專(zhuān)利名稱(chēng)：可用于檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的引物、試劑盒及其定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病毒分子生物學(xué)檢測(cè)和鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及ー種植物病毒檢測(cè)用引物、試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
南方水稻黑條矮縮病毒(Southernrice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)是今年來(lái)嚴(yán)重危害水稻的ー種新病毒。2009年以來(lái)，在我國(guó)南方主要水稻種植區(qū)爆發(fā)成災(zāi)，僅2010年，南方水稻黑條矮縮病毒病發(fā)生面積就達(dá)到1400多萬(wàn)畝，嚴(yán)重威脅到我國(guó)水稻的
安全生產(chǎn)。 南方水稻黑條矮縮病毒(Southernrice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fi jivirus),病毒粒體球狀,基因組由10條雙鏈RNA(dsRNA)組成，由白背飛風(fēng)(Sogatella furcifera Horvath)以持久性方式傳播。侵染水稻癥狀表現(xiàn)為植株矮縮、葉色深緑、高位分蘗、莖桿出現(xiàn)乳白色或淺褐色點(diǎn)條狀突起，莖節(jié)上出現(xiàn)氣生須根。SRBSDV主要浸染禾本科作物和雜草，如水稻、高粱和玉米以及看麥娘等，病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)能導(dǎo)致作物絕收。由于SRBSDV是近年來(lái)水稻上分離并命名的ー種新病毒病，目前，檢測(cè)的方法主要是病害癥狀鑒別、血清學(xué)技術(shù)和常規(guī)RT-PCR技術(shù)。病害癥狀鑒別主要根據(jù)SRBSDV浸染水稻的典型癥狀來(lái)鑒別，但在SRBSDV浸染水稻早期，水稻不會(huì)表現(xiàn)典型癥狀，因此，如果單憑病害癥狀鑒定該病害，則SRBSDV造成的損失可能已無(wú)法避免。血清學(xué)技術(shù)主要依據(jù)SRBSDV編碼的蛋白作為抗原，與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀、凝集現(xiàn)象。而常規(guī)RT-PCR技術(shù)則通過(guò)將目的DNA片段擴(kuò)增至數(shù)十萬(wàn)倍乃至百萬(wàn)倍，直至肉眼能夠直接判斷。然而，現(xiàn)有的技術(shù)均不能定量地檢測(cè)SRBSDV病毒含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ー種可用于檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的引物和試劑盒，還提供一種精確度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高的定量檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為ー種可用于檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的引物，所述引物由上游引物和下游引物組成，所述上游引物和下游引物的序列如下所示上游引物CTTTGACCGAGATGAGC；下游引物ACCTTCGTGAATGATGIT。作為ー個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供ー種可用于檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的試劑盒，包括以下組成試劑包含上述引物的引物溶液；
陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品；RNA提取試劑盒；cDNA合成反應(yīng)體系；和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系。作為ー個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供ー種定量檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的方法，包括以下步驟(I)合成上述的引物；(2)利用RNA提取試劑盒從待測(cè)農(nóng)作物樣品中提取其RNA ;所述農(nóng)作物包括水稻、
高粱、玉米、看麥娘等；(3)以步驟(2)中提取的RNA為模板，利用cDNA合成反應(yīng)體系合成cDNA ；(4)制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品，該陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序繪制得到熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)-起始濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；(5)以步驟(3)中合成的cDNA為模板，添加熒光染料和步驟(I)中合成的引物配制實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)的延伸溫度步驟采集熒光信號(hào)(采集的信號(hào)值，通過(guò)信號(hào)值可以確定對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù))，最后根據(jù)步驟(4)中建立的熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)-起始濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)得待測(cè)農(nóng)作物樣品中南方水稻黑條矮縮病毒的起始濃度值。上述方法的步驟(3)中，合成cDNA的具體方法優(yōu)選包括以下步驟將RNA free水、隨機(jī)引物六聚體和所述提取的RNA混勻，置于變性溫度65°C，4min 6min ;取出置于冰上，然后加入M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、M-MLV Buffer, dNTP Mixture和RNA抑制劑，進(jìn)行RT反應(yīng)合成cDNA。