專利名稱：改善t細(xì)胞受體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提高對(duì)給定靶肽-MHC復(fù)合物(“pMHC”)特異性給定T細(xì)胞受體(“TCR”)的親和力和/或降低其解離速率(off-rate)的方法，包括制備具有不同于給定TCR的相應(yīng)CDR2序列的α鏈CDR2(互補(bǔ)決定區(qū)2)序列和/或β鏈CDR2序列的多種TCR，測(cè)定所述多種TCR成員對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率，選出對(duì)該靶pMHC的親和力比給定TCR至少高10倍和/或?qū)υ摪衟MHC的解離速率比給定TCR至少慢10倍的一個(gè)或多個(gè)TCR成員。
背景技術(shù)：
TCR介導(dǎo)T細(xì)胞特異性地識(shí)別pMHC，因此是免疫系統(tǒng)細(xì)胞免疫(cellular arm)功能所必須。天然TCR是免疫球蛋白超家族的一種異質(zhì)二聚體細(xì)胞表面蛋白，參與介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD3復(fù)合物的恒定蛋白質(zhì)相關(guān)。TCR存在結(jié)構(gòu)相似但解剖學(xué)定位與可能的功能極為不同的αβ和γδ形式。I和II類MHC配體也是專門呈遞抗原的免疫球蛋白超家族蛋白質(zhì)，它們具有高度多態(tài)性的肽結(jié)合位點(diǎn)從而使它們?cè)诳乖蔬f細(xì)胞(“APC”)表面能呈遞各種排列的短肽片段。
已知另有兩種蛋白質(zhì)能起TCR配體的作用。(1)CD1抗原是I類MHC相關(guān)分子，其基因位于(編碼)I和II類經(jīng)典MHC抗原的的不同染色體上、CD1分子能以類似于常規(guī)I和II類MHC-肽復(fù)合物的方式將肽和非肽(例如，脂質(zhì)、糖脂)部分呈遞給T細(xì)胞。參見，例如(Barclay等，(1997)，《白血球抗原手冊(cè)》(The LeucocyteAntigen Factsbook)，第二版，科學(xué)出版社)和(Bauer，(1997)，Eur J Immunol，27(6)1366-1373))。細(xì)菌超抗原是能結(jié)合II類MHC分子和TCR一亞組的可溶性毒素。(Fraser，(1989)，Nature，339 221-223)。許多超抗原對(duì)一種或兩種Vbeta區(qū)段顯示有特異性，而其它顯示更混雜的結(jié)合。無論如何，超抗原因其能激活多克隆T細(xì)胞亞組而能誘導(dǎo)提高的免疫應(yīng)答。
天然的異質(zhì)二聚體αβ和γδ TCR的胞外部分由兩條多肽組成，每條具有近膜恒定結(jié)構(gòu)域和遠(yuǎn)膜可變結(jié)構(gòu)域。每個(gè)恒定和可變結(jié)構(gòu)域都含有鏈內(nèi)二硫鍵?？勺兘Y(jié)構(gòu)域含有類似于抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高度多態(tài)性環(huán)。αβTCR的CDR3主要與MHC呈遞肽相互作用，αβTCR的CDR1和2主要與肽和MHC相互作用。相連的可變(V)區(qū)、多樣性(D)區(qū)、連接(J)區(qū)和恒定區(qū)基因的體細(xì)胞重排(somaticrearrangement)產(chǎn)生了TCR可變結(jié)構(gòu)域序列的多樣性。
重排的V-J-C區(qū)組成功能性α和γ鏈TCR多肽，而β和δ鏈由V-D-J-C區(qū)組成。胞外恒定結(jié)構(gòu)域具有近膜區(qū)和免疫球蛋白區(qū)。單獨(dú)的α和δ鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為TRAC和TRDC，β鏈結(jié)構(gòu)域由稱為TRBC1和TRBC2(INGT術(shù)語)的兩種不同β恒定結(jié)構(gòu)域之一構(gòu)成。這些β恒定結(jié)構(gòu)域中有4個(gè)氨基酸改變，其中3個(gè)在用于產(chǎn)生展示在噬菌體顆粒上的本發(fā)明單鏈TCR的結(jié)構(gòu)域內(nèi)。這些改變均在TRBC1和TRBC2的外顯子1內(nèi)N4K5-＞K4N5和F37-＞Y(IMGT編號(hào)，差異TRBC1-＞TRBC2)，兩種TCRβ鏈恒定區(qū)之間的最后一個(gè)氨基酸改變?cè)赥RBC1和TRBC2的外顯子3內(nèi)V1-＞E。恒定γ結(jié)構(gòu)域由TRGC1、TRGC2(2x)或TRGC2(3x)中任一構(gòu)成。兩種TRGC2恒定結(jié)構(gòu)域的區(qū)別只在于該基因外顯子2所編碼氨基酸的拷貝數(shù)不同。
，每種TCR胞外結(jié)構(gòu)域的范圍存在一定程度的不同。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難利用參考文獻(xiàn)，例如《T細(xì)胞受體手冊(cè)》(The T Cell Receptor Facts Book)，Lefranc和Lefranc，Publ.Academic Press，2001來確定結(jié)構(gòu)域邊界的位置。
可通過重組方式制備TCR。迄今為止，設(shè)計(jì)了許多構(gòu)建物來制備重組TCR。這些構(gòu)建物分為廣范的兩類，單鏈TCR(“scTCR”)和二聚體TCR(“dTCR”)。
展示方法顆粒展示方法主要用于鑒定具有所需性能，例如表達(dá)量、結(jié)合和/或穩(wěn)定性特征提高的蛋白質(zhì)。這些方法包括制備表達(dá)在核蛋白顆粒表面的蛋白質(zhì)或多肽的多樣性混合物或“文庫(kù)”。這些顆粒具有兩種關(guān)鍵特征，第一每種顆粒呈遞一種變體蛋白質(zhì)或多肽，第二編碼所表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的遺傳物質(zhì)與該顆粒的遺傳物質(zhì)相結(jié)合。然后對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行一輪或多輪選擇。例如，包括使配體與突變受體的顆粒展示文庫(kù)接觸，鑒定哪一種突變受體與配體結(jié)合的親和力最高。一旦選擇過程完成后，分離具有所需性能的受體，為測(cè)序這些受體可擴(kuò)增它們的遺傳物質(zhì)。
特別優(yōu)選噬菌體顆粒展示技術(shù)，該技術(shù)依據(jù)細(xì)菌噬菌體顆粒能表達(dá)與它們的表面蛋白質(zhì)融合的異源肽或多肽的能力。(Smith，(1985)，Science，217，1315-1317)。該方法相當(dāng)常見且為本領(lǐng)域熟知用于展示多肽單體。然而，就天然形式的多肽結(jié)合為二聚體而言，只有抗體的噬菌體展示技術(shù)得到充分研究。
單體多肽展示有兩種主要方法第一種方法(方法A)通過將編碼異源肽或多肽的DNA插入載體(噬菌粒)使之與編碼細(xì)菌噬菌體外被蛋白的DNA融合。然后用該噬菌粒轉(zhuǎn)染細(xì)菌細(xì)胞，再用“輔助噬菌體”感染所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞使噬菌體顆粒表達(dá)展示該異源肽或多肽。輔助噬菌體的作用是由產(chǎn)生功能性噬菌體顆粒所需的但噬菌粒不編碼的噬菌體蛋白質(zhì)來源。
第二種方法(方法B)通過將編碼異源肽或多肽的DNA插入完全的噬菌體基因組使之與編碼細(xì)菌噬菌體外被蛋白的DNA融合。然后用該噬菌體基因組感染細(xì)菌細(xì)胞使噬菌體顆粒表達(dá)展示該異源肽或多肽。該方法具有第一種“一步”法的優(yōu)點(diǎn)。然而，能成功包裝入所得噬菌體顆粒的異源DNA序列的大小有限。適用于該方法的合適噬菌體的例子是M13、T7和λ。
(方法B)的一種改進(jìn)形式包括將編碼核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列加入噬菌體基因組編碼待展示異源肽的DNA中，然后再在該噬菌體基因組中加入相應(yīng)的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。這導(dǎo)致異源肽(編碼基因)與噬菌體基因組直接相連。然后將該肽/基因組復(fù)合物包裝入展示異源肽的噬菌體顆粒。該方法描述于WO 99/11785。
然后回收這些噬菌體顆粒用于研究異源肽或多肽的結(jié)合性能。分離后，可回收展示該肽或多肽的噬菌體顆粒的噬菌?；蚴删wDNA，并用PCR復(fù)制該DNA。PCR產(chǎn)物可用于測(cè)序給定噬菌體顆粒所展示的異源肽或多肽。
單鏈抗體及其片段的噬菌體展示已成為研究這些多肽的結(jié)合特性的常規(guī)方法。許多書籍論述了噬菌體展示技術(shù)和細(xì)菌噬菌體的生物學(xué)(性質(zhì))。(參見，例如，《噬菌體展示-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Phage Display-A Laboratory Manual)，Barbas等，(2001)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。
第二種噬菌體展示方法(方法C)依據(jù)以下事實(shí)在所需位置具有半胱氨酸殘基的異源多肽可通過噬菌?；蚴删w基因組表達(dá)為可溶形式，而導(dǎo)致與表面暴露位置也具有半胱氨酸殘基的修飾的噬菌體表面蛋白通過此兩個(gè)半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵而結(jié)合。WO 01/05950詳細(xì)描述了利用這種替代連接方法來表達(dá)單鏈抗體衍生肽。
高親和力TCRT細(xì)胞在胸腺中成熟時(shí)至少經(jīng)歷了兩種選擇機(jī)制(一般稱為陽性和陰性選擇)。據(jù)信，大多數(shù)或所有TCR共有某些通用性結(jié)構(gòu)特征(Chothia等，Embo J，(1988)，73745-55)，這種結(jié)構(gòu)特征為MHC/肽通過可變互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)結(jié)合提供適合的框架。因此，大多數(shù)TCR對(duì)MHC/肽復(fù)合物可具有固有的親和力(Chothia等，EmboJ，(1988)，73745-55)。在胸腺中，陽性選擇的只是對(duì)所呈遞的MHC分子之一(“自身”MHC分子)的親和力水平最低的TCR。陰性選擇的是對(duì)自身MHC分子之一的親和力高的T細(xì)胞(Amsen和Kruisbeek，(1998)，Immunol Rev，165209-29；Sebzda等，(1999)，Annu Rev Immunol，17829-74)。
認(rèn)為細(xì)胞免疫中的TCR與體液免疫中的抗體類似。抗體自身已成功用作治療性藥物(例如，赫賽汀(Herceptin))或作為靶向藥物(例如，mylotarg)，并且對(duì)該領(lǐng)域的興趣仍持續(xù)增長(zhǎng)?？衫肨細(xì)胞受體設(shè)計(jì)類似的方案。因此，可溶性TCR不僅可用于檢測(cè)特異性TCR-pMHC相互作用，也可用作診斷方法來檢測(cè)感染、或檢測(cè)自身免疫疾病標(biāo)記、或檢測(cè)T細(xì)胞疫苗效力?？扇苄訲CR也可用于染色，例如染色其MHC中存在特定病毒抗原的細(xì)胞。類似地，可溶性TCR可用于將治療藥物，例如細(xì)胞毒性化合物或免疫刺激化合物遞送給特定的抗原呈遞細(xì)胞。
