專利名稱：檸檬酸提取梨花粉原生質(zhì)體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是梨花粉和花粉管原生質(zhì)體提取的方法，涉及植物細(xì)胞破壁和獲取具有活力原生質(zhì)體的方法，屬于生物化學(xué)及食品科學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物花粉(pollen)不僅在植物繁衍后代、擴(kuò)大遺傳組成與分布范圍等方面起極其重要作用，而且其營養(yǎng)極其豐富。近年來研究表面花粉含有種類繁多的碳水化合物、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、核酸、酶和輔酶、色素、維生素與礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分。其中蛋白質(zhì)的含量十分豐富，達(dá)7％-40％，勝過酪蛋白?；ǚ壑泻?8種氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸，其含量多于牛奶、雞蛋的5-7倍，尤其是賴氨酸的含量特別豐富，它有利兒童生長發(fā)育?；ǚ圻€含有維生素A、維生素B群(B1、B2、B6、B12)、維生素C、維生素D、維生素E、維生素P以及泛酸、葉酸、煙酸等10多種維生素，特別是維生素E，C，P，能增強(qiáng)人體免疫功能，促進(jìn)延年益壽，軟化血管，預(yù)防動脈硬化和冠心病?；ǚ圻€含有90多種酵酸素、酶和輔酶，這些酶類保存著天然活力，是生命活動過程中的重要物質(zhì)，是一種天然高級營養(yǎng)品，因而，也為國際上譽(yù)為“完全營養(yǎng)食品”(perfect foods)。
我國土地遼闊，種子植物有3萬余種?；ǚ垭m小，但植物產(chǎn)花粉數(shù)量十分驚人，一株玉米可產(chǎn)5000萬?；ǚ邸Ｎ覈丶s有1.0005億hm2(15億畝)，所以花粉資源十分豐富，居世界首位。目前全國養(yǎng)蜜蜂700萬群左右，假如每群蜂一年采集10Kg花粉，那么每年就會產(chǎn)7000萬Kg，如果再加上人工或機(jī)器收集花粉，那將是一種非?？捎^的潛在的食物資源。但目前開發(fā)利用不到1/200，所以研究、開發(fā)、應(yīng)用花粉，對人類的幸福生存，具有深遠(yuǎn)的意義。
雖然花粉的食用營養(yǎng)及藥用價值很大，但是由于花粉壁的構(gòu)造、組成較為特殊、結(jié)構(gòu)堅(jiān)硬，如果不去壁，其營養(yǎng)很難被人體有效的吸收利用，特別是花粉口服液飲料等更應(yīng)選用去壁后的花粉原生質(zhì)體為原料。為此，在食品科學(xué)領(lǐng)域，有許多學(xué)者開展相關(guān)的開發(fā)研究，現(xiàn)有的花粉去壁的方法可以歸結(jié)為以下三類1)物理方法這種方法也比較常見，對花粉進(jìn)行干燥或冰凍，然后再對花粉進(jìn)行研磨，該方法多用于食品工業(yè)，用于提取花粉的內(nèi)容物；2)生理方法用一定滲透壓的溶液浸泡花粉，讓原生質(zhì)體膨脹，撐破花粉壁，而獲得原生質(zhì)體或花粉內(nèi)含物，但該方法應(yīng)用較少，3)發(fā)酵法直接利用花粉本身所有的酶類和微生物，使花粉達(dá)到發(fā)酵破壁的目的。雖然已經(jīng)有這些去壁的方法，但是，這些方法存在很多問題，主要問題有其一是用這些方法所獲得的花粉原生質(zhì)體不僅失去原有的生物活力，而且對營養(yǎng)成分還會帶來一定的破壞性，在很大程度上降低所具有的營養(yǎng)價值；其二是這些獲取花粉原生質(zhì)體的方法不能適合于所有的植物花粉，比如，用這些方法無法獲取梨、蘋果等薔薇科果樹花粉的原生質(zhì)體。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供梨等薔薇科植物花粉原生質(zhì)體的提取方法，有效地分離出具有活力的、保存原有養(yǎng)分和活性的花粉原生質(zhì)體。該方法可用于分離提純其他薔薇科果樹(蘋果、桃、杏、李等)花粉原生質(zhì)體，也為其他組織器官的原生質(zhì)體的分離提供參考。
