents spreadof the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.Cell 103157-167.)。被沉默基因的mRNA通過PTGS途徑被降解成21-25nt的siRNA。通過檢測siRNA的存在可確定PTGS的產(chǎn)生，因而siRNA又被稱為PTGS的特征分子(Bernstein，E.，A.A.Caudy，S.M.Hammond，and G.J.Hannon.2001b.Role for a bidentateribonuclease in the initiation step of RNA interference.Nature 409363-366；Hammond，S.M.，E.Bernstein，D.Beach，and G.J.Hannon.2000.An RNA-directednuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.Nature 404293-296；Tuschl，T.，P.D.Zamore，R.Lehmann，D.P.Bartel，and P.A.Sharp.1999.Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA invitro.Genes Dev.133191-3197；Zamore，P.D.，T.Tuschl，P.A.Sharp，and D.P.Bartel.2000.RNAidouble-stranded RNA directs the ATP-dependentcleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals.Cell 10125-33.)。
用二種不同的病毒侵染植物常導(dǎo)致病毒癥狀的加重，這種現(xiàn)象稱為病毒的協(xié)同效應(yīng)(synergetic effect)(Pruss，G.，X.Ge，X.M.Shi，J.C.Carrington，and V.B.Vance.1997.Synergismthe potyviral genome encodes a broad-rangepathogenicity enhancer that transactivates replication of heterologousviruses.Plant Cell 9859-868.；Voinnet，O.，C.Lederer，and D.C.Baulcombe.2000.A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signalin Nicotiana benthamiana.Cell 103157-167.)?，F(xiàn)已知產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機制在于二種病毒中的基因沉默抑制因子功能的疊加或互補，導(dǎo)致對VIGS抑制作用的增強，從而使病毒的復(fù)制、侵染等活性得以增強(Ding，S.W.2000.RNA silencing.Curr.Opin.Biotechnol.11152-156；Voinnet，O.，C.Lederer，and D.C.Baulcombe.2000.A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signalin Nicotiana benthamiana.Cell 103157-167.Waterhouse，P.M.，and C.A.Helliwell.2003.Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing.Nature429-38.)。
番茄不孕病毒2b蛋白(Tomato aspermy virus，Tav2b)、黃瓜花葉病毒2b蛋白(Cucumber mosaic virus 2b，Cmv2b)為已經(jīng)報道的基因沉默抑制因子，具有抑制系統(tǒng)基因沉默的功能(Brigneti，G.，O.Voinnet，W.X.Li，L.H.Ji，S.W.Ding，and D.C.Baulcombe.1998.Viral pathogenicity determinants aresuppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana.EMBO J.176739-6746；Voinnet，O.2005.Induction and suppression of RNAsilencinginsights from viral infections.Nature 6206-220.)。
基因沉默抑制因子對可移動的系統(tǒng)基因沉默信號的作用主要分為二種一種是使系統(tǒng)基因沉默的信號不能產(chǎn)生；另一類是阻斷沉默信號的傳播途徑(Brigneti，G.，O.Voinnet，W.X.Li，L.H.Ji，S.W.Ding，and D.C.Baulcombe.1998.Viralpathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing inNicotiana benthamiana.EMBO.J.176739-6746；Guo，H.S.，and S.W.Ding.2002.A viral protein inhibits the long range signaling activity of the genesilencing signal.EMBO J.21398-407；Voinnet，O.，C.Lederer，and D.C.Baulcombe.2000.A viral movement protein prevents spread of the gene silencingsignal in Nicotiana benthamiana.Cell 103157-167.)。
水稻矮縮病毒(Rice dwarf virus，RDV)的基因組由12條雙鏈RNA組成，將此12個基因分別命名為S1-S10，編碼12個非結(jié)構(gòu)蛋白(Pns1-Pns10)(Xu，H.，Y.Li，Z.J.Mao，Z.Wu，L.Qu，C.An，.X.Ming，J.Schiemann，R.Casper，and Z.L.Chen.1998.Rice dwarf phytovirus segment sll encodes a nucleic acidbinding protein.Virology 240267-272；Zhang，F(xiàn).，Y.Li，Y.F.Liu，C.C.An，and Z.L.Chen.1997.Molecular cloning，sequencing，and functionalanalysis and expression in E.coli of major core protein gene(S3)of ricedwarf virus Chinese isolate.Acta Virol.141161-168；Zheng，H.H.，L.Yu，C.H.Wei，D.W.Hu，Y.P.Shen，Z.L.Chen，and Y.Li.2000.Assemblyof double-shelled，virus-like particles in transgenic rice plants expressingtwo major structural proteins of Rice dwarf virus.J Virol.749808-9810；Nobuhiro Suzuki.1995.Molecular analysis of the rice dwarf virus genome.VIROLOGY，6pp 89-95)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明發(fā)明人的研究證實，水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10可以抑制植物中基因沉默過程的產(chǎn)生。
具體來講，應(yīng)用水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10抑制植物中目的基因沉默的方法，是將編碼水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10的基因S10導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞，S10表達(dá)后，抑制基因沉默過程的產(chǎn)生，從而得到目的基因獲得表達(dá)的植株。
所述水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因S10可通過含有所述水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因S10的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體，如pE3、pWEIMING101(物理圖譜見圖16、圖17)等。