然而，兩種因素妨礙了以此方式利用TCR。首先，迄今為止還沒有建立可溶性(即，不與膜結(jié)合的)T細(xì)胞受體的常規(guī)可應(yīng)用方法。第二，T細(xì)胞受體對(duì)其特異性pMHC配體的親和力(KD為μM范圍)遠(yuǎn)低于抗體(KD為nM范圍)。認(rèn)為TCR的這種較低親和力是發(fā)育過程中陰性選擇的結(jié)果，因此，可能無法找到對(duì)自身MHC-肽復(fù)合物具有高親和力的TCR(Salzmann和Bachmann，Molecular Immunology，1998，3565-71)。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明依據(jù)以下發(fā)現(xiàn)，即在與給定肽-MHC結(jié)合的TCR的TCRα鏈CDR2序列和/或TCRβ鏈CDR2序列中引入突變可導(dǎo)致與所述pMHC相互作用的親和力至少提高10倍和/或解離速率至少減慢10倍。由于每條α和β鏈含有3個(gè)CDR序列(CDR1、CDR2和CDR3)，只有CDR2序列的突變可導(dǎo)致TCR親和力和/或解離速率上有如此改善出乎意料。特別出乎意料的是，由于認(rèn)為CDR3區(qū)在與pMHC中肽的相互作用中起主要作用，因此曾預(yù)計(jì)CDR3序列的突變才可能是提高親和力和/或降低解離速率最有希望的方案。
發(fā)明詳述就廣義而言，本發(fā)明提供一種提高對(duì)給定靶pMHC的特異性給定TCR的親和力和/或降低其解離速率的方法，包括制備具有不同于該給定TCR的相應(yīng)CDR2序列的α鏈CDR2序列和/或β鏈CDR2序列的多種TCR，測(cè)定所述多種TCR成員對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率，選出對(duì)該靶pMHC的親和力比該給定TCR至少高10倍和/或?qū)υ摪衟MHC的解離速率比該給定TCR至少慢10倍的一個(gè)或多個(gè)成員。
本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案包括(a)制備相對(duì)于給定TCR而言，在α鏈CDR2序列而非β鏈CDR2序列中具有突變的第一批多種TCR，(b)分別制備相對(duì)于給定TCR而言，在β鏈CDR2序列而非α鏈CDR2序列中具有突變的第二批多種TCR，(c)測(cè)定所述第一和第二批多種TCR的成員對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率，選出每批中對(duì)該靶pMHC的親和力比給定TCR至少高10倍和/或?qū)υ摪衟MHC的解離速率比給定TCR至少慢10倍的一個(gè)或多個(gè)成員，(d)測(cè)定每批中所選出成員的CDR2序列，和(e)制備各具有第一批的α鏈CDR2序列和第二批的β鏈CDR2序列的一種或多種TCR，和(f)測(cè)定步驟(e)所制備的TCR對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率，選出對(duì)該靶pMHC的親和力比給定TCR至少高10倍和/或?qū)υ摪衟MHC的解離速率比給定TCR至少慢10倍的一個(gè)或多個(gè)成員。
本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案包括(a)提供編碼給定TCR的α和β鏈的核酸，(b)誘變所述核酸的α鏈CDR2序列的一個(gè)或多個(gè)密碼子和β鏈CDR2序列的一個(gè)或多個(gè)密碼子，(c)從步驟(b)的突變核酸制備相對(duì)于給定TCR而言，在α鏈CDR2序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸和β鏈CDR2序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸中具有突變的多種TCR，和(d)測(cè)定所述多種TCR的成員對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率，選出對(duì)該靶pMHC的親和力比給定TCR至少高10倍和/或?qū)υ摪衟MHC的解離速率比給定TCR至少慢10倍的一個(gè)或多個(gè)成員。
在上述實(shí)施方案的步驟(b)中，誘變所述核酸的α鏈CDR2序列中多達(dá)3個(gè)連續(xù)密碼子和β鏈CDR2序列中多達(dá)3個(gè)連續(xù)密碼子，和在步驟(c)中制備相對(duì)于給定TCR而言，在α鏈CDR2序列中具有多達(dá)3個(gè)連續(xù)密碼子和β鏈CDR2序列中具有多達(dá)3個(gè)連續(xù)密碼子突變的多種TCR。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，選出多種TCR中對(duì)靶pMHC的親和力比給定TCR至少高50倍和/或解離速率至少慢50倍的一個(gè)或多個(gè)成員。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，選出多種TCR中對(duì)靶pMHC的親和力比給定TCR至少高100倍和/或解離速率至少慢100倍的一個(gè)或多個(gè)成員。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，選出多種TCR中對(duì)靶pMHC的親和力比給定TCR至少高500倍和/或解離速率至少慢500倍的一個(gè)或多個(gè)成員。
本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案包括測(cè)定所選出TCR的CDR2序列和制備摻入經(jīng)此測(cè)定的CDR2序列的一群TCR的額外步驟。
在本

發(fā)明內(nèi)容
中，術(shù)語“與給定TCR相比，對(duì)靶pMHC的親和力至少高x倍和/或解離速率至少慢x倍的TCR”應(yīng)理解為指當(dāng)用已知方法測(cè)定時(shí)，相互作用動(dòng)力學(xué)已得到一種或兩種所述提高。
例如，當(dāng)x＝10時(shí)，如果給定TCR對(duì)靶pMHC的KD是10μM，則含突變的TCRα鏈CDR2序列和/或TCRβ鏈CDR2序列的所有選出的TCR，對(duì)靶pMHC的KD小于或等于1μM方符合此標(biāo)準(zhǔn)；當(dāng)x＝10時(shí)，如果給定TCR對(duì)靶pMHC的Koff是1×10-3S-1，則含突變的TCRα鏈CDR2序列和/或TCRβ鏈CDR2序列的所有選出的TCR，對(duì)靶pMHC的Koff小于或等于1×10-4S-1才符合此標(biāo)準(zhǔn)。
測(cè)定對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率的合適方法是通過表面等離振子共振。本文的實(shí)施例6詳細(xì)描述了如何進(jìn)行這種測(cè)定。
含有CDR2突變的多種TCR的制備以下是一些制備多種突變TCR的方法。
這些方法分為兩類(i)制備能與核蛋白結(jié)合的多種突變的TCR來形成TCR文庫(kù)，其中各TCR突變體與編碼它們的遺傳物質(zhì)之間有關(guān)，同時(shí)，這種核蛋白結(jié)合TCR文庫(kù)特別適用于淘選方法來提供文庫(kù)成員與某具體TCR配體，例如某pMHC結(jié)合能力的信息。然后對(duì)TCR文庫(kù)中用此淘選步驟選出的幾個(gè)成員進(jìn)行一系列親和力和/或解離速率評(píng)估。
(ii)制備缺乏任何結(jié)合的核蛋白的可溶性突變型TCR。這種可溶性TCR不適合于制備TCR文庫(kù)，多種這些可溶性TCR中的各成員一般需要單獨(dú)進(jìn)行親和力和/或解離速率評(píng)估。
本文所用的術(shù)語“可溶性TCR”應(yīng)理解為指具有以下特點(diǎn)的任何TCR(i)缺乏其天然跨膜結(jié)構(gòu)域和(ii)未與核蛋白結(jié)合和(iii)保留了與其同源pMHC結(jié)合的能力。
如同本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，可以利用IMGT編號(hào)系統(tǒng)通過給可變結(jié)構(gòu)域殘基編號(hào)來定位具體人TCRα鏈或人TCRβ鏈氨基酸序列中CDR2序列的位置。(《T細(xì)胞手冊(cè)》(The T Cell Factsbook)，第二版，Lefranc和LeFranc，科學(xué)出版社，2001)。利用該系統(tǒng)，TCRα鏈和β鏈的CDR2序列由包括可變結(jié)構(gòu)域殘基56-65之間存在的所有氨基酸構(gòu)成。
本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，引入TCRα鏈CDR2序列和/或TCRβ鏈CDR2序列中的突變可以是一個(gè)或多個(gè)取代、缺失或插入?？刹捎萌魏魏线m的方法產(chǎn)生這些CDR2突變，包括但不限于基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法、限制性酶切克隆或不依賴于連接反應(yīng)的克隆(LIC)方法。這些方法詳述于許多標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)教材中。關(guān)于PCR誘變和限制性酶切克隆的其它細(xì)節(jié)見(Sambrook和Russell，(2001)，《分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)，(第三版)，CSHL Press)。關(guān)于LIC方法的其它信息見(Rashtchian，(1995)，Curr Opin Biotechnol，6(1)30-6)。
提供了用于本發(fā)明的TCR的其它實(shí)施方案，其中TCRα鏈CDR2和/或TCRβCDR2鏈序列中的2個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生突變。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可通過定點(diǎn)誘變?cè)诟骺扇苄訲CR的一條或兩條CDR2序列中引入單點(diǎn)或多(點(diǎn))突變來制備用于親和力和/或解離速率評(píng)估的多種突變型TCR。
然而，這種耗時(shí)的方法不適用于制備和測(cè)試大量TCR突變體。因此，優(yōu)選基于文庫(kù)的方法來制備含有突變的α鏈CDR2序列和/或β鏈CDR2序列的多種TCR。本文提供的實(shí)施例詳細(xì)描述了制備這種文庫(kù)所需的方法。
分離含有CDR2突變的高親和力TCR的方法在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，制備可溶形式的所述多種TCR，將其連續(xù)與靶pMHC接觸來測(cè)定與其結(jié)合靶pMHC的親和力和/或解離速率，選出具有所需親和力和/或解離速率的TCR。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備多種TCR建立噬菌體展示的αβ二聚體TCR的多樣性文庫(kù)，其中多樣性體現(xiàn)在所述CDR2序列中。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，制備所述多種TCR建立核糖體展示的αβ單鏈TCR的多樣性文庫(kù)，其中多樣性至少體現(xiàn)在所述CDR2序列中。WO 2004/044004描述了在核糖體上展示單鏈TCR(scTCR)所需的方法。