技術(shù)方案本發(fā)明是用檸檬酸(citric acid anhydrate)去除花粉壁來獲得花粉的內(nèi)容物(原生質(zhì))的方法，可用于絕大多數(shù)植物的花粉，也就是說，只要所用的植物花粉具有萌發(fā)孔或萌發(fā)溝，就能獲取其原生質(zhì)，這種方法非常適合于食品科學(xué)領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用。
該方法包含下列步驟1)花粉的采集采集當(dāng)天開放的花粉，然后讓花粉充分干燥；2)檸檬酸液的制備2-3mol/L的檸檬酸，加入5～10mmol/L的MES(Fatty AcidMethl Ester Sulfonic Acid(salt)，α-磺基甲脂磺酸鈉)溶液和0.01～0.02mmol/L的BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清蛋白)；3)花粉破壁取充分干燥的花粉放入配制好的檸檬酸液中，置于搖床中，溫度為30-37℃，100-120rpm，30min后，就可見花粉的原生質(zhì)體逐漸從萌芽口處出來，從而獲得破壁的花粉原生質(zhì)，一般處理時間掌握在1小時之內(nèi)?；ǚ鄣娜ケ跀?shù)量是隨著處理時間的延長而增多，但時間過長時，大部分花粉原生質(zhì)體將變得不完整，原生質(zhì)體的活力也下降；4)離心破壁后的花粉先進(jìn)行高速離心(5000rpm以上，5-10min)，取沉淀物。沉淀物放入蒸餾水中，進(jìn)行低速成離心(500rpm以下，3min)用以去除花粉外殼。上清即為所需的花粉原生質(zhì)體。
有益效果本發(fā)明的積極效果1)首次從薔薇科果樹梨花粉及花粉管中分離出具有活力的原生質(zhì)體，可以用于各種相關(guān)的科學(xué)研究，尤其是梨花粉生理生化特性的基礎(chǔ)性研究；比如，花粉原生質(zhì)體適合于作為研究植物細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)材料；2)應(yīng)用本發(fā)明的方法提取的具有活力的原生質(zhì)體，在植物的雜交育種領(lǐng)域，有較大的應(yīng)用前景，通過同一來源或者不同來源的具有活力的原生質(zhì)體的相互融合，可以重新發(fā)育成新的植株，這種方法稱為體細(xì)胞雜交，是創(chuàng)新種質(zhì)的重要手段；3)本發(fā)明是基于對梨花粉及花粉管生理生化及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等特性研究的工作基礎(chǔ)?；ǚ墼|(zhì)體具有單倍性、結(jié)構(gòu)簡單、發(fā)育同步和群體數(shù)量大等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是″遺傳操作和突變研究的卓越體系”，提供“研究花粉生理學(xué)和個體發(fā)育的新途徑”。另外，在研究植物受精生理學(xué)中，許多重要的生理生化反應(yīng)都是發(fā)生在花粉管內(nèi)，如自交不親和反應(yīng)等；因此，獲得花粉管原生質(zhì)體是開展這些科學(xué)理論研究的重要前提?？傊?，本方法具有堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)，科學(xué)性強(qiáng)、方法較簡便，易于操作和實(shí)際應(yīng)用。
4)采用本發(fā)明方法提取梨花粉及花粉管原生質(zhì)體，檸檬酸可以反復(fù)使用，節(jié)省投資；檸檬酸是食品添加劑，用它作為花粉破壁的藥劑，不會對環(huán)境產(chǎn)生污染，副產(chǎn)品少；檸檬酸對花粉的破壁，對條件要求不高，方法簡便，易于操作，實(shí)際應(yīng)用性強(qiáng)，適合于食品科學(xué)領(lǐng)域的花粉保健品的生產(chǎn)，因此，有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1檸檬酸去除花粉破壁流程2檸檬酸處理花粉效果圖a檸檬酸處理花粉10minb檸檬酸處理花粉1hc檸檬酸處理花粉2h具體實(shí)施方式
