專利名稱：：綠膿假單胞菌iatso11血清型脂多糖(lps)特異性人單克隆抗體的制作方法綠膿假單胞菌IATSOil血清型脂多糖(LPS)特異性人單克隆抗體發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種綠膿假單胞菌IATSOil血清型特異性人單克隆抗體、產(chǎn)生該抗體的雜交瘤、編碼該抗體的核酸、和用該核酸轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。而且，本發(fā)明涉及產(chǎn)生所述單克隆抗體的方法。另外，本發(fā)明涉及包括至少一種抗體或至少一種編碼所述抗體的核酸的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：綠膿假單胞菌是一種發(fā)現(xiàn)于淡水和土壤的普遍存在的革蘭氏陰性環(huán)境細(xì)菌。它是一種典型的條件致病菌，通常不會(huì)對免疫力完整的宿主造成威脅，免疫力完整的宿主通過調(diào)理抗體和吞噬作用將其清除。但囊性纖維化患者和免疫缺失個(gè)體——包括燒傷患者、ICU中被插管的患者、癌癥和AIDS患者以及接受器官移植的患者——發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)特別高。在全部醫(yī)院內(nèi)感染中綠膿假單胞菌與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和萬古霉素耐藥腸球菌(VRE)所占的比例高達(dá)34%，醫(yī)院內(nèi)感染已經(jīng)從1975年的7.2/1000患者'天增加至1995年的9.8/1000患者'天。最經(jīng)常觀察到的醫(yī)院感染的形式是血流感染和肺炎。為防止囊性纖維化患者的慢性綠膿假單胞菌感染，已經(jīng)建立了用于主動(dòng)免疫的由結(jié)合有綠膿假單胞菌脫毒毒素A的綠膿假單胞菌的8種最相關(guān)的LPS血清型組成的八價(jià)結(jié)合疫苗。對該疫苗的長期研究已經(jīng)表明，18歲時(shí)臨床感染的患者的比例從約72%降低至32%。但是，主動(dòng)免疫接種僅對于免疫力完整的患者以及在可預(yù)測的情況下才是有可能進(jìn)行的。因此，大多數(shù)綠膿假單胞菌患者不能用八價(jià)疫苗進(jìn)行主動(dòng)免疫。由于這一點(diǎn)，并且由于大多數(shù)綠膿假單胞菌菌株耐受多種藥物這一事實(shí)，需要有一種可選擇的治療手段來治療綠膿假單胞菌感染患者。一種嘗試是通過經(jīng)典的雜交瘤技術(shù)或噬菌體展示抗體庫克隆來產(chǎn)生人單克隆抗體。這兩種方法及由此產(chǎn)生的抗體均表現(xiàn)出一些嚴(yán)重的缺陷。經(jīng)典的雜交瘤技術(shù)("Kohler和Milstein"方法)基于通過用選擇的抗原主動(dòng)免疫以及通過與骨髓瘤配體融合，從而產(chǎn)生具有所需特異性的鼠B細(xì)胞。之后，需要通過基因工程對產(chǎn)生抗體的克隆的基因信息進(jìn)行人源化，并在合適的表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生抗體。同樣，噬菌體展示抗體庫克隆需要復(fù)雜的抗體基因工程，并要建立合適的表達(dá)系統(tǒng)。己知針對細(xì)菌LPS的鼠單克隆抗體能識(shí)別與人抗體不同的表位。因此，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生單克隆抗體之后進(jìn)行人源化并非必然分離到其特異性與人類應(yīng)用相關(guān)的抗體。因此，IgM同種型抗體由于與IgM關(guān)聯(lián)的效應(yīng)器機(jī)制對于抗細(xì)菌免疫是最佳的，因而最為有效。但由于該分子復(fù)雜的五聚形式，迄今尚未實(shí)現(xiàn)IgM抗體的重組表達(dá)。因此，通過噬菌體展示技術(shù)分離的抗體的表達(dá)局限于IgM以外的同種型。作為另外的選擇方案，在產(chǎn)生綠膿假單胞菌LPS部分的人單克隆抗體方面進(jìn)行了不同的嘗試。但是，或是產(chǎn)生所述抗體的方法沒有優(yōu)勢(由于類淋巴母細(xì)胞的不穩(wěn)定性)，或是抗體表現(xiàn)出非人糖基化方式，或是需要非常大量的抗體。而且，現(xiàn)有技術(shù)中描述的許多抗體缺乏效應(yīng)器功能，從而不具保護(hù)性。