所展示的TCR以下是通過與核蛋白結(jié)合來展示含有CDR2突變的TCR的優(yōu)選TCR設(shè)計(jì)。應(yīng)注意這些TCR設(shè)計(jì)同樣適合用作缺乏結(jié)合的核蛋白的可溶性TCR。
所展示的dTCR在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所展示的αβ二聚體TCR含有的第一多肽的序列對(duì)應(yīng)于TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域序列(此序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列的N末端相融合)和含有的第二多肽的序列對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變結(jié)構(gòu)域序列(此序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列的N末端相融合)，該第一和第二多肽通過在天然αβT細(xì)胞受體中無等價(jià)物的二硫鍵相連，其中所述第一或第二多肽之一在其C-末端通過肽鍵與核蛋白(通常是噬菌體顆粒)的表面暴露的氨基酸殘基相連。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，該第一和第二TCR多肽通過取代TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基或其非人等價(jià)物之間的二硫鍵相連，所述第一或第二多肽之一在其C-末端通過肽鍵與噬菌體顆粒的表面暴露氨基酸殘基相連。
為形成非天然的鏈間二硫鍵，采用ImMunoGeneTics(IMGT)命名法來鑒定可突變?yōu)榘腚装彼岬臍埢?《T細(xì)胞受體手冊(cè)》(The T cell Receptor Factsbook)，第二版，(2001)，LeFranc和Lefranc，科學(xué)出版社)。WO 03/020763詳細(xì)描述了引入所述非天然的鏈間二硫鍵所需的方法和其間可存在二硫鍵的其它殘基。
所展示的scTCR在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所展示的αβscTCR多肽可以(例如)含有由對(duì)應(yīng)于TCRα可變結(jié)構(gòu)域序列的氨基酸序列構(gòu)成的第一區(qū)段，所述氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列的氨基酸序列N末端融合，由對(duì)應(yīng)于TCRβ可變結(jié)構(gòu)域序列的氨基酸序列構(gòu)成的第二區(qū)段，所述氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列的氨基酸序列N末端融合，
連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端(或反之亦然)的接頭序列，和該第一和第二鏈之間的二硫鍵，所述二硫鍵在天然αβT細(xì)胞受體中沒有等價(jià)物，該接頭序列的長(zhǎng)度和該二硫鍵的位置應(yīng)使該第一和第二區(qū)段的可變結(jié)構(gòu)域序列的相互定向基本上如同天然αβT細(xì)胞受體的。
或者，所展示的scTCR可含有由對(duì)應(yīng)于TCRα可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列構(gòu)成的第一區(qū)段，由對(duì)應(yīng)于TCRβ可變結(jié)構(gòu)域序列的氨基酸序列構(gòu)成的第二區(qū)段，所述氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列的氨基酸序列N末端相融合，和連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端的接頭序列，或可含有由對(duì)應(yīng)于TCRβ可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列構(gòu)成的第一區(qū)段，由對(duì)應(yīng)于TCRα可變結(jié)構(gòu)域序列的氨基酸序列構(gòu)成的第二區(qū)段，所述氨基酸序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列的氨基酸序列N末端相融合，和連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端的接頭序列。
dTCR多肽對(duì)和scTCR多肽如同可變結(jié)構(gòu)域，所展示scTCR或dTCR中存在的恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列優(yōu)選對(duì)應(yīng)于人TCR的那些。然而，這種序列之間的氨基酸水平相符一致性無需是1∶1。相對(duì)于相應(yīng)的人TCR序列的N-或C-截短，和/或氨基酸缺失和/或取代是可接受的。具體地說，因?yàn)樵摰谝缓偷诙^(qū)段中存在的恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列不直接參與和scTCR或dTCR結(jié)合的配體接觸，它們可比天然TCR的胞外恒定結(jié)構(gòu)域序列更短，或者含有取代或缺失。
存在于所展示dTCR多肽對(duì)，或所展示scTCR多肽第一區(qū)段中的恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列可含有對(duì)應(yīng)于TCRα鏈的胞外恒定Ig結(jié)構(gòu)域的序列，和/或存在于該多肽對(duì)另一成員中或第二區(qū)段中的恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列可含有對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈胞外恒定Ig結(jié)構(gòu)域的序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所展示dTCR多肽對(duì)的成員之一或者所展示scTCR多肽的第一區(qū)段對(duì)應(yīng)于TCRα鏈的基本上所有可變結(jié)構(gòu)域，所述可變結(jié)構(gòu)域與TCRα鏈恒定結(jié)構(gòu)域基本上所有胞外結(jié)構(gòu)域N末端相融合；和/或該多肽對(duì)的另一成員或者第二區(qū)段對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈的基本上所有可變結(jié)構(gòu)域，所述可變結(jié)構(gòu)域與TCRβ鏈恒定結(jié)構(gòu)域的基本上所有胞外結(jié)構(gòu)域N末端相融合。
在另一實(shí)施方案中，所展示dTCR多肽對(duì)，或所展示scTCR多肽的第一和第二區(qū)段中存在的恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列對(duì)應(yīng)于天然TCR的α鏈和β鏈的恒定結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在C末端截短從而除去了形成TCR的天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基?；蛘哂昧硪话被釟埢?，例如絲氨酸或丙氨酸取代那些半胱氨酸殘基，從而刪除了天然二硫鍵。此外，天然TCRβ鏈含有未配對(duì)的半胱氨酸殘基，可以從本發(fā)明scTCR的β序列中刪除該殘基，或用非半胱氨酸殘基取代。
在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，所展示dTCR多肽對(duì)中，或者所展示scTCR多肽的第一和第二區(qū)段中存在的TCRα和β鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可一起對(duì)應(yīng)于第一種TCR的功能性可變結(jié)構(gòu)域，而dTCR多肽對(duì)中，或者scTCR多肽的第一和第二區(qū)段中存在的TCRα和β鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列可對(duì)應(yīng)于第二種TCR的那些，所述第一和第二種TCR來自同一物種。因此，dTCR多肽對(duì)中，或者scTCR多肽的第一和第二區(qū)段中存在的α和β鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可對(duì)應(yīng)于第一種人TCR的那些序列，α和β鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列可對(duì)應(yīng)于第二種人TCR的那些序列。例如，A6 Tax sTCR恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列可用作框架，在其上融合異源α和β可變結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，所展示dTCR多肽對(duì)中，或者所展示scTCR多肽的第一和第二區(qū)段中存在的TCRα和β鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可一起對(duì)應(yīng)于第一種人TCR的功能性可變結(jié)構(gòu)域，而dTCR多肽對(duì)中，或者scTCR多肽的第一和第二區(qū)段中存在的TCRα和β鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列可對(duì)應(yīng)于第二種非人TCR的那些序列。因此，dTCR多肽對(duì)中，或者scTCR多肽的第一和第二區(qū)段中存在的α和β鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可對(duì)應(yīng)于第一種人TCR的那些序列，α和β鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列可對(duì)應(yīng)于第二種非人TCR的那些序列。例如，小鼠TCR恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列可用作框架，在其上融合異源人α和β可變結(jié)構(gòu)域。
scTCR多肽中的接頭為展示scTCR，接頭序列將第一和第二TCR區(qū)段連接成一條多肽鏈。接頭序列可以如式-P-AA-P-所示，其中P是脯氨酸和AA表示其中的氨基酸是甘氨酸和絲氨酸的氨基酸序列。
為使scTCR與配體(在αβTCR的情況中是MHC-肽復(fù)合物)結(jié)合，所述第一和第二區(qū)段配對(duì)從而使其可變結(jié)構(gòu)域序列的取向有利于這種結(jié)合。因此，接頭應(yīng)足夠長(zhǎng)可跨越第一區(qū)段C末端和第二區(qū)段N末端，或反之亦然。另一方面，應(yīng)避免接頭過長(zhǎng)，以防接頭N末端可變結(jié)構(gòu)域序列的一端阻斷或降低scTCR與靶配體的鍵合。