提取植物花粉(管)原生質(zhì)體，是研究花粉(管)的生理、生化特性及其功能的必要前提之一。我們應(yīng)用本發(fā)明的方法，獲取了具有活力的梨花粉管原生質(zhì)體，利用膜片鉗直接鑒定出花粉管的鈣通道及花粉管內(nèi)的鈣梯度及其相關(guān)功能，為拓寬和深入研究花粉管的電化學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。眾所周知，獲取花粉(管)原生質(zhì)體是開展膜片鉗實(shí)驗(yàn)研究的前提，而迄今，在根毛、藻類的假根及菌絲都是采用激光切除細(xì)胞壁，這種方法需要較為昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，其次，目前關(guān)于獲取花粉有活性且完整的原生質(zhì)體，都是以幼嫩和新鮮的花粉為材料，而對于一年只能采收一次，而且是成熟的花粉沒有報道，如梨、蘋果、桃等。更沒有關(guān)于如何獲取花粉管原生質(zhì)體的報道。
實(shí)驗(yàn)以梨花粉作為材料，采用本發(fā)明方法獲取了具有活力的花粉管原生質(zhì)體，并利用膜片鉗成功鑒定出梨花粉管尖端的鈣通道。實(shí)驗(yàn)過程如下
1)花粉的采集采集當(dāng)天開放的花粉，然后讓花粉充分干燥；2)檸檬酸液的制備2-3mol/L的檸檬酸，加入5～10mmol/L的MES(Fatty AcidMethl Ester Sulfonic Acid(salt)，α-磺基甲脂磺酸鈉)溶液和0.01～0.02mmol/L的BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清蛋白)；3)花粉破壁取充分干燥的花粉放入配制好的檸檬酸液中，置于搖床中花粉破壁處理，溫度為30-37℃，100-120rpm，30min后，就可見花粉的原生質(zhì)體逐漸從萌芽口處出來，從而獲得破壁的花粉原生質(zhì)，一般處理時間掌握在1小時之內(nèi)?；ǚ鄣娜ケ跀?shù)量是隨著處理時間的延長而增多，但時間過長時，大部分花粉原生質(zhì)體將變得不完整，原生質(zhì)體的活力也下降(圖2)。
4)離心破壁后的花粉先進(jìn)行高速離心(5000rpm以上，5-10min)，取沉淀物。沉淀物放入蒸餾水中，進(jìn)行低速成離心(500rpm以下，3min)用以去除花粉外殼。上清即為所需的花粉原生質(zhì)體。
權(quán)利要求
1.檸檬酸提取梨花粉原生質(zhì)體的方法，包括下列步驟1)花粉的采集采集當(dāng)天開放的花粉，然后讓花粉充分干燥；2)檸檬酸液的制備2-3mol/L的檸檬酸，加入5～10mmol/L的α-磺基甲脂磺酸鈉溶液和0.01～0.02mmol/L的牛血清蛋白；3)花粉破壁取充分干燥的花粉放入配制好的檸檬酸液中，置于搖床中花粉破壁處理，溫度為30-37℃，100-120rpm，30min后，就可見花粉的原生質(zhì)體逐漸從萌芽口處出來，從而獲得破壁的花粉原生質(zhì)；4)離心破壁后的花粉先進(jìn)行高速離心5000rpm以上，5-10min，取沉淀物；沉淀物放入蒸餾水中，進(jìn)行低速成離心500rpm以下，3min用以去除花粉外殼，上清即為所需的花粉原生質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檸檬酸提取梨花粉原生質(zhì)體的方法，其特征在于，花粉破壁處理時間掌握在1小時之內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明梨花粉和花粉管原生質(zhì)體的提取方法，涉及植物體細(xì)胞壁的破除和原生質(zhì)體獲取的方法，是屬于生物化學(xué)及食品科學(xué)領(lǐng)域；本發(fā)明主要是依據(jù)植物花粉細(xì)胞壁的特性來獲取完整的花粉或花粉管原生質(zhì)體，而且保持原有的活力。利用檸檬酸去除花粉壁的方法，該方法是將干燥的花粉放入2－3mol/L檸檬酸液中，經(jīng)過約30分鐘左右的培養(yǎng)，可看到花粉的原生質(zhì)體逐漸從萌芽口處出來，通過離心能夠獲得脫壁的花粉原生質(zhì)體，該方法獲得了原生質(zhì)，能夠保持原有的營養(yǎng)價值，沒有污染，方法簡單，成本低，非常適合于在食品科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
文檔編號A23L1/076GK1799399SQ20061003784
公開日2006年7月12日 申請日期2006年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月17日
發(fā)明者張紹鈴, 屈海泳, 吳俊 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)