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供一種對綠膿假單胞菌特定血清型的LPS特異的人單克隆抗體，其中該抗體表現(xiàn)出很高的保護(hù)能力，尤其是在體內(nèi)。人單克隆抗體解決的技術(shù)問題如下定義。根據(jù)本發(fā)明，提供了對綠膿假單胞菌IATSOil血清型的LPS特異的稱為lBOll的人單克隆抗體，其中該抗體輕鏈的可變區(qū)包括CDR1區(qū)中的SEQIDNO:1、CDR2區(qū)中的SEQIDNO:2和CDR3區(qū)中的SEQIDNO:3中的至少一個(gè)，并且其中該抗體重鏈的可變區(qū)包括CDR1區(qū)中的SEQIDNO:4、CDR2區(qū)中的SEQIDNO:5禾口CDR3區(qū)中的SEQIDNO:5中的至少一個(gè)；或者其能夠結(jié)合所述LPS的片段或衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步提供能夠產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤和分別編碼該抗體輕鏈和重鏈的核酸。而且，本發(fā)明提供包括該核酸的載體和宿主細(xì)胞。此外，提供了該單克隆抗體的生產(chǎn)方法。此外，提供了包括至少一種抗體和/或至少一種核酸的藥物組合物及其第二醫(yī)藥用途。出人意料地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的人單克隆抗體表現(xiàn)出很高的保護(hù)能力。特別是人單克隆抗體證實(shí)在體外是可調(diào)理吞噬作用的。更為重要的是，如實(shí)施例中所示，如通過在鼠燒傷模型中保護(hù)免受血流感染以及在小鼠急性肺感染模型中保護(hù)免受呼吸道感染確定，根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體表現(xiàn)出體內(nèi)保護(hù)能力，。與Collins等人描述的人單克隆抗體(CollinsMS等人，1990.FEMSIM64:263-268)相比，本發(fā)明的人單克隆抗體在低得多的劑量下實(shí)現(xiàn)調(diào)理吞噬作用，并且保護(hù)能力更高。與現(xiàn)有技術(shù)中所描述的單克隆抗體相比(HarrisonFJJ等人，1997.Hybridoma16(5):413-420;ZweerinkHJ等人，1988.InfectionandImmunity56(8):1873-1879)，根據(jù)本發(fā)明的人單克隆抗體進(jìn)一步從用結(jié)合疫苗主動(dòng)免疫的健康個(gè)體的血液中產(chǎn)生。通常已知，由于缺乏T細(xì)胞的輔助，針對多糖的抗體質(zhì)量非常低(即親和性低，效應(yīng)器能力很低)。僅通過使用結(jié)合疫苗，可以產(chǎn)生有價(jià)值的具有高活性、強(qiáng)效應(yīng)器能力的針對多糖靶標(biāo)的抗體。而且，與現(xiàn)有技術(shù)中所描述的單克隆抗體的產(chǎn)生速率相比(Zweerink等人，1988.InfectionandImmunity56(8):1873-1879)，根據(jù)本發(fā)明的人單克隆抗體的產(chǎn)生速率較高?，F(xiàn)有技術(shù)中沒有述及顯示對綠膿假單胞菌所致肺感染有保護(hù)能力的人單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明，抗體對綠膿假單胞菌IATSOil血清型具有特異性，并在低至0.1ng/ml的濃度下表現(xiàn)出調(diào)理吞噬的活性，如使用熒光-細(xì)菌結(jié)合物進(jìn)行測定。現(xiàn)有技術(shù)中沒有報(bào)道在該低劑量下表現(xiàn)調(diào)理吞噬活性的抗體。根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體以很高的特異性識(shí)別臨床分離株。使用該抗體識(shí)鑒別了18-20份感染IATSOil血清型綠膿假單胞菌的患者的標(biāo)本。不拘泥于任何理論，推測單克隆抗體能夠識(shí)別現(xiàn)有技術(shù)中已知的所有IATSOil綠膿假單胞菌株。這一特性使該抗體尤其適用于診斷和治療。因此，根據(jù)本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出難以超越的可靠性。本文所用的術(shù)語"人單克隆抗體"包括任何部分或完整的人單克隆抗體，不管單克隆抗體是從何來源獲得的。