例如，當(dāng)?shù)谝缓偷诙^(qū)段中存在的恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列對(duì)應(yīng)于在C末端截短的天然TCR的α和β鏈恒定結(jié)構(gòu)域，除去了形成TCR的天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基時(shí)，該接頭序列連接了第一區(qū)段的C末端和第二區(qū)段的N末端。
接頭序列可由，例如26-41個(gè)氨基酸，優(yōu)選29、30、31或32個(gè)氨基酸，或33、34、35或36個(gè)氨基酸組成。具體的接頭如式-PGGG-(SGGGG)5-P-(SEQ ID NO1)和-PGGG-(SGGGG)6-P-(SEQ ID NO2)所示，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是絲氨酸。
鏈間二硫鍵本發(fā)明的dTCR和scTCR可以在dTCR多肽對(duì)或scTCR多肽的第一和第二區(qū)段恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列之間具有熒光二硫鍵。該鍵位于專門摻入dTCR多肽對(duì)或scTCR多肽第一和第二區(qū)段恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列中的半胱氨酸之間，可對(duì)應(yīng)于天然二聚體αβTCR中存在的天然鏈間二硫鍵，或者可以在天然TCR中沒有相應(yīng)部分。在一些情況中，可能需要天然和非天然二硫鍵。
如上所述，WO 03/020763詳細(xì)描述了引入所述非天然鏈間二硫鍵和其間可存在二硫鍵的其它殘基所需的方法。
以下核酸是制備突變TCR(dTCR對(duì)或scTCR)文庫(kù)所需(a)編碼dTCR多肽對(duì)一條鏈的核酸和(b)編碼dTCR多肽對(duì)另一條鏈的核酸，其與編碼能形成核蛋白顆粒一部分表面的蛋白質(zhì)的核酸序列融合；或編碼scTCR多肽的核酸，其與編碼能形成核蛋白顆粒一部分表面的蛋白質(zhì)的核酸序列融合。
為表達(dá)TCR(dTCR對(duì)或scTCR)，可用含有以下核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，(a)編碼dTCR多肽對(duì)一條鏈的核酸和(b)編碼dTCR多肽對(duì)另一條鏈的核酸，其與編碼能形成核蛋白顆粒一部分表面的蛋白質(zhì)的核酸序列融合；或編碼scTCR多肽的核酸，其與編碼能形成核蛋白顆粒一部分表面的蛋白質(zhì)的核酸序列融合。
表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選包括能表達(dá)核酸(a)和(b)的噬菌?；蚴删w基因組載體。這些噬菌?；蚴删w基因組載體優(yōu)選是編碼細(xì)菌噬菌體gIII或gVIII外被蛋白的那些載體。
培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)展示TCR的核蛋白顆粒。然后可將這些顆粒用于試驗(yàn)來鑒定具有所需親和力和/或解離速率特征的TCR變體。然后分離檢測(cè)中具有所需特征的任何顆粒。再通過PCR擴(kuò)增編碼這些TCR的DNA并測(cè)序。
已知外源性多肽的高水平表達(dá)可能對(duì)宿主細(xì)胞有毒。在這些情況中，必須找到對(duì)該外源性多肽更耐受的宿主菌株，或者必須將宿主細(xì)胞的表達(dá)限制于可耐受的水平。例如(Beekwilder等，(1999)，Gene，228(1-2)23-31)報(bào)道了從噬菌體展示文庫(kù)中成功地選出含有缺失或琥珀終止密碼子的馬鈴薯蛋白酶抑制劑(PI2)的唯一突變形式。
限制宿主給定表達(dá)系統(tǒng)對(duì)外源性多肽的表達(dá)水平有幾種方法，這些方法可能適用于限制scTCR或dTCR的一條或兩條TCR鏈的表達(dá)水平。WO 2004/044004描述了這些方法。
宜通過在scTCR的胞外恒定結(jié)構(gòu)域中引入二硫鍵來幫助scTCR多肽可變結(jié)構(gòu)域序列在表達(dá)后的正確配對(duì)。不想受理論的束縛，據(jù)信，此新的二硫鍵在折疊過程中為scTCR提供了額外的穩(wěn)定性，從而有助于第一和第二區(qū)段的正確配對(duì)。
也如上所述，就dTCR噬菌體展示而言，如同最終作為單體多肽展示在噬菌體上那樣，dTCR多肽對(duì)的一條得到表達(dá)，而該dTCR多肽對(duì)的另一條同時(shí)表達(dá)在同一宿主細(xì)胞中表達(dá)。因?yàn)槭删w顆?？勺晕已b配，該兩條多肽自我結(jié)合在噬菌體上展示為二聚體。此外，在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，恒定序列之間的二硫鍵有助于多肽對(duì)在結(jié)合時(shí)的正確折疊。具有鏈間二硫鍵dTCR的噬菌體展示方法的其它細(xì)節(jié)見WO 2004/044004中的實(shí)施例。
作為另一方法，可首先表達(dá)展示dTCR第一鏈的噬菌體，第二鏈多肽可在隨后步驟中與所表達(dá)的噬菌體接觸從而在噬菌體表面結(jié)合成為功能性dTCR。
生物淘選來鑒定含有對(duì)靶肽-MHC復(fù)合物具有高親和力和/或慢解離速率突變CDR2序列的TCR的優(yōu)選體外TCR展示方法是核糖體展示法。首先，利用上述技術(shù)構(gòu)建編碼突變scTCR或dTCR多肽的多樣性陣列的DNA文庫(kù)。然后使該DNA文庫(kù)與RNA聚合酶接觸以產(chǎn)生互補(bǔ)的mRNA文庫(kù)。就mRNA展示技術(shù)而言，然后可任選將mRNA序列與含有嘌呤霉素結(jié)合位點(diǎn)的DNA序列相連。在可以翻譯scTCR多肽或dTCR對(duì)第一多肽的條件下使這些遺傳構(gòu)建物在體外與核糖體接觸。就dTCR而言，為結(jié)合兩條多肽(優(yōu)選在恒定結(jié)構(gòu)域之間形成的二硫鍵的幫助下)，分別表達(dá)該多肽對(duì)的第二多肽并使之與核糖體展示的第一多肽接觸?；蛘?，可使編碼TCR兩條鏈的mRNA在翻譯TCR鏈的條件下體外與核糖體接觸從而形成展示dTCR的核糖體。然后可利用這些展示scTCR或dTCR的核糖體來篩選或在試驗(yàn)中鑒定具有特定改進(jìn)特征的TCR變體。再分離檢測(cè)中具有改進(jìn)特征的任何顆粒。然后用逆轉(zhuǎn)錄酶將編碼這些TCR的mRNA轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)的DNA序列。再用PCR擴(kuò)增編碼該DNA并測(cè)序。
本發(fā)明的scTCR或dTCR可通過，例如以下兩種方法展示在核蛋白顆粒上，例如噬菌體顆粒，優(yōu)選絲狀噬菌體顆粒上(i)可將dTCR多肽對(duì)的一條的C-末端、或scTCR多肽的C-末端或連接兩條肽之一C-末端的短肽接頭的C-末端通過肽鍵直接連接于核蛋白顆粒的表面暴露殘基。例如，所述表面暴露殘基優(yōu)選位于細(xì)菌噬菌體基因III或基因VIII的基因產(chǎn)物的N-末端；和(ii)可經(jīng)引入的半胱氨酸殘基將dTCR多肽對(duì)一條的C-末端、或scTCR多肽的C-末端或連接兩條肽之一C-末端的短肽接頭的C-末端通過二硫鍵連接于核蛋白顆粒的表面暴露半胱氨酸殘基。例如，所述表面暴露殘基仍優(yōu)選位于細(xì)菌噬菌體基因III或基因VIII的基因產(chǎn)物的N-末端。
M13和f1是表達(dá)基因III和基因VPPP基因產(chǎn)物的細(xì)菌噬菌體的例子。
優(yōu)選以上方法(i)。就scTCR而言，可將編碼TCR的核酸與編碼形成顆粒的蛋白質(zhì)或可復(fù)制顆粒，例如噬菌體或細(xì)胞的表面蛋白質(zhì)的核酸融合。或者，可通過核糖體翻譯代表mRNA但不含終止密碼子的核酸，或與嘌呤霉素RNA融合的核酸，從而使TCR保持與核糖體顆粒融合。就dTCR而言，可將編碼TCR一條鏈的核酸與編碼形成顆粒的蛋白質(zhì)或可復(fù)制顆粒，例如噬菌體或細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白的核酸融合，和使TCR多肽對(duì)第二條鏈與得到的展示第一鏈的表達(dá)顆粒結(jié)合。兩條鏈的恒定結(jié)構(gòu)域中存在能形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸可能有助于此二鏈的正確功能性結(jié)合，下文將更全面地討論。
分離對(duì)其同源配體親和力提高的TCR變體為測(cè)定文庫(kù)成員與靶pMHC結(jié)合的親和力和/或解離速率并選擇具有所需親和力和/或解離速率的成員，以下方法提供了本發(fā)明的具體實(shí)施方案(i)使該文庫(kù)的幾種成員同時(shí)與靶pMHC接觸，和鑒定能與該pMHC結(jié)合的成員，(ii)使步驟(i)所鑒定的成員連續(xù)與靶pMHC接觸，評(píng)估它們對(duì)該pMHC的親和力，(iii)選擇步驟(ii)中測(cè)定的具有所需親和力的一種或多種成員，測(cè)定所展示TCR的CDR2序列，(iv)制備摻有如此測(cè)定的CDR2序列的可溶形式TCR，(vi)如情況可能再次測(cè)定和/或測(cè)定這些TCR對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率，和(vii)選擇步驟(vi)所測(cè)定的具有所需親和力和/或解離速率的一種或多種TCR。
其它方面本發(fā)明方法所分離的scTCR或dTCR(優(yōu)選由對(duì)應(yīng)于人序列的恒定和可變序列組成)可以基本純的形式，或作為純化的或分離的制劑提供。例如，可以基本上不含其它蛋白質(zhì)的形式提供。
本發(fā)明也提供獲得通過本發(fā)明方法選擇的TCR的鏈的方法，該方法包括在能表達(dá)該鏈的條件下培養(yǎng)含編碼該鏈核酸的宿主細(xì)胞，再純化所述多肽鏈。然后如實(shí)施例5所述通過重折疊純化的α和β來形成dTCR。
本發(fā)明各方面的優(yōu)選特征與已作必要改動(dòng)的其它各方面的一樣。按照法律允許本文提及的現(xiàn)有技術(shù)文件全文納入。
實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
下文參考了以下附圖，其中

圖1a和2b分別顯示了1G4 TCR的α和β鏈的DNA序列。每條鏈具有編碼半胱氨酸殘基的突變密碼子。陰影部分表示這些突變密碼子的位置。
圖2a和2b分別顯示了圖1a和1b的DNA序列所編碼的氨基酸序列。陰影部分表示這些引入的半胱氨酸殘基的位置。
圖3詳細(xì)描述了噬菌粒質(zhì)粒pEX746NY-ESO的全部DNA序列。
圖4詳細(xì)描述了pEX922-1G4質(zhì)粒的DNA序列。
圖5詳細(xì)描述了pEX821質(zhì)粒的DNA序列。
圖6詳細(xì)描述了pEX954質(zhì)粒的DNA序列。
圖7a和7b分別顯示了經(jīng)突變而含有其它半胱氨酸殘基可以形成非天然二硫鍵的ILA TCRα和β鏈可溶形式的DNA序列。陰影部分表示突變的密碼子。
圖8a和8b分別顯示了從圖7a和7b的DNA序列產(chǎn)生的ILA TCRα和β鏈胞外氨基酸序列。陰影部分表示引入的半胱氨酸。
圖9a和9b分別顯示了經(jīng)突變而含有其它半胱氨酸殘基可形成非天然二硫鍵的HIV Gag TCRα和β鏈可溶形式的DNA序列。陰影部分表示突變的密碼子。
圖10a和10b分別顯示了從圖4a和4b的DNA序列產(chǎn)生的HIV Gag TCRα和β鏈胞外氨基酸序列。陰影部分表示引入的半胱氨酸。