使用水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因S10構(gòu)建植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛生素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因S10的植物表達(dá)載體可通過使用滲透注射技術(shù)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、Ti質(zhì)粒、植物病毒載體等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主可包括雙子葉和單子葉植物，如煙草、擬南芥或水稻等。
實驗證明水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10均能夠顯著提高植株中瞬時GUS基因的表達(dá)量和表達(dá)持續(xù)時間，與已鑒定的基因沉默抑制因子Cmv2b和Tav2b具有相同的提高基因瞬時表達(dá)量的功能，同時Pns10能夠提高轉(zhuǎn)基因GFP的表達(dá)量，是一種新的基因沉默抑制因子，從而為利用植物材料快速、大量表達(dá)異源蛋白提供了有效的技術(shù)路線。本發(fā)明具有較高的實際應(yīng)用價值。


圖1為滲透注射后6天轉(zhuǎn)基因煙草葉片綠色熒光蛋白的觀察結(jié)果圖2為Northern雜交檢測滲透注射后6天轉(zhuǎn)基因煙草葉片內(nèi)GFP基因轉(zhuǎn)錄情況和由GFP基因的mRNA降解產(chǎn)生的siRNA的積累情況的結(jié)果圖3為Western Blott檢測轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)S10蛋白表達(dá)情況的結(jié)果圖4為通過觀察經(jīng)滲透注射的轉(zhuǎn)基因煙草系統(tǒng)葉GFP的熒光發(fā)光情況檢測Pns10作為基因沉默抑制因子對系統(tǒng)基因沉默的抑制作用的結(jié)果圖5A為檢測S10與GFP分離注射后對系統(tǒng)基因沉默的影響的實驗結(jié)果圖5B為Northern雜交檢測經(jīng)滲透注射的轉(zhuǎn)基因煙草系統(tǒng)葉GFP的轉(zhuǎn)錄情況檢測Pns10作為基因沉默抑制因子對系統(tǒng)基因沉默的抑制作用的結(jié)果。
圖6為GFP基因雙鏈RNA與S10基因瞬時共表達(dá)檢測Pns10作為基因沉默抑制因子對由雙鏈RNA引起的局部和系統(tǒng)基因沉默的抑制作用的結(jié)果圖7為Northern雜交檢測Pns10作為基因沉默抑制因子對由雙鏈RNA引起的局部和系統(tǒng)基因沉默的抑制作用的結(jié)果圖8為(35S-ssGFP或35S-dsGFP)與RDV S10或Tav2b四種組合空間分離滲透注射方式的示意9為GUS組織化學(xué)染色觀察經(jīng)滲透注射農(nóng)桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b的轉(zhuǎn)基因煙草葉片中GUS基因表達(dá)情況的結(jié)果圖10為經(jīng)滲透注射農(nóng)桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b的轉(zhuǎn)基因煙草葉片中GUS活性的熒光檢測結(jié)果圖11為經(jīng)滲透注射農(nóng)桿菌35S-S10、35S-Tav2b的轉(zhuǎn)基因煙草葉片中GFP活性的綠色熒光的觀察結(jié)果圖12為經(jīng)滲透注射農(nóng)桿菌35S-S10、35S-Tav2b的轉(zhuǎn)基因煙草葉片中GFP活性的Northern雜交檢測結(jié)果圖13為分別含S10及其突變體基因的PVX病毒載體pGR107-S10和pGR107-ΔS10侵染煙草第9和第20天后注射葉片的染病情況圖14為分別含S10及其突變體基因的PVX病毒載體pGR107-S10和pGR107-ΔS10侵染煙草第20天后系統(tǒng)葉片的染病情況圖15為分別含S10及其突變體基因的PVX病毒載體pGR107-S10和pGR107-ΔS10侵染煙草第9、20天后葉片中PVX基因組的mRNA穩(wěn)定態(tài)累積量的Northern雜交檢測結(jié)果圖16為質(zhì)粒pE3的物理圖譜圖17為質(zhì)粒pWEIMING101的物理圖譜圖18為載體p35S-ssGFP的構(gòu)建流程19為pCAMBIA1300的物理圖譜圖20為pGR107病毒載體的部分物理圖譜圖21為質(zhì)粒Jawohl8 RNAi的物理圖譜具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海生工合成。
滲透注射菌懸液的制備用滲透注射緩沖液重懸菌體至濃度為OD600＝1。室溫下放置3小時以上。如為混合注射，則各菌按相等濃度、等量混合。
滲透注射緩沖液的組成為高壓滅菌蒸餾中含MES 10mM，乙酰丁香酮(AS)150μM，MgCl210mM。
滲透注射方法在植株葉片上用一次性注射器針頭打一小孔。吸有農(nóng)桿菌的注射器去針頭，并對準(zhǔn)、抵住葉片小孔處，另一只手的食指在葉片另一面抵住小孔，輕推注射器使液體緩慢注射入葉片內(nèi)。
實施例1、編碼水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中具有抑制基因沉默作用蛋白的基因S10的篩選及檢測一、從水稻矮縮病毒(RDV)的基因組中篩選編碼具有抑制基因沉默作用蛋白的基因1、水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因S1-S12的克隆根據(jù)水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因S1-S12的序列(GenBank登錄號分別為NC_003773、AY847464、NC_003772、NC_003761、NC_003762、NC_003763、AY305383、D00536、NC_003765、D10221、NC_003767、NC_003768)設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下擴(kuò)增S1的引物Ps1F(正向引物)5’-AGAGATCTATGGATCTTGCGAGGTCGGA-3’Ps1R(反向引物)5’-GCGAATTCTCACATTTGCTCGTCGCTCT-3’；擴(kuò)增S2的引物Ps2F(正向引物)5’-AGAGATCTATGGCTTATCCTAATGACGT-3’Ps2R(反向引物)5’-GCGAATTCTCACAATGCATCATAGATAG-3’；擴(kuò)增S3的引物Ps3F(正向引物)5’-AGAGATCTATGGACAGTACCGGCCGAGC-3’Ps3R(反向引物)5’-GCGAATTCTCACAGAGGCGGCTGATCTC-3’；擴(kuò)增S4的引物Ps4F(正向引物)5’-AGAGATCTATGAACCAATCTCGAAGCTT-3’Ps4R(反向引物)5’-GCGAATTCTTACTTTGACAGCTTAGAAG-3’；擴(kuò)增S5的引物Ps5F(正向引物)5’-AGAGATCTATGTCGAACCCGGACTATTG-3’Ps5R(反向引物)5’-GCGAATTCTCAGATTTTGAATACCAAAT-3’；擴(kuò)增S6的引物Ps6F(正向引物)5’-AGAGATCTATGGACACAGAAACTCTTTG-3’Ps6R(反向引物)5’-GCGAATTCTTATTTGTACACGGTAATAG-3’；擴(kuò)增S7的引物Ps7F(正向引物)5’-AGAGATCTATGTCTGCGATTGTAGGCCT-3’Ps7R(反向引物)5’-GCGAATTCTCATAAAGTTGACAACTTTT-3’；擴(kuò)增S8的引物Ps8F(正向引物)5’-AGAGATCTATGTCACGCCAGATGTGGTT-3’
