專利名稱：水稻花分生組織控制基因eg1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種利用圖位克隆技術(shù)克隆水稻EG1(EXTRA GLUME 1)基因，以及利用轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實驗鑒定該基因的功能；同時還涉及利用該基因物對水稻花分生組織和花的發(fā)育進(jìn)行改良，提高水稻的產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是單子葉植物發(fā)育分子生物學(xué)研究的理想模式植物。單子葉植物的花分生組織及花器官組成的許多特征明顯不同于雙子葉植物(雙子葉植物的花從外到內(nèi)依次花萼、花瓣、雄蕊和心皮四輪花器官組成)。水稻花序分生組織的單位是小穗，小穗由小花和兩個穎片組成，小花從外到內(nèi)依次由外穎、內(nèi)穎、2個漿片、6枚雄蕊和1個雌蕊。近年來，花器官的發(fā)育受到人們的廣泛關(guān)注并成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的焦點之一。這不僅是因為花在植物的生長發(fā)育中處于中心位置，而且花器官的發(fā)育過程為研究基因表達(dá)調(diào)控與器官的形態(tài)發(fā)生之間的關(guān)系提供了一個非常獨特的系統(tǒng)。通過對花發(fā)育機(jī)制的理解，我們就能通過基因工程的手段改變花分生組織和花的發(fā)育，控制作物的開花時間。禾本科植物的花器官雄蕊和雌蕊是保守的；漿片被認(rèn)為是雙子葉植物花瓣的同源器官也已得到許多實驗結(jié)果的證實。有人認(rèn)為外穎和內(nèi)穎都是與雙子葉植物花萼一致的器官。然而外穎和內(nèi)穎在形態(tài)上存在差異，而且排列上也不同，外穎和內(nèi)穎與雙子葉植物花器官之間是怎樣的關(guān)系，目前仍不清楚。因此，利用水稻穎殼突變體，研究水稻花發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，完善水稻花發(fā)育的模型，具有重要意義。
本發(fā)明利用水稻多穎突變體，通過圖位克隆技術(shù)首次在水稻中克隆到了EG1基因，該基因編碼一類lipase蛋白，控制水稻花分生組織的形成，并影響水稻花器官的數(shù)目。Lipase是一類水解酶，在植物中通過分解脂質(zhì)在細(xì)胞新陳代謝中起重要作用，目前也有研究發(fā)現(xiàn)lipase具有控制花藥開裂及推遲葉片衰老的功能，但是目前還未發(fā)現(xiàn)lipase影響花分生組織發(fā)育的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種能影響水稻小花發(fā)育及穗部結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)及其基因，以及由此獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，和利用所述基因?qū)λ拘』八氩窟M(jìn)行改造的方法。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過這樣的技術(shù)方案來實現(xiàn)的提供一種水稻花分生組織控制基因EG1編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
作為本發(fā)明的一種改進(jìn)上述氨基酸序列還包括在SEQ ID No2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸生成的衍生物。
本發(fā)明還提供一種編碼上述兩種蛋白質(zhì)的基因，其具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
作為本發(fā)明的一種改進(jìn)上述核苷酸序列還包括在SEQ ID No1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因或衍生物。
本發(fā)明還提供一種包含上述基因的植物表達(dá)載體。
本發(fā)明還提供一種包含上述兩種核酸的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
本發(fā)明還提供一種對水稻花分生組織進(jìn)行改造的方法，包括用具有SEQID No1所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。
進(jìn)一步具體的說本發(fā)明的目的是提供一種從水稻突變體extra glume 1中克隆的新基因EG1，如圖6和SEQ ID No1所示的DNA序列，也包括與SEQ ID No1所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列。本發(fā)明中的SEQ ID No2和圖7所示的蛋白質(zhì)屬于lipase脂肪酶，其中進(jìn)行一個或幾個替換，插入或缺失所獲得的功能類似物。另外，也包括在SEQ ID No1中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達(dá)到本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用EG1基因進(jìn)行高效的植物轉(zhuǎn)化的方法，具體地說，本發(fā)明提供了具有SEQ ID No1和圖6所示的序列的基因或基因部分片段的載體，其中，如圖4所示的pCAMBIA1300-EG1，該載體可以表達(dá)有上述核苷酸序列編碼的多肽或其同源類似物。
本發(fā)明還提供了一種利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞影響水稻花分生組織發(fā)育的方法。
實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下一、水稻多穎突變體eg1的分離和遺傳分析通過大量篩選突變體，本發(fā)明獲得了一個水稻多穎突變體eg1，通過與野生型水稻正反交實驗，我們獲得了一個符合單基因控制的遺傳規(guī)律的隱性突變體，如圖1所示。