實(shí)施例1-1G4 CDR2文庫(kù)構(gòu)建為得到含有對(duì)SLLMWITQC(SEQ ID NO3)-HLA-A*0201復(fù)合物結(jié)合親和力提高和/或?qū)υ損MHC解離速率降低的變體的兩種TCR文庫(kù)，在1G4 TCR鏈的CDR2α和CDR2β序列中分別引入多點(diǎn)突變。
采用PCR擴(kuò)增利用誘變的寡核苷酸(Jon342和Jon344)作為正向引物和下游完全互補(bǔ)的寡核苷酸作為反向引物，得到每種CDR2序列高度多樣性突變體群來產(chǎn)生突變片段群。就CDR2α而言，隨機(jī)突變了核心殘基的3個(gè)(Jon342)，而對(duì)CDR2β而言，隨機(jī)突變了4個(gè)殘基(Jon344)。
為在隨后的文庫(kù)構(gòu)建中引入方便的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將得到的兩種誘變的PCR片段各自連接到-附加片段上，該附加片段含有與該誘變寡核苷酸5’區(qū)域具有重疊互補(bǔ)性的TCR開放讀框的毗鄰部分。這種稱為通過重疊延伸剪接(SOE)的剪接反應(yīng)采用合適的側(cè)翼正向和反向引物對(duì)在第二次PCR反應(yīng)中進(jìn)行。
PCR1-產(chǎn)生誘變的CDR2α片段38.5μl水，5μl 10×PCR緩沖液，1.5μl Jon342引物(10μM儲(chǔ)備液)，1.5μlCDR1bRev引物(10μM儲(chǔ)備液)，2.5ng含有1G4 TCRα和β鏈(pEX746NY-ESO)的模板載體，2ul dNTP(20mM混合儲(chǔ)備液)，1μl pfu turbo聚合酶。PCR反應(yīng)經(jīng)2分鐘95度初始變性，然后95度30秒、53度30秒和72度60秒，共進(jìn)行30輪。包括72度10分鐘的最后延伸步驟。將總共50μl的PCR反應(yīng)液在1.4％TBE瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分辨，切下代表誘變產(chǎn)物的條帶，按照生產(chǎn)商的使用說明用Qiagen MinElute試劑盒純化。
圖1和1b分別顯示了1G4 TCR的α和β鏈的DNA序列。每條鏈具有編碼半胱氨酸殘基的突變密碼子。陰影部分表示這些突變密碼子的位置。
圖2a和2b分別顯示了圖1a和1b的DNA序列所編碼的氨基酸序列。陰影部分表示這些引入的半胱氨酸殘基的位置。
圖3詳細(xì)描述了pEX746NY-ESO質(zhì)粒的DNA序列。
PCR2-產(chǎn)生誘變的CDR2β片段如上所述，除了引物替換為Jon344和Yol22。
PCR3-產(chǎn)生CDR2α突變的重疊片段如上所述，除了引物替換為Yol13和CDR2aRev。
PCR4-產(chǎn)生CDR2β突變的重疊片段如上所述，除了引物替換為CDR2aFw和CDR2bRev。
PCR5-產(chǎn)生剪接的PCR1/PCR3 CDR2α誘變片段PCR1和PCR3的純化的模板片段用水作1∶10稀釋，將每份1μl混合入也含有以下成分的50μl PCR反應(yīng)液中37μl水、5μl 10×PCR緩沖液、1.5μl Yol13引物(10μM儲(chǔ)備液)、1.5μl cdr1bRev引物(10μM儲(chǔ)備液)、2ul dNTP(20mM混合儲(chǔ)備液)、1μl pfu turbo聚合酶。剪接PCR反應(yīng)經(jīng)2分鐘95℃初始變性，然后95℃30秒、54℃40秒和72℃90秒，共進(jìn)行27輪。包括72℃10分鐘的最后延伸步驟。進(jìn)行12次相同的PCR反應(yīng)。合并12份PCR反應(yīng)液，按照生產(chǎn)商的使用說明用Qiagen Qiaquick試劑盒純化剪接的誘變產(chǎn)物。
PCR6-產(chǎn)生剪接的PCR2/PCR4 CDR2β誘變片段
如上所述，除了替換為PCR2和PCR4。
用NcoI和BssHII消化PCR5的誘變產(chǎn)物并連接入也用NcoI和BssHII消化、含有母體1G4 TCR開放讀框的pEX922-1G4噬菌體展示載體中(圖4詳細(xì)描述了該質(zhì)粒的DNA序列)，從而導(dǎo)致親代CDR2α序列基序取代了大量的多樣性突變體序列群。對(duì)PCR6(的產(chǎn)物)進(jìn)行同樣操作，從而用親代序列取代了大量的多樣性CDR2β突變體序列群。然而，此時(shí)所用的克隆酶是BssHII和NotI。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法，用T4 DNA連接酶以插入物與載體之比為3∶1進(jìn)行連接。
濃縮和在Qiagen MinElute柱上脫鹽后，將連接的CDR2α和CDR2β突變體混合物分別用電穿孔導(dǎo)入TG1細(xì)胞中。
按照細(xì)胞的商業(yè)供應(yīng)商(Stratagene)所提供的方案，采用每50μl電感受態(tài)細(xì)胞約300ng DNA的比例進(jìn)行電穿孔。對(duì)兩種文庫(kù)各進(jìn)行兩次電穿孔。電穿孔后，將細(xì)胞重懸在含950μl預(yù)熱(37℃)的SOC培養(yǎng)基的比色皿中使之再生，在50ml無菌試管中輕柔攪拌40分鐘使之恢復(fù)。隨后，將1ml恢復(fù)的細(xì)胞加入裝有含100μg/ml氨芐西林和1.6％葡萄糖的50ml 2TY培養(yǎng)基中(每升16g Bacto-胰蛋白胨、10gBacto-酵母提取物、5g NaCl)(2TYAG)的無菌搖瓶中，即每種文庫(kù)兩個(gè)搖瓶。搖瓶在37℃以280rpm振蕩5小時(shí)后培養(yǎng)液的OD600達(dá)到1-1.5。離心收集細(xì)胞，重懸于4ml/文庫(kù)的2TY+20％甘油中。等份試樣(250μl)在干冰上冷凍保存于-80℃。
引物Jon3425’-GTCTCACATCTCTGTTGCTTATTNNKNNKNNKCAGAGAGAGCAAACAAGTGGAAG-3’(SEQ ID NO4)Jon344 5’-GCTGAGGCTGATTCATTACTCANNKNNKNNKNNKATCACTGACCAAGGAGAAGTCC-3’(SEQ ID NO5)CDR2aRev 5’-AATAAGCAACAGAGATGTGAGAC-3’(SEQ ID NO6)CDR2aFw 5’-CAGAGAGAGCAAACAAGTGGAAG-3’(SEQ ID NO7)CDR2bRev 5’-TGAGTAATGAATCAGCCTCAGC-3’(SEQ ID NO8)CDR1bRev 5’-CATATCCTGGGCACACTGCAG-3’(SEQ ID NO9)Yol13 5’-TCACACAGGAAACAGCTATG-3’(SEQ ID NO10)Yol22 5’-CATTTTCAGGGATAGCAAGC-3’(SEQ ID NO11)其中
N＝A、T、G或CK＝G或T實(shí)施例2-分離含有突變CDR2序列的高親和力1G4 TCR從含有如實(shí)施例1所述構(gòu)建的兩種文庫(kù)混合物的噬菌體顆粒群中分離含有突變CDR2序列的高親和力1G4 TCR。如下，利用選擇展示能結(jié)合溶液中SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物的突變型1G4 TCR的噬菌體顆粒來進(jìn)行初步淘選按照生產(chǎn)商的方案，預(yù)先洗滌鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁珠(Dynal M280)。為進(jìn)行所有三輪選擇，將濃度為1012到1013cfu的展示突變1G4 TCR的噬菌體顆粒與濃度為1×10-7M的生物素化SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物預(yù)先混合。將展示1G4 TCR的噬菌體顆粒和SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物的混合物在溫輕柔攪動(dòng)溫育1小時(shí)，用100μl鏈霉抗生物素蛋白包被的M280磁珠捕獲與生物素化SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物結(jié)合的展示1G4 TCR的噬菌體顆粒，共進(jìn)行3輪(選擇)。噬菌體顆粒捕獲后，用Dynal磁性顆粒濃縮器共洗滌珠6次(3次用PBS吐溫20，3次用PBS)。根據(jù)已建立的方法，在最后一次洗滌后，將珠重懸在100μl新鮮制備的PBS中，使用50μl重懸珠感染新鮮制備的OD(600nm)＝0.5的10ml大腸桿菌TG1來擴(kuò)增選出的噬菌體顆粒。
第三輪選擇后，從板上挑出300個(gè)菌落接種于96-孔微滴定板中的100μl2TYAG中。30℃振蕩過夜溫育培養(yǎng)液。然后將2到5μl過夜培養(yǎng)液亞接種于100μl的2TYAG中，30℃振蕩溫育2到3小時(shí)或直至培養(yǎng)液變混濁。為用輔助噬菌體感染該細(xì)胞，用含有5×109pfu輔助噬菌體的100μl 2TYAG感染培養(yǎng)物，37℃溫育60分鐘。將5μl受感染的培養(yǎng)物加入200μl的2TYAG(TYAG+100μg/ml氨芐西林和50μg/ml卡那霉素)中。25℃以300rpm振蕩溫育這些板20-36小時(shí)。4℃，3000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞。如下通過噬菌體ELISA利用上清液來篩選高親和力1G4 TCR突變體。
實(shí)施例3-用基礎(chǔ)和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA分析展示在噬菌體顆粒上的天然和突變二硫鍵連接的CDR2突變型TCR的結(jié)合性能利用展示在噬菌體顆粒上的二硫鍵連接的天然1G4 TCR和含有突變CDR2序列的1G4 TCR進(jìn)行以下基礎(chǔ)ELISA測(cè)定來評(píng)估這些分子對(duì)SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物的親和力用PBS淋洗用中性親和素(Neutravidin)包被的Nunc-Immuno Maxisorp孔(板)。向每孔中加入25μl 5μg/ml生物素化SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物，室溫培育30-60分鐘，然后用PBS淋洗兩次。加入PBS配制的300μl 3％脫脂奶，然后室溫培育2小時(shí)以封閉孔中非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。為制備展示按實(shí)施例2所述產(chǎn)生的突變型1G4 TCR的噬菌體顆粒，將這些噬菌體顆粒與PBS配制的3％脫脂奶混合，然后室溫培育1小時(shí)。將噬菌體加入用SLLMWITQC-HLA-A*0201包被的孔，室溫培育1小時(shí)，然后用含0.1％吐溫20的PBS洗滌3次，再用PBS洗滌3次。在用第一抗-fd多克隆抗血清然后用和堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗-兔單克隆抗體(Sigma)的兩步反應(yīng)中檢測(cè)所結(jié)合的展示TCR的噬菌體顆粒。
然后測(cè)定噬菌體所展示的在該基礎(chǔ)ELISA測(cè)定中與SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物結(jié)合的TCR來特征鑒定CDR2突變的性質(zhì)。對(duì)感興趣的噬菌粒克隆進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定來提供這些TCR對(duì)SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物親和力的進(jìn)一步信息。