上述方法的步驟(4)中，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法優(yōu)選具體包括以下步驟從水稻陽(yáng)性樣品中提取南方水稻黑條矮縮病毒的RNA，然后以該RNA為模板，采用cDNA合成反應(yīng)體系進(jìn)行RT反應(yīng)，得到其cDNA ；以該cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，再進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化E. coli感受態(tài)DH5 a，得到陽(yáng)性克隆菌液；將陽(yáng)性克隆菌液接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再?gòu)闹刑崛〔《举|(zhì)粒，采用紫外分光光度法測(cè)定出病毒質(zhì)粒含量，最后將病毒質(zhì)粒用超純水梯度稀釋?zhuān)玫揭唤M陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品。上述的檢測(cè)方法中，所述RT反應(yīng)的程序優(yōu)選包括30°C，Ih ；70°C,15min ;_4°C保存。上述的檢測(cè)方法中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序優(yōu)選包括95°C預(yù)變性5min ；35個(gè)循環(huán)95°C變性50s，58°C退火50s，72°C延伸2min ;最后72°C延伸lOmin，_4°C保存。上述的檢測(cè)方法中，所述熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)-起始濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合方程優(yōu)選為Y = -3. 901X+6. 068，其中，Y表示熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)次數(shù)，X表示起始濃度值(単位為拷貝/UL)，檢測(cè)下限150拷貝/UL，線(xiàn)性檢測(cè)范圍為150 25703957. 83 拷貝 /u L0上述的檢測(cè)方法中，所述實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序優(yōu)選包括UDG孵育50°C，2min ;變性溫度95°C，10min ;35個(gè)反應(yīng)循環(huán)變性溫度95°C，15s ;退火溫度58°C，30s ;延伸溫度 72°C, 30so上述本發(fā)明的技術(shù)方案主要基于以下原理本發(fā)明的實(shí)時(shí)突光定量RT-PCR反應(yīng)技術(shù)是在實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品中的南方水稻黑條矮縮病毒進(jìn)行定量分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于I.本發(fā)明的方法穩(wěn)定性好、靈敏度高、精度高、特異性強(qiáng)；2.本發(fā)明方法的檢測(cè)時(shí)間短，從樣品總RNA的抽提到得到檢測(cè)結(jié)果，僅需要3. 5h ；3.本發(fā)明的方法既可以定量檢測(cè)、又能定性檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒，對(duì)減輕南方水稻黑條矮縮病毒對(duì)農(nóng)作物危害，減少農(nóng)作物損失具有重要意義。


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圖I為本發(fā)明實(shí)施例中引物特異性考察的電泳圖，其中譜帶1、2表示RBSDV陽(yáng)性樣品RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；譜帶3、4表示SRBSDV陽(yáng)性樣品RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；CK為滅菌超純水對(duì)照；M為DL2000Marker。圖2為本發(fā)明實(shí)施例I中得到的熒光信號(hào)值與采集信號(hào)循環(huán)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線(xiàn)。圖3為本發(fā)明實(shí)施例I中得到的熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)-起始濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I :—種本發(fā)明的可用于檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的引物，該引物由上游引物和下游引物組成，上游引物和下游引物的序列如下表I所示，上游引物的序列如表I中的SEQ ID1，下游引物的序列如表I中的SEQ ID 2。表I :本實(shí)施例的引物序列表
編號(hào)序列(5’-3つ位SSEQ ID I CTTTG AC'CGAG AIG AGC1608 i 624 S EQ ID 2 AC C TTC G rG A ATG ATGTT 1669... -1686一種本發(fā)明的可用于檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的試劑盒，包括以下組成試劑(本實(shí)施例中用到的各種試劑如無(wú)特別說(shuō)明，均為市售產(chǎn)品)包含上述本實(shí)施例引物的引物溶液；陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品；RNA提取試劑盒；cDNA合成反應(yīng)體系；和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系。
利用本實(shí)施例的上述引物對(duì)及試劑盒定量檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的方法，具體包括以下步驟I.合成檢測(cè)引物合成上述表I中所述序列的上游引物和下游引物；上述的引物主要根據(jù)GenBank報(bào)道的SRBSDV基因組組分S9的序列(登錄號(hào)為EU784843)，采用GenBank中分析工具Blast進(jìn)行序列比對(duì)并選擇特異性區(qū)域，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5. 0在特異性區(qū)域設(shè)計(jì)得到；該引物由北京華大基因公司合成。2. RNA 的提取利用H. Q&Q.溶液型RNA提取試劑盒(安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)從待測(cè)水稻樣品(本實(shí)施例選用采自湖南省永州市水稻田的水稻陽(yáng)性樣品，RT-PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性)中提取其RNA,操作步驟按照該RNA提取試劑盒所提供的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 3.