二、圖位克隆控制水稻花分生組織的EG1基因1)、EG1基因的初步定位為了分離EG1基因，本發(fā)明采用圖位克隆的方法，首先創(chuàng)建了一個F2定位群體，由EG1純合體(粳稻中花11)為母本，選用秈稻浙輻802為父本雜交獲得的F2中的隱性個體組成。并利用SSR分子標(biāo)記對EG1位點進(jìn)行初步定位見圖2。定位結(jié)果表明，EG1初步定位在第1染色體短臂介于RM1361和RM3482兩個標(biāo)記之間。
2)、EG1基因的精細(xì)定位通過對RM1361和RM3482兩個標(biāo)記之間的BAC序列分析，發(fā)展新的SSR、STS和CAPS標(biāo)記將EG1精確定位于BAC P0035F12上P4和P2標(biāo)記之間約31kb范圍之內(nèi)，并且與分子標(biāo)記P3共分離(圖3)，通過分析此區(qū)段開放閱讀框(ORF)推測候選基因。
3)、EG1基因的鑒定和功能分析通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，結(jié)果表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常表型的轉(zhuǎn)基因水稻(圖5)，證明了本發(fā)明正確克隆了EG1基因(圖6)，氨基酸序列分析表明EG1編碼一類lipase蛋白(圖7)。
我國是稻米生產(chǎn)和消費大國，隨著人口的增長，對稻米需求將呈上升趨勢。但目前存在耕地面積減少的趨勢，因此迫切需要培育高產(chǎn)水稻品種。基因工程技術(shù)的發(fā)展使得應(yīng)用EG1基因調(diào)整水稻花發(fā)育方式和穗部結(jié)構(gòu)成為可能。本發(fā)明的eg1(extra glume 1)突變體，是單基因隱性突變，符合孟德爾方式遺傳規(guī)律。eg1突變體由本發(fā)明者分離獲得。本發(fā)明通過圖位克隆技術(shù)獲得控制花分生組織的基因EG1，并通過轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)實驗鑒定了該基因的功能。因而本發(fā)明能對水稻花分生組織和花的發(fā)育進(jìn)行改良，最終能提高水稻產(chǎn)量。


圖1是水稻多穎突變體eg1與中花11野生型的穗部及小花表型；圖2是EG1基因在水稻第1染色體上的初步定位圖；圖3是EG1基因的精細(xì)定位；圖4是pCAMBIA1300-EG1載體圖譜；圖5是功能互補(bǔ)實驗T0轉(zhuǎn)基因水稻的表型；其中eg1為多穎突變體植株；EG1/eg1為T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株；圖6是EG1基因的DNA核苷酸序列；圖7是EG1基因編碼的氨基酸序列。
具體實施例方式
實施例11、水稻材料水稻(Oryza sativa ssp.zhonghua11)突變體eg1(extra glume 1)，原始野生材料為中花11。
2、分析和定位群體純合體eg1突變體和野生型品種浙輻802進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代自交，得到F2群體，在抽穗期從中選出713個eg1突變表型個體作為定位群體。在抽穗期每株取1克左右的嫩葉，用來提取總DNA。
3、通過SSR、STS和CAPS標(biāo)記定位EG1基因采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。取大約0.2g水稻幼嫩葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于150μl超純水中。每一個PCR反應(yīng)用2μl DNA樣品。
在EG1基因的初步定位試驗中，對80個F2個體進(jìn)行SSR分析。根據(jù)公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的SSR引物，根據(jù)已知的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后在5％瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙啶(EB)染色，檢測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性，將EG1初步定位在第1號染色體長臂RM1361和RM3482標(biāo)記間。
在精細(xì)定位EG1基因時，對由713株F2個體組成的群體進(jìn)行SSR、STS和CAPS分析。根據(jù)分子標(biāo)記RM1361和RM3482之間的BAC序列，我們設(shè)計了1個STS分子標(biāo)記(P4)、1個SSR分子標(biāo)記(P3)和1個CAPS分子標(biāo)記(P2)，引物序列為P2U-5’CTGTATGTAGGCAAGACGTGAG3’，P2L-5’TGATTGTTAGGAATGTGTGACTG3’(NdeI digestion)；P3U-5’CTCCCTCACTAACTTAACCTGC 3’，P3L-5’AGCCTCGCTCTTCTACCTACA 3’；P4U-5’AAGAAGAGGGTGTGACAGCC 3’，P4L-5’GTGTGTTCGGTTCACGCTAA 3’。
利用這3個分子標(biāo)記對713株F2個體進(jìn)行連鎖分析。
5、基因預(yù)測和比較分析根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果，EG1基因位于BAC克隆P0035F12上P2和P4標(biāo)記之間31kb范圍之內(nèi)。根據(jù)Rice Automated Annotation System(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在此區(qū)間內(nèi)有2個候選基因，然后設(shè)計10對引物，采用PCR方法分別從EG1和野生型中花11的基因組中擴(kuò)增出這兩個候選基因，(共10個DNA片段)，進(jìn)行測序分析。發(fā)現(xiàn)其中1個基因的1個DNA片段中，突變體eg1擴(kuò)增的產(chǎn)物與野生型中花11比較有一個堿基替換(T到A)。將這結(jié)果重復(fù)驗證兩次，發(fā)現(xiàn)突變體eg1基因與中花11比較都有這個堿基替換。根據(jù)BAC克隆P0035F12序列的基因注釋信息(NCBI)，發(fā)現(xiàn)此基因編碼lipase蛋白，與擬南芥控制花藥開裂的基因DAD1同源性很高。