優(yōu)選通過雜交瘤產(chǎn)生人單克隆抗體。還可以通過基因工程得到單克隆抗體，尤其是通過將背景抗體的CDR區(qū)替換以權(quán)利要求中定義的特定CDR片段，將權(quán)利要求中定義的CDR片段CDR移植在市售的單克隆抗體上。術(shù)語"CDR區(qū)"是指抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)，即決定抗體對特定抗原的特異性的區(qū)域。輕鏈和重鏈上的3個(gè)CDR區(qū)(CDR1-CDR3)均對抗原結(jié)合具有重要作用。CDR區(qū)在重鏈中的位置如下CDR1區(qū)vh外顯子內(nèi)的氨基酸31-35，CDR2區(qū)vh外顯子內(nèi)的氨基酸50-65，CDR3區(qū)vh外顯子內(nèi)的氨基酸95和隨后的氨基酸。CDR區(qū)的位置不依賴于抗體類型，即IgG的IgM、IgA。CDR區(qū)在k輕鏈中的位置如下CDRA區(qū)Vx外顯子內(nèi)的氨基酸24-34，CDR2區(qū)Vx外顯子內(nèi)的氨基酸50-56，CDR3區(qū)Vx外顯子內(nèi)的氨基酸89和隨后的氨基酸。CDR區(qū)在人輕鏈中的位置如下CDR1區(qū)VX外顯子內(nèi)的氨基酸24-34，CDR2區(qū)VX外顯子內(nèi)的氨基酸50-56，CDR3區(qū)V人外顯子內(nèi)的氨基酸89和隨后的氨基酸。VH、禾BV人的氨基酸排列可以從Vbaseindex中得到(http:www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.phpmenu=901)。術(shù)語"血清型"是指綠膿假單胞菌的任何已知血清型。目前用于不同綠膿假單胞菌血清型的不同名稱的索引表顯示于說明書中的表I中。術(shù)語"片段"是指任何能夠結(jié)合LPS血清型的抗體片段。片段長度至少為IO個(gè)氨基酸，優(yōu)選20個(gè)，更優(yōu)選50個(gè)。優(yōu)選片段包括抗體的結(jié)合區(qū)。優(yōu)選片段為Fab或F(ab')2片段或其混合物。術(shù)語"衍生物"包括通過至少添加、缺失、和/或置換至少一個(gè)氨基酸改變的人單克隆抗體的任何突變蛋白。優(yōu)選地，衍生物為如下的人單克隆抗體突變蛋白其中突變蛋白在重鏈和/或輕鏈中的任意CDR中攜帶至少一個(gè)保守置換，如權(quán)利要求所示。更優(yōu)選，突變蛋白具有不多于5個(gè)保守置換，特別優(yōu)選不多于2個(gè)保守置換。抗體片段或衍生物結(jié)合特定LPS血清型的能力通過直接ELISA測定，如材料和方法章節(jié)中所描述將特定LPS固定在ELISA板的固相上。將抗體片段或抗體衍生物與固化的LPS—起孵育，結(jié)合的抗體或其衍生物通過合適的酶聯(lián)二抗進(jìn)行顯像。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"保守置換"是指將屬于特定物化類別的一個(gè)氨基酸替換成屬于相同物化類別的氨基酸。物化類別定義如下非極性氨基酸類別包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。具有不帶電極性側(cè)鏈的氨基酸類別包括天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸和胱氨酸。具有帶正電極性側(cè)鏈的氨基酸物化類別包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。具有帶負(fù)電極性側(cè)鏈的氨基酸物化類別包括天冬氨酸和谷氨酸，也稱為天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽。根據(jù)本發(fā)明，提供了上文概述的對綠膿假單胞菌IATSOll血清型的LPS特異的抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了對綠膿假單胞菌IATSOll血清型的LPS特異的人單克隆抗體，其中該抗體輕鏈的可變區(qū)具有氨基酸序列SEQIDNO:7，重鏈可變區(qū)具有氨基酸序列SEQIDNO:8;或者能夠結(jié)合所述LPS的所述抗體的變體，其中該抗體輕鏈氨基酸序列的可變區(qū)與SEQIDNO:7的同源性至少為85%,并且抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQIDNO:8的同源性至少為85%。