合成 cDNA以步驟2中提取的RNA為模板，利用cDNA合成反應(yīng)體系合成cDNA ;采用20 y LcDNA合成反應(yīng)體系，將RNA free水8 y L、隨機(jī)引物六聚體2 y L和待測(cè)的樣本RNA3uL混勻，置于變性溫度65°C，5min ;取出置于冰上，然后加入M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0. 5 y L、5 X M-MLVBuffer 4 u LUOmM dNTP Mixture 2 y L 和 40U/y L 的 RNA 抑制劑 0. 5 y L，進(jìn)行 RT反應(yīng)合成cDNA，RT反應(yīng)程序?yàn)?0°C，Ih ；70°C,15min ;_4°C保存；合成的cDNA置于_20°C保存?zhèn)溆谩?.制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品從水稻陽(yáng)性樣品(采自湖南省永州市水稻田，RT-PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性)中提取南方水稻黑條矮縮病毒的RNA(具體的提取方法參見(jiàn)上述步驟2)，然后以該RNA為模板，采用cDNA合成反應(yīng)體系進(jìn)行RT反應(yīng)，得到其cDNA (具體的合成方法參見(jiàn)上述步驟3)；以該cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采用上述步驟I中合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括 cDNA 2u LUOXPCR Buffer 2. 5 u LUOmM dNTP Mixture0. 5 ii L、10ii M上游引物I. L (參見(jiàn)步驟l)、10iiM下游引物I. L (參見(jiàn)步驟1)，TaqDNApolymerase (5U/1) 0. 5 u L,滅菌超純水 13 u L ;PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min ；35個(gè)循環(huán)95°C變性50s，58°C退火50s，72°C延伸2min ;最后72°C延伸lOmin, _4°C保存；利用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(北京全式金生物技術(shù)公司)并按照其提供的使用說(shuō)明書(shū)回收純化上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，再利用pEASY -T5 Zero Cloning試劑盒(北京全式金生物技術(shù)公司)進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化E. coli感受態(tài)DH5 a，連接和轉(zhuǎn)化過(guò)程同實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū);培養(yǎng)基上挑選克隆至10 y L滅菌超純水中，渦旋混合，以步驟I中的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)驗(yàn)證，驗(yàn)證表明其為目標(biāo)片段(目標(biāo)產(chǎn)物片段大小為80bp)；再選用上述得到的陽(yáng)性克隆菌液接種于含Amp的LB培養(yǎng)基(含Amp的LB培養(yǎng)基是按照Takala公司常用試劑配制中含Amp的LB培養(yǎng)基配制方法配制而成)中培養(yǎng)，37°C條件下培養(yǎng)12h 16h ;再以質(zhì)?；厥占兓噭┖蠩asyPure Plasmid MiniPrep Kit (北京全式金生物技術(shù)公司的)提取質(zhì)粒，操作步驟同其使用說(shuō)明書(shū)；采用紫外分光光度法(根據(jù)分光光度計(jì)測(cè)定0D260nm和0D280nm的吸光度)測(cè)定其質(zhì)粒含量，然后以滅菌超純水10倍梯度稀釋?zhuān)詈笙♂尩揭?02、103、104、105、106、107倍質(zhì)粒制成陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品，毎次使用量各位I y L/反應(yīng)。5.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以步驟4中獲得的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)相應(yīng)的濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)(具體操作參見(jiàn)后續(xù)的步驟6)制成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線(xiàn)(參見(jiàn)圖2)和熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)-起始濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y = -3. 901X+6. 068(參見(jiàn)圖3)，該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)為0. 9854，PCR擴(kuò)增效率為80. 4%，該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率絕對(duì)值為3. 901，(3. 0 4. O)。6.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)以步驟3中合成的cDNA為模板，添加熒光染料和步驟I中合成的引物配制實(shí)時(shí)熒
光定量RT-PCR反應(yīng)體系，采用25 ii L的反應(yīng)體系，其中IiiL cDNA (步驟3合成)、上游引物和下游引物(步驟 I 合成)各 0. 5 u L, 12. 5 u L 2 X Transstart Green qPCR SuperMix UDG,10. 5 u LddH2O,所有反應(yīng)試劑都在冰上配制；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序是UDG孵育50°C，2min ;變性溫度95°C，IOmin ；35個(gè)反應(yīng)循環(huán)變性溫度95°C，15s ；退火溫度58°C，30s ;延伸溫度72°C，30s ;每個(gè)反應(yīng)循環(huán)的延伸溫度步驟采集熒光信號(hào)，結(jié)果如下表2所示，結(jié)果顯示3個(gè)重復(fù)陽(yáng)性樣本采集的熒光信號(hào)的循環(huán)數(shù)(Ct)為28. 55、28. 53,28. 98，根據(jù)步驟5中建立的熒光采集信號(hào)循環(huán)數(shù)-起始濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可測(cè)得三個(gè)樣本中的病毒含量分別為4. 31X104、4. 31X104、4. 37 X 104，而陰性對(duì)照沒(méi)有熒光信號(hào)。表2 :陽(yáng)性水稻樣品的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種可用于檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的引物，所述引物由上游引物和下游引物組成，所述上游引物和下游引物的序列如下所示 上游引物CTTTGACCGAGATGAGC ； 下游引物ACCTTCGTGAATGATGTT。