實施例2、植物轉(zhuǎn)化將BAC克隆OSJNBa0089G14用BamH I完全酶切，電泳分離后，割取5.1kb的DNA片段連接到pCAMBIA1300中，該克隆覆蓋了整個ORF的基因組區(qū)域，包括ATG上游804bp啟動子序列和3506bp的下游序列。
這個質(zhì)粒通過電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中轉(zhuǎn)化水稻。我們利用突變體幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后，挑選生長旺盛愈傷用作轉(zhuǎn)化的受體。用含有雙元質(zhì)粒載體的EHA105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗、25℃條件下共培養(yǎng)3天后，在含有40mg/LHygromycin的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)。篩選抗性愈傷在含有50mg/L預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天左右。將預(yù)分化的愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上在光照條件下培養(yǎng)。一個月左右得到抗性轉(zhuǎn)基因植株。對植株進(jìn)行鑒定和連續(xù)的觀察，在抽穗期發(fā)現(xiàn)穗部小花恢復(fù)了正常的形態(tài)，與同一生長階段的突變體比較，多穎等突變表型消失，小花恢復(fù)正常(圖5)。
以上所述僅為本發(fā)明的若干個具體實施方式
，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表SEQ ID NO11 atgacgctcc cgaggcaatg cgcggcggcg tgtaggacag gcggcggcgg cggcggcgtg61gtgcggtgca gggcggtggc ggcggcgggt ggggcggtgg cggtgaggga tgcggtggtg121 gcgccggtgg cgaggcgagg ggcggcgagg aagacggcgg agacggtggc ggggatgtgg181 agggaggtgc aggggtgcgg ggattgggag gggatgctgg agccggcgcc gcacccggtg241 ctgagggggg aggtggcgcg gtacggcgag ctggtgggcg cgtgctacaa ggcgttcgac301 ctggacccgg cgtcgcggag gtacctcaac tgcaagtacg ggagggagag gatgctggag361 gaggtcggga tgggcggcgc cgggtacgag gtcacccgct acatctacgc ggcggcggac421 gtcagcgtgc cgaccatgga gccgtcgacg agcgggcgcg ggcggtggat cgggtacgtc481 gcggtgtcca ccgacgagat gtcgcggcgg ctcgggcggc gcgacgtgct cgtctcgttc541 cggggcacgg tcacccccgc cgagtggatg gccaacctca tgagctcgct ggaggcggcg601 cggctcgacc cgtgcgaccc gcgccccgac gtcaaggtgg agtccgggtt cctcagcctc661 tacacctccg ccgacaagac gtgccgcttc ggcggcgccg ggagctgccg ggagcagctc721 ctccgcgagg tgtcccgcct cgtcgccgcc tactccggcg gcggcgagga cgtcagcgtc781 acgctcgccg gccacagcat gggcagcgcg ctggcgctcc tctccgccta cgacctcgcc841 gagctcggcc tcaaccgcgc cgccccggtc accgtcttct ccttcggcgg gccgagggtg901 gggaacgcgg cgttcaaggc gcgctgcgac gagctcggcg tcaaggcgct ccgcgtcacc961 aacgtacacg acccgatcac caagctcccc ggcgtcttcc tcaacgaggc caccgccggc1021 gtgctccgcc cgtggcgcca ctcctgctac acccacgtcg gcgtcgagct ccccctcgac1081 ttcttcaagg tcggcgacct cgcctccgtc cacgacctcg ccacctacat ctccctcctc1141 cgtggcgccg acaagaagca gcccgccgcc gccgccgccg acgccggcgg cgtgctcgcc1201 aaggtgatgg acttcgtggg tcggcggcgc ggcggcggcg cattgccgtg gcacgacgcg1261 gcgatgatac agatgggcgg cttggtgcag acgctcgggc taatctga