Ps8R(反向引物)5’-GCGAATTCGTATGCGCACCAGCAGATTC-3’；擴(kuò)增S9的引物Ps9F(正向引物)5’-AGAGATCTATGGGTAAGCTCCAAGATGG-3’Ps9R(反向引物)5’-GCGAATTCTCAAACTGAGGGTGCGAGTC-3’；擴(kuò)增S10的引物Ps10F(正向引物)5’-AGAGATCTATGGAAGTAGACACTGCTA-3’Ps10R(反向引物)5’-TTAGGAACCGCCGCCTTTAAGAGCA-3’；擴(kuò)增S11的引物Ps11F(正向引物)5’-AGAGATCTGCGAATTCATGAGTGGAACA-3’Ps11R(反向引物)5’-TTAGGAACTTAGGAACTTACTTACGCTT-3’；擴(kuò)增S12的引物Ps12F(正向引物)5’-AGAGATCTATGTTCAAGAGTGGGTCCGG-3’Ps12R(反向引物)5’-TTAGGAACTCACCGTTCAAGAGAAAAGG-3’以水稻矮縮病毒的基因組RNA為模板，分別在上述12對引物的引導(dǎo)下進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，50ul PCR反應(yīng)體系為dNTP(2.5mM)2.5ul，10×PCR緩沖液5ul，模板1ul，Taq酶+pfu酶(3U/ul)2ul+0.5ul，H2O 39ul。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5min，50-55℃ 45sec，72℃1-3min，72℃10min(反應(yīng)條件依各被擴(kuò)增基因的長度和各自引物堿基組成的不同而不同)。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了大小分別為4422bp、3511bp、3195bp、2218bp、2449bp、1579bp、1559bp、1424bp、1224bp、1321bp、1036bp和1066bp的片段，將上述擴(kuò)增片段回收并經(jīng)純化后分別轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆提質(zhì)粒，進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的水稻矮縮病毒12個非結(jié)構(gòu)蛋白基因S1-S12。
2、載體構(gòu)建1)構(gòu)建含有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因的載體將步驟1克隆的12個水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因S1-S12用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRI酶切后，分別與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pE3連接，得到含有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組載體，分別命名為p35S-S1-p35S-S12。
2)構(gòu)建含有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和S10提前終止突變體基因的載體S10翻譯提前終止突變體片斷是將其讀碼框的第二位的谷氨酸(GAA)替換成終止密碼TAA。該突變位點是通過設(shè)計5’端引物而引入的。方法是在引物5’-GGGGTACCCCAACATGTAAGTAGACACTGC-3’(黑斜體堿基為終止密碼)和5’-GCTCTAGAGCTTAAGAACTGCCGCCTTTGA-3’的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為先94℃5分鐘，55℃40秒，72℃1分鐘30秒，共30個循環(huán)，最后72℃10分鐘。將PCR產(chǎn)物和植物表達(dá)載體pWEIMING101經(jīng)Kpn I和Xba I酶切后，連接、重組得到S10提前終止突變克隆載體，命名為p35S-S10stop。
3)構(gòu)建含有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和單鏈綠色熒光蛋白(GFP)基因的載體。
將包含GFP基因的克隆載體pRTL2-GFP(物理圖譜見圖18)經(jīng)Hind III酶切后得到GFP基因片斷，然后將GFP基因片斷克隆到經(jīng)同樣酶酶切的載體pWEIMING101中，得到包含GFP基因的植物表達(dá)載體，命名為p35S-ssGFP，構(gòu)建流程見圖18。
4)構(gòu)建含有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和番茄不孕病毒(Tomato aspermycucumovirus，Tav)編碼的基因沉默抑制因子Tav2b基因的載體將番茄不孕病毒(Tomato aspermy cucumovirus，Tav)編碼的基因沉默抑制因子Tav2b基因克隆入載體pCAMBIA1300(物理圖譜見圖19)中，得到的Tav2b基因的植物表達(dá)載體，命名為pCAMBIA1300-T2b。
5)構(gòu)建分別含有S10、S10缺失和移碼突變基因和S10 25K缺失突變基因的PVX載體以水稻矮縮病毒的基因組RNA為模板，在引物Ps10F(引物序列為5’-AGATCGATATGGAAGTAGACACTGCTA-3’)和Ps10R(引物序列為5’-AGGTCGACTTAGGAACCGCCGCCTTTAA-3’)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含Cla I和Sal I識別位點的S10基因。PCR反應(yīng)條件為先94℃，5分鐘；55℃，40秒；72℃，1分鐘30秒，共30個循環(huán)，然后72℃ 10分鐘。將PCR產(chǎn)物和pGR107(部分物理圖譜見圖20，其中LB、RB分別表示整合到植物基因組中的左、右邊界，RdRP代表病毒的依賴于RNA的RNA聚合酶，25K、12K、8K和CP分別代表病毒編碼的25K、12K、8K和外殼蛋白，MCS代表多克隆位點，下方箭頭所示gRNA、sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3分別代表病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因組、亞基因組1、亞基因組2和亞基因組3)經(jīng)Cla I和Sal I酶切后，經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化和在含50ug/mL卡那霉素的LB抗性培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，將質(zhì)粒載體命名為pGR107-S10。含有S10缺失和移碼突變的克隆載體pGR107-ΔS10的構(gòu)建方法為將pGR107-S10載體用Csp45 I酶切，用T4 DNApolymerase補平，再經(jīng)連接得到。含有PVX p25缺失突變克隆pGR107-Δ25K-S10是用pGR107-S10經(jīng)Bsu36I酶切，DNA聚合酶補平并連接后得到，該25K缺失突變基因保留3’端的75個核苷酸，將該質(zhì)粒命名為PVXΔ25K-S10。
3、轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌將步驟2構(gòu)建的載體p35S-S1-p35S-S12、p35S-S10stop、p35S-ssGFP、pCAMBIA1300-T2b和PVXΔ25K-S10分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，篩選轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化有上述載體的陽性克隆分別命名為35S-S1-35S-S12、35S-S10stop、35S-ssGFP、35S-Tav2b和PVX-S10。
4、利用GFP的瞬時表達(dá)結(jié)果從水稻矮縮病毒的基因組中篩選具有抑制基因沉默作用的基因采用滲透注射技術(shù)，將水稻矮縮病毒12個非結(jié)構(gòu)蛋白基因的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌35S-S1至35S-S12與單鏈GFP基因的轉(zhuǎn)化菌35S-ssGFP等濃度(OD600＝1)、等體積混合，共注射轉(zhuǎn)有GFP基因的煙草(Nicotiana benthamiana)16c株系，同時以35S-Tav2b和35S-ssGFP共注射植株作為正對照，以35S-S10stop和35S-ssGFP共注射植株作為負(fù)對照，以35S-ssGFP單獨注射植株為參照。注射后2-3天，在長波長的紫外燈下觀察上述轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)GFP基因的瞬時表達(dá)情況。正常情況下，GFP應(yīng)呈現(xiàn)較亮的綠色熒光，而野生型的煙草在紫外燈下呈紅色(由于葉綠素在紫外燈下呈紅色的緣故)，且轉(zhuǎn)有GFP基因的煙草(Nicotiana benthamiana)16c在GFP基因沉默的情況下也呈紅色。結(jié)果35S-ssGFP單獨注射和與上述其它轉(zhuǎn)化菌同時注射的葉片，由于外源和內(nèi)源GFP基因同時表達(dá)的緣故，注射區(qū)域在紫外燈下呈現(xiàn)亮的綠色熒光。