2.一種可用于檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的試劑盒，包括以下組成試劑 包含權(quán)利要求I所述引物的引物溶液； 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品； RNA提取試劑盒； cDNA合成反應(yīng)體系；和 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系。
3.一種定量檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的方法，包括以下步驟 (1)合成權(quán)利要求I所述的引物； (2)利用RNA提取試劑盒從待測(cè)農(nóng)作物樣品中提取其RNA； (3)以步驟(2)中提取的RNA為模板，利用cDNA合成反應(yīng)體系合成cDNA； (4)制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品，該陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序繪制得到熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)-起始濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)； (5)以步驟(3)中合成的cDNA為模板，添加熒光染料和步驟(I)中合成的引物配制實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)的延伸溫度步驟采集熒光信號(hào)，最后根據(jù)步驟(4)中建立的熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)-起始濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)得待測(cè)農(nóng)作物樣品中南方水稻黑條矮縮病毒的起始濃度值。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，合成cDNA的具體方法包括以下步驟將RNA free水、隨機(jī)引物六聚體和所述提取的RNA混勻，置于變性溫度65°C，4min 6min ;取出置于冰上，然后加入M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、M-MLV Buffer、dNTP Mixture和RNA抑制劑，進(jìn)行RT反應(yīng)合成cDNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法具體包括以下步驟從水稻陽(yáng)性樣品中提取南方水稻黑條矮縮病毒的RNA，然后以該RNA為模板，采用cDNA合成反應(yīng)體系進(jìn)行RT反應(yīng)，得到其cDNA ；以該cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，再進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化E. coli感受態(tài)DH5 α，得到陽(yáng)性克隆菌液；將陽(yáng)性克隆菌液接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再?gòu)闹刑崛〔《举|(zhì)粒，采用紫外分光光度法測(cè)定出病毒質(zhì)粒含量，最后將病毒質(zhì)粒用超純水梯度稀釋?zhuān)玫揭唤M陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品O
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述RT反應(yīng)的程序包括30°C，lh；70°C,15min ;-4°C保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序包括95°C預(yù)變性5min ；35個(gè)循環(huán)95°C變性50s，58 °C退火50s，72 °C延伸2min ;最后72 °C延伸lOmin，-4°C保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述熒光采集信號(hào)循環(huán)數(shù)-起始濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合方程為Y = -3. 901X+6. 068。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序包括UDG孵育50°C，2min ;變性溫度95°C，IOmin ；35個(gè)反應(yīng)循環(huán)變性溫度95°C，15s ;退火溫度58°C，30s ;延伸溫度72°C，30s。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可用于檢測(cè)SRBSDV的引物以及試劑盒，還公開(kāi)了一種利用該試劑盒定量檢測(cè)SRBSDV的方法，首先合成前述的引物；然后利用RNA提取試劑盒從樣品中提取其RNA；以RNA為模板并利用cDNA合成反應(yīng)體系合成cDNA，再制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品，該陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序繪制得到熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)-起始濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；最后以合成的cDNA為模板配制實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)采集的熒光信號(hào)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)得樣品中SRBSDV的起始濃度值。本發(fā)明的方法具有精確度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102952903SQ20121054460
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者張松柏, 劉勇, 張德詠, 羅香文, 程菊娥, 彭靜, 譚新球, 成飛雪, 朱春暉, 楊春曉 申請(qǐng)人:湖南省植物保護(hù)研究所