SEQ ID NO21 Met Thr Leu Pro Arg Gln Cys Ala Ala Ala Cys Arg Thr Gly Gly16Gly Gly Gly Gly Val Val Arg Cys Arg Ala Val Ala Ala Ala Gly31Gly Ala Val Ala Val Arg Asp Ala Val Val Ala Pro Val Ala Arg46Arg Gly Ala Ala Arg Lys Thr Ala Glu Thr Val Ala Gly Met Trp61Arg Glu Val Gln Gly Cys Gly Asp Trp Glu Gly Met Leu Glu Pro76Ala Pro His Pro Val Leu Arg Gly Glu Val Ala Arg Tyr Gly Glu91Leu Val Gly Ala Cys Tyr Lys Ala Phe Asp Leu Asp Pro Ala Ser106 Arg Arg Tyr Leu Asn Cys Lys Tyr Gly Arg Glu Arg Met Leu Glu121 Glu Val Gly Met Gly Gly Ala Gly Tyr Glu Val Thr Arg Tyr Ile136 Tyr Ala Ala Ala Asp Val Ser Val Pro Thr Met Glu Pro Ser Thr151 Ser Gly Arg Gly Arg Trp Ile Gly Tyr Val Ala Val Ser Thr Asp166 Glu Met Ser Arg Arg Leu Gly Arg Arg Asp Val Leu Val Ser Phe181 Arg Gly Thr Val Thr Pro Ala Glu Trp Met Ala Asn Leu Met Ser196 Ser Leu Glu Ala Ala Arg Leu Asp Pro Cys Asp Pro Arg Pro Asp211 Val Lys Val Glu Ser Gly Phe Leu Ser Leu Tyr Thr Ser Ala Asp226 Lys Thr Cys Arg Phe Gly Gly Ala Gly Ser Cys Arg Glu Gln Leu241 Leu Arg Glu Val Ser Arg Leu Val Ala Ala Tyr Ser Gly Gly Gly256 Glu Asp Val Ser Val Thr Leu Ala Gly His Ser Met Gly Ser Ala271 Leu Ala Leu Leu Ser Ala Tyr Asp Leu Ala Glu Leu Gly Leu Asn286 Arg Ala Ala Pro Val Thr Val Phe Ser Phe Gly Gly Pro Arg Val301 Gly Asn Ala Ala Phe Lys Ala Arg Cys Asp Glu Leu Gly Val Lys
316Ala Leu Arg Val Thr Asn Val His Asp Pro Ile Thr Lys Leu Pro331Gly Val Phe Leu Asn Glu Ala Thr Ala Gly Val Leu Arg Pro Trp346Arg His Ser Cys Tyr Thr His Val Gly Val Glu Leu Pro Leu Asp361Phe Phe Lys Val Gly Asp Leu Ala Ser Val His Asp Leu Ala Thr376Tyr Ile Ser Leu Leu Arg Gly Ala Asp Lys Lys Gln Pro Ala Ala391Ala Ala Ala Asp Ala Gly Gly Val Leu Ala Lys Val Met Asp Phe406Val Gly Arg Arg Arg Gly Gly Gly Ala Leu Pro Trp His Asp Ala421Ala Met Ile Gln Met Gly Gly Leu Val Gln Thr Leu Gly Leu Ile
權(quán)利要求
1.一種水稻花分生組織控制基因EG1編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻花分生組織控制基因EG1編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于所述氨基酸序列還包括在SEQ ID No2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸生成的衍生物。
3.一種編碼權(quán)利要求1或2所述蛋白質(zhì)的基因，其特征在于該基因具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述核苷酸序列還包括在SEQ ID No1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因或衍生物。
5.一種含有權(quán)利要求3或4所述基因的植物表達(dá)載體。
6.一種含有權(quán)利要求3或4所述基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
7.一種改良水稻花分生組織的方法，其特征在于包括用具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻花分生組織控制基因EG1編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了編碼上述蛋白質(zhì)的基因，其具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。本發(fā)明同時公開了含有上述基因的植物表達(dá)載體，以及含有上述基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。本發(fā)明還公開了改良水稻花分生組織的方法，包括用具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。本發(fā)明能對水稻花分生組織和花的發(fā)育進(jìn)行改良，最終能提高水稻產(chǎn)量。
文檔編號C12N15/29GK1911961SQ200610053180
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月28日
發(fā)明者錢前, 薛勇彪, 薛大偉, 李浩戈, 李美娜, 張光恒, 曾大力, 郭龍彪 申請人:中國水稻研究所