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的術(shù)語"同源性"是指兩種或多種多肽分子之間的關(guān)聯(lián)程度，其通過序列之間的一致性來確定。從兩個(gè)或多個(gè)序列中同源區(qū)的百分比來發(fā)現(xiàn)"同源性"百分比，并考慮空隙或其它序列特征?；ハ嚓P(guān)聯(lián)的多肽的同源性可以通過己知方法測定。通常，使用特殊的計(jì)算機(jī)程序，其具有考慮到特殊要求的算法。優(yōu)選地，測定同源性的步驟首先在所考察的序列之間產(chǎn)生最大的一致性。測定兩段序列之間的同源性的計(jì)算機(jī)程序包括，但不限于，GCG程序包，其包括GAP(DevereuxJ等人，NucleicAcidsResearch]2(12):387(1984);GeneticsComputerGroupUniversityofWisconsin,Madison(WI);BLASTP,BLASTN和FASTA(AtschulS等人，J.Molec.Biol.215:403-410(1990))。BLASTX禾呈序可以獲自NationalCentreforBiotechnologyInformation(NCBI)和其它來源(BLASTHandbook,AltschulS等人，NCBNLMNIHBethesdaMD20894;AltschulS等人，J.Mol.215:403-410(1990))。還可以使用公知的SmithWaterman算法來測定同源性。序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括以下算法Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48(1970)，443-453比較矩陣BLOSUM62，出自Henikoff&Henikoff,PNASUSA89(1992),10915-10919空隙罰分12空隙長度罰分2GAP程序也適于使用上述參數(shù)。上述參數(shù)是氨基酸序列比較的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)(缺省參數(shù))，其中末端處的空隙不會(huì)降低同源性的數(shù)值。與參比序列對比的序列非常小時(shí)，需要進(jìn)一步將預(yù)期值增加至100,000，在某些情況下是將字長(字節(jié)長度)降低至2。可以使用其它模型算法、空隙開放罰分、空隙延伸罰分和比較矩陣，其包括1997年9月的ProgramHandbook,WisconsinPackage,第9版中所命名的那些。選擇將取決于將要進(jìn)行的對比，并進(jìn)一步取決于對比是否在序列對之間進(jìn)行，這時(shí)優(yōu)選GAP或BestFit,還是在一個(gè)序列和大的序列數(shù)據(jù)庫之間進(jìn)行，這時(shí)優(yōu)選FASTA或BLAST。上述算法測得一致性為85%則被稱作同源性85%。更高程度的同源性同樣適用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白的同源性為85%或更高，例如，高于90%或95%。進(jìn)一步優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的人抗克隆抗體的輕鏈?zhǔn)莐型或X型的。特別優(yōu)選地，輕鏈?zhǔn)莐型的。輕鏈可以是天然存在的鏈包括(天然重排的)、基因修飾或合成型的輕鏈。如果根據(jù)本發(fā)明的對IATSOll特異的抗體是k型的，則優(yōu)選輕鏈源自種系DPK18(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIG畫ENTS.phpmenu=901#VKEX)。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的人單克隆抗體的重鏈選自所有的人同種型，即IgM、IgA或IgG。優(yōu)選地，重鏈為IgM型。如果抗體是IgM型的，則其表現(xiàn)出對綠膿假單胞菌LPS親和力高，與補(bǔ)體有效結(jié)合，從而介導(dǎo)直接殺滅細(xì)菌和/或有效地調(diào)理細(xì)菌被吞噬的有利特性。而且，IgM能耐受綠膿假單胞菌彈性蛋白酶的蛋白溶解降解作用，而其它同種型如IgG或IgA則可以被降解。IgM抗體在很小的量下即有效。在鼠燒傷創(chuàng)面膿毒癥模型中l(wèi)-4ng/鼠是完全有保護(hù)性的。