在共注射組合35S-S10+35S-ssGFP、35S-Tav2b+35S-ssGFP中，注射區(qū)域的熒光可一直持續(xù)保持發(fā)光達(dá)7天以上，并且前一種組合(35S-S10+35S-ssGFP)注射區(qū)的熒光強度比后一種的(35S-Tav2b+35S-ssGFP)較弱。共注射PVXΔ25K-S10+35S-ssGFP的結(jié)果與上述相同。而35S-Tav2b+35S-ssGFP共注射區(qū)的熒光可一直持續(xù)發(fā)光直到注射區(qū)的葉片組織死亡為止。35S-ssGFP單獨或與除35S-S10以外的其它轉(zhuǎn)化有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌以及與35S-S10stop共注射的葉片區(qū)域從第3天開始，綠色熒光蛋白的熒光亮度逐漸減弱，至第6-7天則完全變紅(如圖1所示，1、2、3、4分別表示注射有下述組合的GFP轉(zhuǎn)基因煙草葉片35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+PVXΔ25K-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b、35S-ssGFP+35S-S10stop；5表示經(jīng)35S-ssGFP單獨注射的葉片)。與經(jīng)文獻(xiàn)報道的結(jié)果相同，GFP綠色熒光的丟失表明GFP基因的表達(dá)被沉默(Anandalakshmi et al.，1998；Brignetiet al.，1998；Hamilton et al.2002；Voinnet et al.，1997)。GFP熒光的觀察結(jié)果表明，S10的表達(dá)與番茄不孕病毒(Tomato aspermy cucumovirus，Tav)編碼的基因沉默抑制因子Tav2b一樣，具有抑制基因沉默(本實施例為GFP基因)的功能。而RDV的其它11個非結(jié)構(gòu)蛋白基因表達(dá)后則沒有此功能。
二、Northern雜交檢測轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)GFP基因的表達(dá)水平進(jìn)一步用Northern雜交的方法鑒定水稻矮縮病毒12個非結(jié)構(gòu)蛋白基因中負(fù)責(zé)編碼基因沉默抑制因子的基因。對步驟一獲得的各種注射滲透組合的葉片材料在第6天取樣，剪下注射區(qū)域，提取RNA后進(jìn)行Northern雜交驗證，所用探針為地高辛標(biāo)記的GFP基因，結(jié)果如圖2所示(泳道1-5分別表示經(jīng)35S-ssGFP+35S-Tav2b、35S-ssGFP+PVXΔ25K-S10、35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-S10stop組合注射和經(jīng)35S-ssGFP單獨注射的葉片；圖中底部rRNA為溴化乙錠染色的18S RNA，作為相等上樣量的標(biāo)示)，共注射35S-ssGFP+35S-S10和35S-ssGFP+35S-Tav2b的葉片的穩(wěn)定態(tài)mRNA的表達(dá)水平在第6天仍有大量的積累，而單獨注射35S-ssGFP或35S-GFP+35S-S10stop注射組合的轉(zhuǎn)基因植株葉片組織中的mRNA則基本上檢測不到，表明1)外源引入的GFP基因的大量表達(dá)可引起內(nèi)、外源GFP基因的沉默，即在第6天時35S-ssGFP單獨注射或與35S-S10stop共注射導(dǎo)致GFP基因不表達(dá)，其mRNA被降解；2)與對照相比，35S-ssGFP+35S-S10共注射葉片GFP基因的mRNA仍有大量積累，與步驟一中GFP熒光仍然保持的觀察結(jié)果一致，證明RDV S10與Tav2b一樣，具有抑制由ssGFP引起的基因沉默的功能，進(jìn)一步從分子水平上證明S10是RDV的基因沉默抑制因子。
三、Northern雜交檢測轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)siRNA的積累情況將步驟一獲得的的各種注射滲透組合的葉片材料在第6天取樣，剪下注射區(qū)域，提取小RNA樣品，通過變性15％PAGE膠分離，以地高辛標(biāo)記的GFP基因為探針進(jìn)行Northern雜交，檢測由GFP基因的mRNA降解產(chǎn)生的siRNA的積累情況，結(jié)果如圖2所示，35S-ssGFP單獨注射或與S10stop共注射的葉片內(nèi)siRNA大量積累。與對照相比，共注射組合35S-ssGFP+S10和35S-ssGFP+TAV2b葉片中的siRNA的積累量則顯著減少，表明負(fù)對照(35S-ssGFP單獨注射或與S10stop共注射)組的植株在注射后第6天GFP基因的mRNA的消失的確是由于其被特異性地降解成siRNA，而共注射組合35S-ssGFP+S10、35S-ssGFP+Tav2b樣品中GFP基因的mRNA大量累積，且siRNA相對少量累積，表明GFP基因的mRNA經(jīng)PTGS機制的降解過程被大部分抑制，即RDV S10與Tav2b一樣，具有抑制GFP基因轉(zhuǎn)錄后基因沉默的功能。此外，35S-S10和35S-TAV2b二種與35S-GFP共注射的樣品中均有少量21nt、25nt的siRNA產(chǎn)生，說明RDV S10與Tav2b一樣，均不能完全阻斷或去除siRNA的產(chǎn)生(Guo，H.S.and Ding S.-W.2002.A viral protein inhibitsthe long range signaling activity of the gene silencing signal.EMBO J.21398-407.；Li，H.W.，A.P.Lucy，H.S.Guo，W.X.Li，L.H.Ji，S.M.Wong，S.W.Ding.1999.Strong host resistance targeted against a viralsuppressor of the plant gene silencing defence mechanism.EMBO J182683-2691.)。
四、Western Blott檢測轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)S10蛋白的表達(dá)情況1、S10在農(nóng)桿菌中的克隆將實施例1獲得的p35S-S10用Bgl II和EcoR I雙酶切后，切膠回收S10，將其克隆到經(jīng)同樣酶雙酶切的植物表達(dá)載體pE3中，經(jīng)連接得到含有S10的重組載體，命名為pE3-S10。在含有50ug/mL的利福平和50ug/mL的壯觀霉素的3-5mL LB液體培養(yǎng)基中接種農(nóng)桿菌EHA105，在28℃、200rpm下振蕩培養(yǎng)12-24小時至菌濃度OD600＝1-2，再按1∶1000擴(kuò)大培養(yǎng)至菌濃度OD600＝1-2，擴(kuò)大培養(yǎng)基組成LB液體培養(yǎng)中含MES 10mM，AS20μM，50ug/mL的利福平和50ug/ml的壯觀霉素。培養(yǎng)結(jié)束后，2000g離心5分鐘，去除上清。
2、S10在大煙草中的表達(dá)將步驟一構(gòu)建的含S10的重組載體pE3-S10轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL-1，挑選陽性克隆，滲透注射入煙草葉片中(Nicotiana benthamiana)16c株系，使S10在煙草內(nèi)瞬時表達(dá)。
3、Western Blott檢測轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)Pns10的表達(dá)情況用Western Blott法檢測步驟一獲得的35S-ssGFP+PVX-S10、35S-ssGFP+35S-S10stop共注射植株內(nèi)S10編碼蛋白Pns10的表達(dá)情況，以步驟1在大腸桿菌中表達(dá)的S10蛋白和步驟2轉(zhuǎn)化有pE3-S10的植株內(nèi)表達(dá)的Pns10為陽性對照，所用抗體為常規(guī)方法制備的Pns10抗體，結(jié)果如圖3所示(泳道1-5分別表示在大腸桿菌中表達(dá)的Pns10、瞬時表達(dá)pE3-S10的植株內(nèi)的Pns10、35S-ssGFP+PVX-S10共注射植株內(nèi)Pns10的表達(dá)情況、35S-ssGFP+S10stop共注射植株內(nèi)Pns10的表達(dá)情況、空白對照)，表明S10的翻譯提前終止突變體35S-S10stop沒有抑制基因沉默的功能，該突變體不能翻譯成完整的Pns10，與正常Pns10所具有的抑制基因沉默功能相比，RDV S10所具有的基因沉默抑制子的功能是其蛋白Pns10、而非其核酸的作用產(chǎn)生的。