競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定精確按照上述基礎(chǔ)ELISA測(cè)定進(jìn)行，除了為制備展示突變型1G4 TCR的噬菌體顆粒，將噬菌體顆粒與PBS配制的3％脫脂奶與100μl或200μl可溶性SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物混合，然后室溫培育1小時(shí)。
對(duì)給定加入的可溶性SLLMWITQC-HLA-A*0201的結(jié)合抑制程度與TCR對(duì)SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物的親和力成比例。
結(jié)果下表詳細(xì)描述了從本實(shí)施例所述3輪淘選中得到的20個(gè)基礎(chǔ)ELISA-陽性選中物(hit)的CDR2序列。

*-該CDR2α序列中的突變谷氨酰胺由表達(dá)谷氨酰胺的琥珀密碼子編碼。
下表詳細(xì)描述了用基礎(chǔ)ELISA鑒定噬菌體所展示的WT和優(yōu)勢(shì)突變型1G4TCR所獲得的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA數(shù)據(jù)。除了在CDR2序列之一具有突變外，該突變型1G4 TCR還含有天然的可變結(jié)構(gòu)域序列。

實(shí)施例4-利用分離的感興趣CDR2選中物的第二代文庫(kù)使實(shí)施例3競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定特征鑒定的，編碼在CDR2α或CDR2α序列中含有突變的高親和力1G4 TCR的3個(gè)噬菌?？寺∵M(jìn)一步突變。利用這些克隆作為構(gòu)建第二代文庫(kù)的起始模板來進(jìn)行該突變。用實(shí)施例1所述PCR方法使每個(gè)克隆中的WT CDR2序列突變來構(gòu)建這些文庫(kù)。
從含有如上所述構(gòu)建的3種文庫(kù)的混合物的噬菌體顆粒群中分離出含有雙重突變的CDR2序列的高親和力1G4 TCR。進(jìn)行3輪如實(shí)施例2所述的淘選，除了所用的生物素化SLLMWITQC-HLA-A*0201的濃度是1×10-8M外。
如實(shí)施例3所述鑒定并特征分析選中物。
結(jié)果下表詳細(xì)描述了從本實(shí)施例所述第二代3輪淘選中得到的20個(gè)基礎(chǔ)ELISA-陽性選中物(hit)的序列。


發(fā)現(xiàn)該ELISA測(cè)定所鑒定的所有CDR2α突變體含有SVSVGM CDR2β序列。
*-這些CDR2α序列的5種中突變谷氨酰胺由表達(dá)谷氨酰胺殘基的琥珀密碼子編碼。
**-兩種這些CDR2α序列中的突變谷氨酰胺由表達(dá)谷氨酰胺殘基的琥珀密碼子編碼。
A-表示與從實(shí)施例1-3所述第一代實(shí)驗(yàn)中回收的那些序列之一完全匹配的1G4 TCR序列。
下表詳細(xì)描述了獲得噬菌體所展示的WT和雙重突變型1G4 TCR的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA數(shù)據(jù)。除了在兩條CDR2序列中具有突變外，該突變型1G4 TCR還含有天然的可變結(jié)構(gòu)域序列。


實(shí)施例5-產(chǎn)生含有噬菌粒的突變CDR2序列的高親和力二硫鍵連接的可溶性1G4 TCR用Mini-Prep試劑盒(Qiagen，UK)從相關(guān)的大腸桿菌細(xì)胞中分離得到按實(shí)施例3所述鑒定到的編碼高親和力1G4 TCR突變體的噬菌粒DNA。
利用噬菌粒DNA作為模板和以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增來擴(kuò)增可溶性TCRα和β鏈DNA序列。
1G4 TCRα正向引物TRAV215-GCCGGCCATGGCCAAACAGGAGGTGACGCAGATTCCT-3(下劃線處是ClaI限制性內(nèi)切位點(diǎn))(SEQ ID NO22)通用TCRα反向引物5-TTG TCAGTC GACTTA GAG TCT CTC AGC TGG TAC ACG-3(下劃線處是SalI限制性內(nèi)切位點(diǎn))(SEQ ID NO23)1G4 TCRβ鏈正向引物TRBV6-1/2/3/5/6/7/8/95-TCACAGCGCGCAGGCTGGTGTCACTCAGACCCCAAA-3(下劃線處是AseI限制性內(nèi)切位點(diǎn))(SEQ ID NO24)通用β鏈反向引物5-tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc-3(下劃線處是AgeI限制性內(nèi)切位點(diǎn))(SEQ ID NO25)
采用以下條件進(jìn)行PCR50ng質(zhì)粒模板，1μl的10mM dNTP，5μl的10×pfu-緩沖液，25pmol的正向引物，25pmol的反向引物，1μl pfu，總體積50μl。2分鐘95℃初始變性步驟后，對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行25輪變性(95℃、10秒)、退火(55℃、10秒)和延伸(72℃、2分鐘)。
然后，為產(chǎn)生高親和力1G4 TCR的二硫鍵接頭物，用Agel/Asel消化β鏈PCR產(chǎn)物并克隆入用Nde/Agel切割的pEX821中(圖5詳細(xì)描述了該質(zhì)粒的DNA序列)。用ClaI/SalI消化α鏈PCR產(chǎn)物并克隆入用ClaI/XhoI切割的pEX954中(圖6詳細(xì)描述了該質(zhì)粒的DNA序列)。自動(dòng)測(cè)序證實(shí)了該突變的可溶性1G4 TCRα和β鏈的DNA序列。
實(shí)施例6-可溶性TCR的表達(dá)、重折疊和純化將含有分別如實(shí)施例5制備的TCRα鏈和β鏈的表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BL 12pLysS，取氨芐西林抗性單個(gè)菌落37℃在TYP(氨芐西林100μg/ml)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至OD600為0.4，然后用0.5mM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)3小時(shí)后用Beckman J-6B(轉(zhuǎn)頭)4000rpm離心30分鐘收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重懸于含有50mM Tris-HCI、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、10mM DTT，pH 8.0的緩沖液中。凍融過夜后，在Milsonix XL2020超聲波儀中用標(biāo)準(zhǔn)的12mm直徑探頭對(duì)重懸細(xì)胞進(jìn)行1分鐘超聲裂解，共約10分鐘。在Beckman J2-21離心機(jī)中以13000rpm離心30分鐘回收包涵體沉淀。然后用洗滌劑洗滌3次以除去細(xì)胞碎片和膜組分。在Beckman J2-21中以13000rpm離心15分鐘，每次在Triton緩沖液(50mM Tris-HCI、0.5％Triton-X100、200mM NaCI、10mMNaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、2mM DTT，pH 8.0)中勻漿后沉淀包涵體。然后用以下緩沖液進(jìn)行類似的洗滌除去洗滌劑和鹽50mM Tris-HCl、1mMNaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、2mM DTT，pH 8.0。最后，將包涵體分為30mg等份試樣，于-70℃冷凍。用6M鹽酸胍溶解并用Bradford染料結(jié)合試驗(yàn)(PerBio)測(cè)定來定量包涵體蛋白的產(chǎn)量。
將含約30mg TCRβ鏈和60mg TCRα鏈的溶解包涵體冷凍儲(chǔ)備物融解，然后混合樣品，將混合物稀釋入15ml胍溶液(6M鹽酸胍、10mM乙酸鈉、10mMEDTA)中以保證鏈完全變性。然后將含有完全還原及變性的TCR鏈的胍溶液注入1升以下重折疊緩沖液中100mM Tris pH 8.5，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5mM還原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷胱甘肽，5M脲，0.2mM PMSF。加入氧化還原對(duì)(2-巰基乙胺和胱胺(至終濃度分別為6.6mM和3.7mM))，約5分鐘后加入變性的TCR鏈。溶液放置5小時(shí)±15分鐘。將重折疊的TCR經(jīng)Spectrapor 1膜(Spectrum；產(chǎn)品號(hào).132670)10L 10mM Tris、pH 8.1于5℃±3℃透析18-20小時(shí)。然后將透析緩沖液換為新鮮的10mM Tris pH 8.1(10L)，繼續(xù)在5℃±3℃透析20-22小時(shí)。
將透析的重折疊物加載到POROS 50HQ陰離子交換柱上，用Akta純化儀(Pharmacia)以50倍以上柱體積的0-500mM NaCl梯度液洗脫所結(jié)合的蛋白質(zhì)從而將sTCR與降解產(chǎn)物和雜質(zhì)分開。將諸峰組分保存于4℃，考馬斯染色SDS-PAGE分析，然后合并與濃縮。最后，用HBS-EP緩沖液(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，3.5mM EDTA，0.05％乙基苯基聚乙二醇(nonidet p40))預(yù)平衡的Superdex 200HR凝膠過濾柱純化sTCR并特征鑒定。合并相對(duì)分子量約50kDa的洗脫峰(組分)，濃縮然后用Biacore表面等離振子共振分析進(jìn)行特征鑒定。
實(shí)施例7-Biacore表面等離振子共振特征鑒定sTCR與特異性pMHC的結(jié)合利用表面等離振子共振生物傳感器(Biacore 3000TM)分析了sTCR與其肽-MHC配體的結(jié)合情況。制備以半定向方式固定在鏈霉抗生物素蛋白包被的結(jié)合表面上的單種pMHC復(fù)合物(描述于下文)有助于該項(xiàng)分析，可同時(shí)有效地檢測(cè)可溶性T-細(xì)胞受體與多達(dá)4種不同pMHC(固定在不同的流動(dòng)池上)的結(jié)合情況。手動(dòng)注入HLA復(fù)合物以方便地操控固定的I類分子的精確水平。
這種固定的復(fù)合物能結(jié)合T-細(xì)胞受體和輔助受體CD8αα，可將二者注射入溶液相。即使在低濃度(至少40μg/ml)也能獲得TCR的特異性結(jié)合，暗示TCR較穩(wěn)定。如果采用溶液相或固定相的sTCR，觀察到sTCR的pMHC結(jié)合性能在質(zhì)量和數(shù)量上相似。這對(duì)控制可溶性sTCR的部分活性很重要，也提示生物素化pMHC復(fù)合物與非生物素化復(fù)合物活性相同。