實施例2、檢測水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對系統(tǒng)基因沉默的抑制作用一、通過觀察GFP的熒光檢測水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對系統(tǒng)基因沉默的抑制作用以GFP基因為例檢測水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對系統(tǒng)基因沉默的抑制作用。實施例1的試驗結(jié)果表明Pns10具有抑制本葉(即葉片的滲透注射區(qū))GFP基因沉默的功能。GFP轉(zhuǎn)基因煙草Nicotiana benthamiana 16c株系經(jīng)滲透注射35S-ssGFP、35S-ssGFP+35S-S10stop不但能誘導(dǎo)本葉的GFP基因沉默(圖1中的4、5所示)，而且還能在2周以后引起上部系統(tǒng)葉以及最后全植株的GFP基因沉默(Voinnet，O.，and D.C.Baulcombe.1997.Systemic signalling in genesilencing.Nature 389553.)。為了確定RDV Pns10作為基因沉默抑制因子是否對系統(tǒng)基因沉默具有抑制作用，觀察經(jīng)下述各種滲透注射組合的煙草植株GFP的表達(dá)情況，方法為在轉(zhuǎn)GFP基因的煙草Nicotiana benthamiana 16c株系處于4葉期大小的時候，在植株的底部2片葉上分別注射各種農(nóng)桿菌組合，6-7天后觀察上部未注射葉片(稱為系統(tǒng)葉)的GFP表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示(1-3分別表示經(jīng)35S-ssGFP單獨注射、35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b)，負(fù)對照組中的35S-ssGFP單獨注射組的植株最早從注射后第6天開始在最上部的系統(tǒng)葉上即開始出現(xiàn)GFP基因的沉默現(xiàn)象，表現(xiàn)為在紫外燈下，先在主葉脈和次級葉脈處出現(xiàn)紅色，繼而擴(kuò)展到整個葉片(注射2周后)乃至整個植株(注射15天后的觀察結(jié)果見圖4中的第1圖)，大部分的負(fù)對照均出現(xiàn)GFP的系統(tǒng)沉默現(xiàn)象。共注射35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b的大部分植株均未發(fā)現(xiàn)GFP系統(tǒng)沉默上傳的現(xiàn)象(見圖4中的第2、3圖)。
二、Northern雜交檢測水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對系統(tǒng)基因沉默的抑制作用用與實施例1相同的方法，通過檢測步驟一獲得的轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)GFP基因的表達(dá)水平和由GFP基因的mRNA降解產(chǎn)生的siRNA的積累情況，檢測水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對系統(tǒng)基因沉默的抑制作用，顯微注射結(jié)果如圖5A所示，Northern雜交檢測結(jié)果如圖5B所示(泳道1-5分別表示經(jīng)35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b、35S-ssGFP(T)+35S-S10(B)、35S-ssGFP單獨注射、35S-ssGFP(B)+35S-S10(T)滲透注射的葉片；B和T分別代表葉的基部(base)和頂部(tip)單獨注射的葉片；圖中底部rRNA為溴化乙錠染色的18S RNA，作為相等上樣量的標(biāo)示)，35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b和35S-ssGFP(T)+35S-S10(B)共注射植株的系統(tǒng)葉中GFP基因的mRNA含量豐富，由其降解的siRNA則檢測不到(見泳道1-3)，負(fù)對照組(35S-ssGFP單獨注射、35S-ssGFP(B)+35S-S10(T))的GFP基因的mRNA基本檢測不到，而由其降解的siRNA則大量地累積(見泳道4-5))。與步驟一GFP綠色熒光觀察結(jié)果相一致，進(jìn)一步證明RDV S10對由ssGFP引起的系統(tǒng)沉默同樣具有抑制作用。表明Pns10對GFP的系統(tǒng)基因沉默具有抑制作用，其作用機制可能阻斷系統(tǒng)基因沉默信號的傳播或使其失活。
實施例3、檢測水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對由雙鏈RNA引起的局部和系統(tǒng)基因沉默的抑制作用實施例2的試驗結(jié)果表明水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10對于由ssGFP引起的局部和系統(tǒng)的GFP基因沉默均有抑制作用?，F(xiàn)有的PTGS模型認(rèn)為系統(tǒng)沉默的產(chǎn)生是由于在引發(fā)基因沉默的區(qū)域產(chǎn)生系統(tǒng)基因沉默信號，該信號具有序列特異性，并且能夠經(jīng)植物的胞間連絲和微管系統(tǒng)傳播到植株的各部分。現(xiàn)在還認(rèn)為雙鏈RNA的產(chǎn)生是引發(fā)PTGS的必要條件。并且認(rèn)為系統(tǒng)基因沉默信號的產(chǎn)生位點在PTGS的起始階段，即形成dsRNA之前。有鑒與此，用下述實驗進(jìn)一步分析RDV S10作用于PTGS途徑中的具體步驟，從而更深入地闡明S10的作用機制。該實驗所依據(jù)的原理是，在植物細(xì)胞中引入GFP基因的雙鏈RNA(dsGFP)，按照PTGS作用模式，同樣能夠引發(fā)GFP的沉默，而且根據(jù)已有的報道，雙鏈RNA比單鏈RNA是更強的引起基因沉默的誘導(dǎo)分子(Bernstein et al.，2001；Elbashir et al.，2001b；Fire et al.，1998；Tuschl et al.，1999；Voinnetet al.，1998；Winston et al.，2002)。ssRNA和dsRNA引起PTGS的區(qū)別在于前者需要細(xì)胞的RdRP以合成雙鏈，而后者不依賴于這一過程而直接形成dsRNA。如果S10與PTGS的作用位點在形成dsRNA的上游，則在S10與35S-dsRNA GFP共表達(dá)的情況下，推測S10不能夠影響GFP的RNA沉默的產(chǎn)生。反之如果S10作用于形成dsRNA的下游，則無論由ssRNA還是dsRNA引起的GFP的RNA沉默均受到抑制。利用dsRNA與待鑒定的基因沉默抑制因子共表達(dá)，觀察基因沉默是否受影響，可以確定該因子是作用于形成dsRNA的上游還是其下游，或是與dsRNA相結(jié)合。具體方法如下1、含有GFP基因反向重復(fù)序列的載體pJawohl8-GFP RNAi的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的獲得構(gòu)建含反向重復(fù)序列GFP的植物表達(dá)載體pJawohl8-GFP RNAi的過程如下GFP基因片斷經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得，模板為克隆的GFP基因(GeneBank No.M62653)，引物序列為5-CACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’和5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5分鐘，52℃ 40秒，72℃ 1分鐘15秒，共30個循環(huán)；然后72℃ 10分鐘。用Invitrogen公司的“TOPO克隆技術(shù)”將PCR擴(kuò)增的GFP基因先克隆到中間載體pTOPO中，反應(yīng)條件為PCR GFP片斷(約100ng/μl)5.5μl，pENTR 2μl，Salt solution2.5μl，室溫下放置1小時或適當(dāng)延長反應(yīng)時間，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有50ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，命名為pENTR-GFP。然后將陽性克隆質(zhì)粒再與載體pJawohl8 RNAi(物理圖譜見圖21及載體序列為GeneBankNo.AF408413)一起經(jīng)LR重組反應(yīng)，將二個GFP片斷重組進(jìn)載體pJawohl8 RNAi中，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為5×LRreaction buffer 4μl，pENTR-GFP 10μl，pJawohl8 RNAi4μl，LR clonase Mix 2μl，室溫下反應(yīng)12-24小時，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將在含有50ug/mL氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，得到含有GFP基因反向重復(fù)序列的質(zhì)粒載體，命名為pJawohl8-GFP RNAi。該載體在轉(zhuǎn)錄后由于有同源配對序列將形成GFP基因的雙鏈RNA，從而抑制GFP基因的表達(dá)。將pJawohl8-GFP RNAi電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101(其中包含質(zhì)粒pMP90RK)，篩選陽性重組子，命名為35S-dsGFP。
2、GFP基因雙鏈RNA與S10基因瞬時共表達(dá)檢測水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對由雙鏈RNA引起的局部和系統(tǒng)基因沉默的抑制作用將35S-ssGFP、35S-dsGFP分別和35S-S10、35S-Tav2b混合后，分別滲透注射入GFP轉(zhuǎn)基因煙草Nicotiana benthamiana 16c株系中，以35S-ssGFP+35S-dsGFP以及35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-S10stop混合菌注射植株作為負(fù)對照。其中各組合中加入單鏈、正義鏈GFP基因是為了便于觀察GFP基因的表達(dá)及其沉默狀況，因為35S-dsGFP不能表達(dá)GFP。在注射5天后在紫外燈下觀察并拍照，結(jié)果如圖6所示(1-4分別表示ssGFP+dsGFP、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-dsGFP+S10stop、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-Tav2b注射組的葉片；5表示35S-S10+35S-dsGFP在植株底部葉片注射后15天系統(tǒng)葉片GFP沉默的情況)，混合注射ssGFP+dsGFP、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-S10及35S-ssGFP+35S-dsGFP+S10stop的葉片中GFP基因完全沉默。同時在注射后15天觀察，系統(tǒng)葉也發(fā)生了GFP基因的沉默現(xiàn)象，表明S10對于由雙鏈RNA引起的局部和系統(tǒng)基因沉默均沒有抑制作用。而混合注射35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-Tav2b的本葉在葉片注射區(qū)存活的情況下，GFP一直表達(dá)，表明Tav2b對于由雙鏈引起的GFP局部基因沉默具有抑制作用(圖6中的第4圖)。
3、Northern雜交檢測水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對由雙鏈RNA引起的局部和系統(tǒng)基因沉默的抑制作用用與實施例1相同的方法，通過檢測步驟2獲得的轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)GFP基因的表達(dá)水平和由GFP基因的mRNA降解產(chǎn)生的siRNA的積累情況，檢測水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對由雙鏈RNA引起的局部和系統(tǒng)基因沉默的抑制作用，結(jié)果如圖7所示(泳道1-4分別表示ssGFP+dsGFP、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-dsGFP+S10stop、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-Tav2b注射組的葉片；泳道5表示35S-S10+35S-dsGFP在植株底部葉片注射后15天系統(tǒng)葉片GFP沉默的情況)，表明S10對于由雙鏈RNA引起的局部和系統(tǒng)基因沉默均沒有抑制作用(見泳道2)。但系統(tǒng)葉在注射35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-Tav2b 2周以后GFP沉默，表明Tav2b對于由雙鏈RNA引起的GFP局部基因沉默具有抑制作用(見泳道4)，而對系統(tǒng)沉默沒有抑制作用(因與S10混合注射引起的結(jié)果相同，數(shù)據(jù)未顯示)。Northern雜交檢測結(jié)果與GFP熒光觀察結(jié)果一致，進(jìn)一步證明1)RDV S10不能抑制由雙鏈RNA產(chǎn)生的局部和系統(tǒng)GFP基因沉默。由此推測S10作用于PTGS途徑中雙鏈RNA產(chǎn)生的上游，即可能作用于細(xì)胞中的RdRP或其輔助因子。2)Tav2b對由雙鏈引起的GFP局部基因沉默具有抑制作用，但對系統(tǒng)基因沉默則沒有作用。暗示系統(tǒng)基因沉默信號的產(chǎn)生和傳播路徑可能具有以下二種性質(zhì)(1)系統(tǒng)基因沉默信號可能不止一種；(2)該信號的傳播途徑可能也不止一條。并且這種多信號組成或多信號傳播途徑依賴于引起基因沉默引發(fā)分子的不同(即單鏈或雙鏈RNA)。這二種可能性或者同時存在，或者其中任何一種存在均導(dǎo)致所觀察的結(jié)果。而Tav2b對不同形式的引發(fā)分子產(chǎn)生的不同結(jié)果則說明其可能只作用于其中的一種信號或阻斷其中的一條傳播途徑。
實施例4、水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10在基因沉默信號傳播途徑中的表達(dá)對系統(tǒng)基因沉默影響的分析實驗上述實施例中的實驗表明RDV S10具有抑制系統(tǒng)基因沉默信號產(chǎn)生的功能。已知基因沉默信號的傳播過程實際上也是其不斷擴(kuò)增、放大的過程(Himber，C.，P.Dunoyer，G.Moissiard，C.Ritzenthaler，and O.Voinnet.2003.Transitivity-dependent and-independent cell-to-cell movement of RNAsilencing.The EMBO Journal 224523-4533.)，當(dāng)RDV S10在基因沉默信號傳播的途徑中表達(dá)時，即在產(chǎn)生沉默信號的區(qū)域(稱為信號的源，source)與接受信號區(qū)域之間表達(dá)，如果Pns10對基因沉默信號產(chǎn)生作用，則勢必影響該信號的傳播，并最終影響基因系統(tǒng)沉默的產(chǎn)生。參照Guo等描述的方法(Guo，H.S.and Ding S.-W.2002.A viral protein inhibits the long range signaling activity of the genesilencing signal.EMBO J.21398-407.)中所進(jìn)一步確定Pns10對系統(tǒng)基因沉默信號的作用方式，具體方法為將引起GFP沉默的引發(fā)分子(35S-ssGFP或35S-dsGFP)與RDV S10或Tav2b分別經(jīng)滲透注射入同一葉片的不同部位(基部或頂部)或同一植株的的不同部位(上部葉片和下部葉片)，其空間分離滲透注射方式的示意圖如圖8所示(紅色代表注射含基因沉默抑制因子的農(nóng)桿菌區(qū)域，綠色代表注射含GFP基因的農(nóng)桿菌區(qū)域)。含GFP基因沉默的引發(fā)分子(ssGFP或dsGFP)與基因沉默抑制因子(S10或Tav2b)的4種組合及其注射方式對GFP系統(tǒng)基因沉默影響的部分統(tǒng)計結(jié)果如表2所示。當(dāng)S10或Tav2b在系統(tǒng)基因沉默信號傳播的途徑中表達(dá)時(即在葉基部或植株的第二片系統(tǒng)葉)，而系統(tǒng)沉默信號在葉頂部或第一片葉中由35S-ssGFP產(chǎn)生時，大部分植株中GFP基因的系統(tǒng)沉默不能產(chǎn)生(表2中的第8、12組合)。但在同樣的注射方式下，當(dāng)產(chǎn)生信號源為dsGFP時，幾乎所有的植株均有系統(tǒng)基因沉默的產(chǎn)生(表2中的第10、14組合)。負(fù)對照中所有植株中的GFP基因也均產(chǎn)生系統(tǒng)基因沉默。用Tav2b所做的同樣的實驗所得結(jié)果與S10的實驗結(jié)果一致(表2中未列出)。以上實驗表明Pns10能夠抑制由GFP單鏈、正義鏈引起的系統(tǒng)基因沉默信號的傳播，從而使GFP系統(tǒng)基因沉默不能夠建立。而對由GFP雙鏈引起的系統(tǒng)基因沉默信號的傳播和系統(tǒng)基因沉默的建立沒有影響。