在Biacore 3000TM表面等離振子共振(SPR)生物傳感器上分析含有新鏈間鍵的1G4 sTCR與其配體/MHC復(fù)合物或無關(guān)HLA-肽混合物(制備方法如上所述)的相互作用。SPR檢測(cè)在小流動(dòng)池中接近傳感器表面的折射指數(shù)變化，以應(yīng)答單位(RU)表示，一種可用于檢測(cè)受體配體相互作用并分析它們的親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的原理。通過交聯(lián)于β2m上的生物素和鏈霉抗生物素蛋白(化學(xué)交聯(lián)于流動(dòng)小室的活化表面)之間的結(jié)合將各HLA-肽復(fù)合物固定在不同的流動(dòng)小室中來制備探針流動(dòng)小室。然后使sTCR以恒定流速流過不同流動(dòng)小室的表面，再測(cè)定這樣做時(shí)的SPR反應(yīng)來進(jìn)行該試驗(yàn)。
測(cè)定平衡結(jié)合常數(shù)制備WT IG4 sTCR的連續(xù)稀釋液，以5μl每分鐘的恒定流速注入兩個(gè)不同的流動(dòng)小室；一個(gè)用約1000RU的特異性SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物包被，第二個(gè)用約1000RU的非特異性HLA-A2-肽復(fù)合物包被。利用對(duì)照小室的測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)化每種濃度的反應(yīng)。為計(jì)算平衡結(jié)合常數(shù)KD，將標(biāo)準(zhǔn)化反應(yīng)數(shù)據(jù)對(duì)TCR樣品的濃度作圖并擬合為雙曲線。(Price和Dwek，《生物化學(xué)家的物理化學(xué)中的原理與問題》(Principles and Problems in Physical Chemistry forBiochemists)，(第二版)，1979，Clarendon Press，Oxford)。
測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)就高親和力TCR而言，通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定解離速率常數(shù)kd和結(jié)合速率常數(shù)ka來確定KD。平衡常數(shù)KD計(jì)算為kd/ka。
將TCR注入兩個(gè)不同的小室中，一個(gè)小室用約300RU的特異性SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物包被，第二個(gè)小室用約300RU的非特異性HLA-A2-肽復(fù)合物包被。流速設(shè)置為50μl/分鐘。一般注入約3μM濃度的250μl TCR。然后使緩沖液流過直至反應(yīng)回歸至基線。用Biaevaluation軟件計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。也將解離階段擬合為能計(jì)算半衰期的單指數(shù)衰減方程。
結(jié)果用以上方法分析二硫鍵連接的可溶性天然1G4 TCR和SLLMWITQC-HLA-A*0201復(fù)合物之間的相互作用，證明KD為15μM，koff為1.28×10-1S-1。
下表詳細(xì)描述了用以上方法獲得的含突變CDR2序列的高親和力1G4 TCR的Biacore結(jié)果

實(shí)施例8-ILA TCR CDR2文庫(kù)的構(gòu)建可改進(jìn)以上實(shí)施例所述的方法來制備和測(cè)試含突變CDR2序列的其它TCR的高親和力變體。簡(jiǎn)言之，將編碼待突變的TCR鏈的DNA用作模板來制備實(shí)施例1所述的CDR2文庫(kù)。唯一需要改變的是文庫(kù)構(gòu)建中所用的引物必須與待突變TCR鏈的DNA序列等價(jià)部分相互補(bǔ)。
這些方法已應(yīng)用于制備和測(cè)試能與ILAKFLHWL(SEQ ID NO34)-HLA-A*0201 pMHC特異性結(jié)合的ILA TCR的變體。
圖7a和7b分別提供了ILA TCR的可溶性變體的α和β TCR鏈的DNA序列(SEQ ID NO35和36)，所述序列含有天然的可變結(jié)構(gòu)域和引入的半胱氨酸密碼子。
圖8a和8b分別提供了ILA TCR可溶性變體的α和β TCR鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO37和38)，所述序列含有天然的可變結(jié)構(gòu)域和引入的半胱氨酸殘基。
為獲得含有能與ILAKFLHWL(SEQ ID NO34)-HLA-A*0201復(fù)合物的結(jié)合親和力提高和/或?qū)υ損MHC的解離速率降低的變體的TCR文庫(kù)，可將多種突變引入ILA TCR鏈的CDR2α和CDR2β序列中。因?yàn)镮LA TCRβ鏈的基礎(chǔ)是與1G4 TCRβ鏈相同的TRBV6.5基因，并且這兩種TCR的CDR2β區(qū)和其周圍的氨基酸與DNA序列相同，故可用非常相似的引物來突變ILA TCR CDR2β序列。
用PCR擴(kuò)增方法，以誘變的寡核苷酸(Jon342和Jon344的ILA TCR等價(jià)物)作為正向引物和下游完全互補(bǔ)的寡核苷酸作為反向引物，得到各CDR2序列的高度多樣性突變體群來產(chǎn)生突變片段群。就CDR2α而言，隨機(jī)突變核心殘基的3個(gè)(Jon342的ILA TCR等價(jià)物)，而對(duì)CDR2β而言，隨機(jī)突變4個(gè)殘基(Jon344的ILATCR等價(jià)物)。
為了隨后的文庫(kù)構(gòu)建導(dǎo)入方便的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將得到的兩種誘變的PCR片段各自連接于一附加片段，該片段含有與誘變寡核苷酸的5’區(qū)域具有重疊互補(bǔ)性的TCR開放讀框的毗鄰部分。在利用合適的側(cè)翼正向和反向引物對(duì)的第二PCR反應(yīng)中進(jìn)行這種稱為重疊延伸剪接(SOE)的剪接反應(yīng)。
PCR1-產(chǎn)生誘變的CDR2α片段38.5μl水，5μl 10×PCR緩沖液，1.5μl Jon342引物的ILA TCR等價(jià)物(10μM儲(chǔ)備液)，1.5μl CDR1bRev引物的ILA TCR等價(jià)物(10μM儲(chǔ)備液)，2.5ng含有的ILA TCRα和β鏈(pEX746ILA)的模板載體，2ul dNTP(20mM混合儲(chǔ)備液)，1μlpfu turbo聚合酶。PCR反應(yīng)如下進(jìn)行2分鐘95度初始變性，然后95度30秒、53度30秒和72度60秒，共進(jìn)行30輪。包括72度10分鐘的最后延伸步驟。取總共50μl的PCR反應(yīng)液在1.4％TBE瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，切下代表誘變產(chǎn)物的條帶，按照生產(chǎn)商的使用說明用Qiagen MinElute試劑盒純化。
PCR2-產(chǎn)生誘變的CDR2β片段如上所述，除了引物替換為Jon344和Yol22的ILA TCR等價(jià)物。
PCR3-產(chǎn)生CDR2α突變的重疊片段如上所述，除了引物替換為Yol13和CDR2aRev的ILA TCR等價(jià)物。
PCR4-產(chǎn)生CDR2β突變的重疊片段如上所述，除了引物替換為CDR2aFw和CDR2bRev的ILA TCR等價(jià)物。
PCR5-產(chǎn)生剪接的PCR1/PCR3 CDR2α誘變片段將PCR1和PCR3的純化的模板片段用水作1∶10稀釋，將每份1μl混合入也含有以下成分的50μl PCR反應(yīng)液中37μl水、5μl 10×PCR緩沖液、1.5μl Yol13引物的ILA TCR等價(jià)物(10μM儲(chǔ)備液)、1.5μl cdrlbRev引物的ILA TCR等價(jià)物(10μM儲(chǔ)備液)、2ul dNTP(20mM混合儲(chǔ)備液)、1μl pfu turbo聚合酶。剪接PCR反應(yīng)如下進(jìn)行2分鐘95℃初始變性，然后95℃30秒、54℃40秒和72℃90秒，共進(jìn)行27輪。包括72℃10分鐘的最后延伸步驟。進(jìn)行12次相同的PCR反應(yīng)。合并12份PCR反應(yīng)液，按照生產(chǎn)商的使用說明用Qiagen Qiaquick試劑盒純化該剪接誘變產(chǎn)物。
PCR6-產(chǎn)生剪接的PCR2/PCR4 CDR2β誘變片段如上所述，除了替換為PCR2和PCR4。
用NcoI和BssHII消化PCR5的誘變產(chǎn)物并連接入也用NcoI和BssHII消化、含有親代ILA TCR開放讀框的pEX922-ILA噬菌體展示載體中，從而導(dǎo)致親代CDR2α序列基序取代了大量的多樣性突變體序列群。對(duì)PCR6(的產(chǎn)物)進(jìn)行同樣操作，從而用親代序列取代了大量的多樣性CDR2β突變體序列群。然而，此時(shí)所用的克隆酶是BssHII和NotI。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，用T4 DNA連接酶以插入物與載體之比為3∶1進(jìn)行連接。
濃縮和在Qiagen MinElute柱上脫鹽后，將連接的CDR2α和CDR2β突變體混合物分別用電穿孔法導(dǎo)入TGI細(xì)胞。按照細(xì)胞的商業(yè)供應(yīng)商(Stratagene)提供的方案，采用每50μl電感受態(tài)細(xì)胞約300ng DNA的比例進(jìn)行電穿孔。兩種文庫(kù)各進(jìn)行兩次電穿孔。電穿孔后，將細(xì)胞重懸在含950μl預(yù)熱(37℃)SOC培養(yǎng)基的比色皿中使之再生，在50ml無菌試管中輕柔攪拌40分鐘使之恢復(fù)。隨后，將1ml恢復(fù)的細(xì)胞加入裝有含100μg/ml氨芐西林和1.6％葡萄糖的50ml2TY培養(yǎng)基(每升16g Bacto-胰蛋白胨、10g Bacto-酵母提取物、5g NaCl)(2TYAG)的無菌搖瓶中，即每種文庫(kù)兩個(gè)搖瓶。將搖瓶37℃ 280rpm振蕩5小時(shí)培養(yǎng)液的OD600達(dá)到1-1.5。離心收集細(xì)胞，重懸于4ml/文庫(kù)的2TY+20％甘油中。等份試樣(250μl)在干冰上冷凍并保存于-80℃。
然后用以上實(shí)施例2和3中IG4 TCR CDR2突變體所述的方法淘選和測(cè)試以上制備的ILA TCR文庫(kù)，除了用ILA TCR(ILAKFLHWL(SEQ ID NO34)HLA-A*0201)的同源pMHC進(jìn)行淘選和隨后的ELISA測(cè)試外。
結(jié)果


然后用實(shí)施例5和6所述方法制備含有用實(shí)施例3所述ELISA方法鑒定的CDR2突變的可溶性ILA TCR，用實(shí)施例7所述方法對(duì)這些突變體進(jìn)行Biacore特征鑒定。
實(shí)施例9-高親和力HIV Gag TCR CDR2突變體如上所述，可改進(jìn)以上實(shí)施例所述的方法來制備和測(cè)試含突變CDR2序列的其它TCR的高親和力變體。簡(jiǎn)言之，將編碼待突變的TCR鏈的DNA用作模板來制備實(shí)施例1所述的CDR2文庫(kù)。唯一需要改變的是文庫(kù)構(gòu)建中所用的引物必須與待突變TCR鏈的DNA序列的等價(jià)部分相互補(bǔ)。
這些方法已應(yīng)用于制備和測(cè)試能與SLYNTVATL (SEQ ID NO53)-HLA-A*0201 pMHC特異性結(jié)合的親代HIV Gag TCR的變體。
圖9a和9b分別提供了ILA TCR可溶性變體的α和β TCR鏈的DNA序列(SEQID NO54和55)，所述序列含有天然的可變結(jié)構(gòu)域和引入的半胱氨酸密碼子。