表2 各種組合農(nóng)桿菌滲透注射引起的GFP系統(tǒng)基因沉默株數(shù)統(tǒng)計表

*括號中的B和T分別指注射部位葉的基部(Base)和頂部(Tip)；**括號中的U和L分別指植株的上部葉(Upper)和下部葉(Lower)。
實施例5、水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10具有增強瞬時和永久基因表達(dá)的功能驗證實驗一、檢測水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10對瞬時表達(dá)GUS基因的影響上述實施例中用滲透注射法在GFP轉(zhuǎn)基因的煙草Nicotiana benthamiana 16c株系中進(jìn)行的基因沉默抑制因子(S10、Tav2b)與GFP基因的瞬時表達(dá)實驗結(jié)果表明Pns10抑制本葉GFP基因沉默的效率比Tav2b要弱，此結(jié)論是從注射葉片GFP綠色熒光的亮度和持續(xù)時間上得出的，即前者比后者的熒光亮度在注射后第6天要弱，并且持續(xù)的時間也比后者要短。用葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因作為誘導(dǎo)基因沉默的引發(fā)分子，觀察瞬時表達(dá)GUS基因的條件下Pns10的作用情況，以進(jìn)一步比較Pns10和Tav2b在抑制基因沉默效率上的差異，已知的基因沉默抑制因子Tav2b和Cmv2b分別被用作正對照，具體方法如下所示1、GUS組織化學(xué)染色觀察經(jīng)滲透注射農(nóng)桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b的煙草葉片中GUS基因的表達(dá)情況將農(nóng)桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b分別滲透注射GFP轉(zhuǎn)基因的煙草Nicotiana benthamiana 16c株系中的煙草葉片，單獨注射的35S-GUS作為負(fù)對照。滲透注射后5天的葉片取樣，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果如圖9所示(1-4分別表示35S-GUS單獨注射組、35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Cmv2b、35S-GUS+35S-Tav2b混合注射組)，單獨注射35S-GUS的葉片在注射后的第5天只有較少量的GUS活性可以檢測到，表現(xiàn)為只能檢測到痕量的藍(lán)色反應(yīng)底物。而在混合注射35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b和35S-GUS+35S-Cmv2b的葉片中，注射后5天的GUS活性仍然較強，表現(xiàn)為有大量的藍(lán)色反應(yīng)底物累積。表明S10與Tav2b和Cmv2b一樣，在非轉(zhuǎn)基因的、外源瞬時表達(dá)基因作為唯一的誘導(dǎo)PTGS引發(fā)分子的實驗體系中同樣具有抑制基因沉默的功能。
2、經(jīng)滲透注射農(nóng)桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b的煙草葉片中GUS活性的定量檢測用熒光分光光度法定量測定步驟1獲得的3種基因沉默抑制因子與GUS基因共表達(dá)后第5天煙草葉片中GUS的相對活性，以進(jìn)一步比較RDV Pns10、Tav2b和Cmv2b三者之間抑制GUS基因沉默效能方面的差異，35S-GUS單獨注射葉片作為負(fù)對照。結(jié)果如圖10所示，與負(fù)對照相比，Pns10、Cmv2b和Tav2b均能顯著提高GUS的表達(dá)活性。但三者之間也存在差異，相對于負(fù)對照，三者與35S-GUS共注射葉片中的GUS相對活性分別約提高37.5倍、46倍和66.04倍，即Pns10使GUS相對活性提高的幅度最小，Cmv2b次之，Tav2b最強，與步驟1的GFP的綠色熒光觀察結(jié)果基本一致。
二、檢測水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10對瞬時表達(dá)GFP基因的影響1、熒光觀察經(jīng)滲透注射農(nóng)桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b的煙草葉片中GFP基因的表達(dá)情況上述實驗結(jié)果均證明Pns10具有抑制基因沉默的功能，但這些實驗均是以瞬時表達(dá)基因作為研究的對象。新近的研究表明除了已知的抗病毒等功能外，PTGS機制可能具有調(diào)節(jié)自然狀態(tài)下基因的表達(dá)功能(Senda，M.，C.Masuta，S.Ohnishi，K.Goto，A.Kasai，T.Sano，Jin-Sung Hong，and S.MacFarlaned.2004.Patterning ofVirus-Infected Glycine max Seed Coat Is Associated with Suppression ofEndogenous Silencing of Chalcone Synthase Genes.The Plant Cell 16807-818.；Tuteja，J.H.，S.J.Clough，W.C.Chan，and L.O.Vodkin.2004.Tissue-Specific Gene Silencing Mediated by a Naturally Occurring ChalconeSynthase Gene Cluster in Glycine max.The Plant Cell 16819-835.)。受該研究及步驟一進(jìn)行的Pns10對GUS基因瞬時表達(dá)調(diào)控的實驗結(jié)果進(jìn)行了以下實驗，以檢測Pns10是否對轉(zhuǎn)基因的組成型表達(dá)的基因具有調(diào)控作用。具體方法為將35S-S10和35S-Tav2b單獨滲透注射入GFP轉(zhuǎn)基因煙草N.benthamiana 16c的株系中。注射后3天觀察轉(zhuǎn)記憶植株葉片組織綠色熒光蛋白的熒光強度，以滲透注射空載體pE3和未轉(zhuǎn)GFP基因的野生型煙草為對照，結(jié)果如圖11所示(1-4分別表示為滲透注射空載體pE3、35S-Tav2b、35S-S10、未轉(zhuǎn)GFP基因的野生型煙草)，與注射空載體的葉片相比，在35S-S10和35S-Tav2b的葉片注射區(qū)域GFP的綠色熒光明顯增強。
2、Northern雜交檢測經(jīng)滲透注射農(nóng)桿菌組合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b的煙草葉片中GFP基因的表達(dá)情況用與實施例1相同的方法，檢測步驟一獲得的轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)GFP基因的表達(dá)水平的積累情況，水稻矮縮病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10作為基因沉默抑制因子對系統(tǒng)基因的沉默具有抑制作用，結(jié)果如圖12所示(泳道1-4分別表示滲透注射空載體pE3、35S-Tav2b、未轉(zhuǎn)GFP基因的野生型煙草滲透注射的葉片、35S-S10；圖中底部rRNA為溴化乙錠染色的18S RNA，作為相等上樣量的標(biāo)示)，用GFP探針對以上葉片進(jìn)行的Northern雜交實驗結(jié)果表明瞬時表達(dá)S10和Tav2b組織中的GFP的mRNA累積量明顯高于對照。這與GFP的綠色熒光觀察結(jié)果相一致。但這些樣品中的siRNA檢測不到(結(jié)果未顯示)。
上述實驗實驗結(jié)果表明1)RDV Pns10在由瞬時表達(dá)基因(此處為GUS基因)作為單一誘導(dǎo)基因沉默的引發(fā)分子的條件下同樣具有抑制基因沉默的功能，GUS基因的表達(dá)和抑制都是在沒有內(nèi)源基因存在的背景下產(chǎn)生。Pns10等抑制其沉默的功能也是在同一背景下產(chǎn)生。這與前述在轉(zhuǎn)GFP煙草中所進(jìn)行的實驗是有差別的；2)三種用于檢測的基因沉默抑制因子的作用效能存在差別，即Pns10的效能最小，Cmv2b次之，Tav2b最強；3)Pns10和Tav2b均能提高轉(zhuǎn)基因植株的GFP(組成型表達(dá))表達(dá)量。
實施例6、檢測Pns10對病毒引起的基因沉默的抑制作用一、含S10的病毒載體(PVX)侵染煙草及其病癥觀察將實施例1構(gòu)建的重組PVX載體pGR107-S10和pGR107-ΔS10轉(zhuǎn)化含有質(zhì)粒pJICSA_Rep的農(nóng)桿菌GV3101中，挑選陽性克隆，將轉(zhuǎn)化有pGR107-S10的重組子命名為35S-PVX-S10，將轉(zhuǎn)化有pGR107-ΔS10的重組子命名為35S-PVX-ΔS10，將兩者分別滲透注射于4-6葉期大的野生型煙草N.benthamiana最下部的二片葉，以轉(zhuǎn)有PVX空載體pGR107的重組子為對照，觀察植株的發(fā)病情況，第9和第20天的葉片觀察結(jié)果如圖13所示，三種注射葉片均未表現(xiàn)病毒病癥，但三種注射植株的系統(tǒng)葉(即上部未注射的葉片)均表現(xiàn)不同程度的病毒癥狀。病癥在最上部葉的出現(xiàn)最早可在注射后6天出現(xiàn)。滲透注射35S-PVX，35S-PVX-ΔS10植株系統(tǒng)葉上的病癥較注射35S-PVX-S10上的要輕，前二者最開始感病葉片上的病癥為在主葉脈和次級葉脈上現(xiàn)出現(xiàn)褪綠病斑，繼而擴(kuò)展至全葉。但在注射2周后，隨后新長出的大部分葉片的病癥減輕或消失，即這些植株重又恢復(fù)健康狀態(tài)。35S-PVX-S10感病植株的系統(tǒng)葉在2周以后觀察病癥較前二種的嚴(yán)重，表現(xiàn)為大部分系統(tǒng)葉沒有出現(xiàn)恢復(fù)健康的現(xiàn)象，并且大部分系統(tǒng)葉片上均出現(xiàn)散在分布的壞死斑，注射后20天的系統(tǒng)葉如圖14所示(1、健康的、未侵染病毒的葉片(對照)；2、PVX侵染的葉片；3、PVX-ΔS10侵染的葉片；4、PVX-S10侵染的葉片)。
二、侵染有重組PVX病毒載體pGR107-S10和pGR107-ΔS10的Northern雜交檢測為確定S10在異源病毒中的表達(dá)所引起的病癥加重的機理，即驗證是否與VIGS有關(guān)，現(xiàn)對步驟一的3種侵染植株的系統(tǒng)葉分別在注射后第9、20天剪下，提取RNA并分別以此為模板，用地高辛標(biāo)記的PVX的CP(外殼蛋白)基因探針，以pGR107為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得，引物序列為正向引物5’-ATGTCAGCACCAGCTAGCAC-3’；反向引物5’-TTATGGTGGT GGTAGAGTGA-3’)，反應(yīng)體系為模板1μl，dNTP(其中A為地高辛標(biāo)記)1μl，10×PCR緩沖液2μl，正、反向引物各1μl，Taq DNA聚合酶1μl，無菌水13μl。PCR反應(yīng)條件與前述相同。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用蛋白酶K在56℃降解30分鐘，再經(jīng)酚、氯仿抽提后，溶于DEPC處理的水中。進(jìn)行Northern雜交檢測PVX基因組的mRNA穩(wěn)定態(tài)的累積量，以健康的、未染病植株作為對照，結(jié)果如圖15所示(gRNA、gRNA1-3分別指PVX轉(zhuǎn)錄的全長基因組、亞基因組1-3)，在注射后第9天的葉片中三種侵染植株葉片的PVX基因組mRNA均有大量累積，但在侵染后第20天，35S-PVX、35S-PVX-ΔS10侵染樣品中的mRNA大部分被降解，而35S-PVX-S10的侵染樣品中仍有大量mRNA累積。上述實驗結(jié)果表明1)在PVX載體上表達(dá)的S10對病毒在本葉的病癥沒有增強作用；2)Pns10對PVX系統(tǒng)侵染及其在系統(tǒng)葉上的病癥具有增強作用，即與前述的Pns10主要抑制GFP系統(tǒng)基因沉默的作用相同，推斷Pns10對VIGS的影響主要也是抑制VIGS的系統(tǒng)RNA沉默信號的產(chǎn)生。
序列表<160>8<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1agagatctat ggatcttgcg aggtcgga 28<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gcgaattctc acatttgctc gtcgctct 28<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3agagatctat ggcttatcct aatgacgt 28<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4gcgaattctc acaatgcatc atagatag 28<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5agagatctat ggacagtacc ggccgagc 28<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6gcgaattctc acagaggcgg ctgatctc 28<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7agagatctat gaaccaatct cgaagctt 28<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8gcgaattctt actttgacag cttagaag 28
權(quán)利要求
1.水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10在抑制基因沉默中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用是將編碼水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10的基因S10導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞，S10表達(dá)后，得到目的基因獲得表達(dá)的植株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因S10通過含有所述水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因S10的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為pE3、pWEIMING101或pCAMBIA1300。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述攜帶有水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因S10的植物表達(dá)載體通過滲透注射技術(shù)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)?；蛑参锊《据d體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物宿主包括雙子葉或單子葉植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物宿主為煙草、擬南芥或水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10的新用途。其目的是提供水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10在抑制基因沉默中的應(yīng)用。具體來講，應(yīng)用水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10抑制植物中目的基因沉默的方法，是將編碼水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10的基因S10導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞，得到目的基因獲得表達(dá)的植株。實驗證明水稻矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10均能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植株中GUS基因的表達(dá)量和表達(dá)持續(xù)時間，與已鑒定的基因沉默抑制因子Cmv2b和Tav2b具有相同的提高基因瞬時、穩(wěn)定表達(dá)量的功能，是一種新的基因沉默抑制因子，從而為利用植物材料快速、大量表達(dá)異源蛋白提供了有效的技術(shù)路線。本發(fā)明具有較高的實際應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/82GK1955298SQ20051011438
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月24日
發(fā)明者曹雪松, 李毅 申請人:北京大學(xué)