圖10a和10b分別提供了ILA TCR可溶性變體的α和β TCR鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO56和57)，所述序列含有天然的可變結(jié)構(gòu)域和引入的半胱氨酸殘基。
為獲得含有對(duì)SLYNTVATL(SEQ ID NO53)-HLA-A*0201復(fù)合物結(jié)合親和力提高和/或?qū)υ損MHC解離速率降低的變體的TCR文庫(kù)，可將多種突變引入親代HIV Gag TCR鏈的CDR2α和CDR2β序列中。
采用PCR擴(kuò)增與誘變的寡核苷酸得到各CDR2序列的高度多樣性突變體群。
為了隨后的文庫(kù)構(gòu)建導(dǎo)入方便的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將得到的兩種誘變的PCR片段各自連接于一附加片段，該片段含有與誘變寡核苷酸的5’區(qū)域具有重疊互補(bǔ)性的TCR開放讀框的毗鄰部分。在利用合適的側(cè)翼正向和反向引物對(duì)的第二PCR反應(yīng)中進(jìn)行這種稱為重疊延伸剪接(SOE)的剪接反應(yīng)。
濃縮和在Qiagen MinElute柱上脫鹽后，將連接的CDR2α和CDR2β突變體混合物分別用電穿孔法導(dǎo)入TG1細(xì)胞。按照細(xì)胞的商業(yè)供應(yīng)商(Stratagene)提供的方案，采用每50μl電感受態(tài)細(xì)胞約300ng DNA的比例進(jìn)行電穿孔。兩種文庫(kù)各進(jìn)行兩次電穿孔。電穿孔后，將細(xì)胞重懸在含950μl預(yù)熱(37℃)SOC培養(yǎng)基的比色皿中使之再生，在50ml無菌試管中輕柔攪拌40分鐘使之恢復(fù)。隨后，將1ml恢復(fù)的細(xì)胞加入裝有含100μg/ml氨芐西林和1.6％葡萄糖的50ml2TY培養(yǎng)基(每升16g Bacto-胰蛋白胨、10g Bacto-酵母提取物、5g NaGl)(2TYAG)的無菌搖瓶中，即每種文庫(kù)兩個(gè)搖瓶。將搖瓶37℃ 280rpm振蕩5小時(shí)培養(yǎng)液的OD600達(dá)到1-1.5。離心收集細(xì)胞，重懸于4ml/文庫(kù)的2TY+20％甘油中。等份試樣(250μl)在干冰上冷凍并保存于-80℃。
然后用以上實(shí)施例2和3中IG4 TCR CDR2突變體所述的方法淘選和測(cè)試以上制備的HIV Gag TCR文庫(kù)，除了用HIV Gag TCR(SLYNTVATL(SEQ IDNO53)HLA-A*0201)的同源pMHC進(jìn)行淘選和隨后的ELISA測(cè)試外。
然后制備含有所鑒定CDR2突變的二硫鍵連接的可溶性TCR，來對(duì)它們各自對(duì)SLYNTVATL-HLA-A*0201配體的親和力進(jìn)行Biacore測(cè)定。
結(jié)果注意所有從以上文庫(kù)鑒定的高親和力HIV Gag TCR只含有CDR2β突變。

權(quán)利要求
1.一種提高對(duì)給定靶pMHC特異的給定TCR的親和力和/或降低其解離速率的方法，包括制備具有不同于給定TCR的相應(yīng)CDR2序列的α鏈CDR2序列和/或β鏈CDR2序列，但具有與給定TCR相同的α和βCDR1和CDR3序列的多種TCR，測(cè)定所述多種TCR成員對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率，和選出對(duì)該靶pMHC的親和力比給定TCR至少高10倍和/或?qū)υ摪衟MHC的解離速率比給定TCR至少慢10倍的一個(gè)或多個(gè)成員。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括(a)制備相對(duì)于給定TCR而言，在α鏈CDR2序列而非β鏈CDR2序列中具有突變的第一批TCR，(b)分別制備相對(duì)于給定TCR而言，在β鏈CDR2序列而非α鏈CDR2序列中具有突變的第二批TCR，(c)測(cè)定所述第一和第二批TCR的成員對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率，選出每批中對(duì)該靶pMHC的親和力比給定TCR至少高10倍和/或?qū)υ摪衟MHC的解離速率比給定TCR至少慢10倍的一個(gè)或多個(gè)成員，(d)測(cè)定每批中所選出成員的CDR2序列，和(e)制備各具有第一批的α鏈CDR2序列和第二批的β鏈CDR2序列的一種或多種TCR，和(f)測(cè)定步驟(e)所制備的TCR對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率，并選出對(duì)該靶pMHC的親和力比給定TCR至少高10倍和/或?qū)υ摪衟MHC的解離速率比給定TCR至少慢10倍的一個(gè)或多個(gè)成員。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括(a)提供編碼給定TCR的α和β鏈的核酸，(b)誘變所述核酸的α鏈CDR2序列的一個(gè)或多個(gè)密碼子和β鏈CDR2序列的一個(gè)或多個(gè)密碼子，(c)從步驟(b)的突變核酸制備相對(duì)于給定TCR而言，在α鏈CDR2序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸和β鏈CDR2序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸中具有突變的多種TCR，和(d)測(cè)定所述多種TCR的成員對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率，選出對(duì)該靶pMHC的親和力比給定TCR至少高10倍和/或?qū)υ摪衟MHC的解離速率比給定TCR至少慢10倍的一個(gè)或多個(gè)成員。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，誘變所述核酸的α鏈CDR2序列中多達(dá)3個(gè)連續(xù)密碼子和β鏈CDR2序列中多達(dá)3個(gè)連續(xù)密碼子，并且在步驟(c)中制備相對(duì)于給定TCR而言，在α鏈CDR2序列中具有多達(dá)3個(gè)連續(xù)密碼子和β鏈CDR2序列中具有多達(dá)3個(gè)連續(xù)密碼子突變的多種TCR。
5.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，通過表面等離振子共振測(cè)定所述親和力和/或解離速率。
6.如權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，選出對(duì)靶pMHC的親和力比對(duì)給定TCR至少高100倍和/或解離速率至少慢100倍的一個(gè)或多個(gè)成員。
7.如權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，選出對(duì)靶pMHC的親和力比對(duì)給定TCR至少高500倍和/或解離速率至少慢500倍的一個(gè)或多個(gè)成員。
8.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，將測(cè)定了親和力和/或解離速率(on/off rate)的TCR制備為可溶形式。
9.如權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，將測(cè)定了親和力和解離速率(on/off rate)的TCR制備為噬菌體展示的αβ二聚體TCR的多樣性文庫(kù)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述噬菌體展示的αβ二聚體TCR含有第一多肽，其中，對(duì)應(yīng)于TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列的N末端相融合，和第二多肽，其中，對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列的N末端相融合，該第一和第二多肽通過在天然αβT細(xì)胞受體中無等價(jià)物的二硫鍵相連，和所述第一或第二多肽之一在其C-末端通過肽鍵與噬菌體顆粒的表面暴露的氨基酸殘基相連。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述噬菌體展示的αβ二聚體TCR含有第一多肽，其中，對(duì)應(yīng)于TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的序列與對(duì)應(yīng)于TCRα鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列的N末端相融合，和第二多肽，其中，對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的序列與對(duì)應(yīng)于TCRβ鏈恒定結(jié)構(gòu)域胞外序列的N末端相融合，該第一和第二TCR多肽通過取代TRAC*01的外顯子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser 57的半胱氨酸殘基或其非人等價(jià)物之間的二硫鍵相連，所述第一或第二多肽之一在其C-末端通過肽鍵與噬菌體顆粒的表面的暴露氨基酸殘基相連。
12.如權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，將所述多種TCR制備為核糖體展示的αβ單鏈TCR的多樣性文庫(kù)。
13.如權(quán)利要求9到12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，為了測(cè)定與靶pMHC結(jié)合的文庫(kù)成員的親和力和/或解離速率并選擇具有所需親和力和/或解離速率的成員(i)使該文庫(kù)的幾種成員同時(shí)與靶pMHC接觸，鑒定與pMHC結(jié)合的成員，(ii)使步驟(i)鑒定的成員連續(xù)與靶pMHC接觸，評(píng)估它們對(duì)pMHC的親和力，(iii)選擇經(jīng)步驟(ii)評(píng)估的具有所需親和力的一種或多種成員，測(cè)定所展示TCR的CDR2序列，(v)制備摻有經(jīng)如此測(cè)定的CDR2序列的可溶形式的TCR，(vi)視情況再次測(cè)定和/或測(cè)定這些TCR對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率，和(vii)選擇步驟(vi)所測(cè)定的具有所需親和力和/或解離速率的一種或多種TCR。
全文摘要
一種提高對(duì)給定靶pMHC特異性給定TCR的親和力和/或降低其解離速率的方法，包括制備具有不同于給定TCR的相應(yīng)CDR2序列的α鏈CDR2序列和/或β鏈CDR2序列，但具有與給定TCR相同的α和βCDR1和CDR3序列的多種TCR，測(cè)定所述多種TCR成員對(duì)靶pMHC的親和力和/或解離速率，和選出對(duì)該靶pMHC的親和力比給定TCR至少高10倍和/或?qū)υ摪衟MHC的解離速率比給定TCR至少慢10倍的一個(gè)或多個(gè)TCR成員。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1954069SQ200580015878
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月19日
發(fā)明者S·M·鄧恩, 李懿, J·M·伯爾特 申請(qǐng)人:阿維德克斯有限公司