優(yōu)選可變重鏈源自種系DP-53(http:〃www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.phpmenu=901#VKEX)。輕鏈和重鏈可以共價(jià)連接成單鏈抗體(例如二價(jià)scFv、雙功能scFv和雙特異性scFv)，或者彼此非共價(jià)連接。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，人單克隆抗體完全由人氨基酸序列組成。"完全由人氨基酸序列組成"是指人單克隆抗體的氨基酸序列源自人生殖種系。這可以通過不同方式來實(shí)現(xiàn)。例如，由人氨基酸序列組成的人單克隆抗體可以通過雜交瘤獲得，其中B-細(xì)胞是人B-細(xì)胞?？蛇x的方案是，人單克隆抗體可以通過將如權(quán)利要求所示的CDR區(qū)CDR移植到市售的人單克隆抗體上獲得，從而產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的對綠膿假單胞菌LPS血清型特異的人單克隆抗體。人單克隆抗體完全是人氨基酸序列避免了有害副作用如排斥反應(yīng)或過敏性休克的發(fā)生。進(jìn)一步優(yōu)選地，人單克隆抗體表現(xiàn)為基本上識(shí)別人抗原。"基本上識(shí)別人抗原"是指根據(jù)本發(fā)明的人單克隆抗體的抗原識(shí)別基本上等同于人類健康個(gè)體的抗原識(shí)別。具體來說，這要求人單克隆抗體輕鏈和重鏈的Fc部分是人型的，以保證與人免疫系統(tǒng)的相互作用，并降低產(chǎn)生所謂HAMA(人抗鼠抗體)的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的人單克隆抗體是從人B-細(xì)胞或者將所述人B-細(xì)胞與骨髓瘤或雜合骨髓瘤細(xì)胞融合得到的雜交瘤獲得的。人B-細(xì)胞可以通過如下方法得到將健康個(gè)體或患者進(jìn)行免疫，隨后抽取血液標(biāo)本中，從中可通過已知方式分離B-細(xì)胞(CurrentProtocolsinImmunology.Chapter7.1.Isolationofwholemononuclearcellsfromperipheralbloodandcordblood.Wiley&sons出版，JCColigan等人編著)。通過根據(jù)經(jīng)典Kohler和Milstein方法的已知技術(shù)，可以將人B-細(xì)胞與骨髓瘤或雜合骨髓瘤(heteromyeloma)融合，產(chǎn)生雜交瘤。合適的骨髓瘤是P3X63的衍生物如P3X53Ag8.653(ATCCCRL-1580)或SP2/0(ATCCCRL-1646)。生成的雜交瘤可以根據(jù)已知方法進(jìn)行選擇。將雜交瘤在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，從上清液中回收產(chǎn)生的抗體。而且，本發(fā)明提供了分別編碼本發(fā)明的人單克隆抗體的輕鏈和重鏈的核酸。核酸可以是源自種系或者B-細(xì)胞中發(fā)生重排的天然核酸?？蛇x的方案是，核酸可以是合成的。合成核酸還包括具有修飾的核苷酸間連接(包括硫代磷酸酯)以增加核酸對降解的耐受性的核酸。核酸可以通過基因工程產(chǎn)生，或者完全通過核苷酸合成來人工制成。本發(fā)明進(jìn)一步提供如下載體其包括至少一種編碼本發(fā)明人單克隆抗體輕鏈的核酸和/或至少一種編碼本發(fā)明人單克隆抗體重鏈的核酸。核酸可以存在于同一載體中，或者可以雙元載體的形式存在。載體優(yōu)選地包括與核酸可操作地連接以促進(jìn)編碼輕鏈和/或重鏈的核酸表達(dá)的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，載體還包括用于在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和維持的起始點(diǎn)。載體也可包括位于編碼輕鏈和/或重鏈的核酸5'的編碼信號(hào)序列的核苷酸序列。信號(hào)序列可以促進(jìn)所編碼的鏈分泌至培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，載體源自腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、SV40病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、植物病毒或細(xì)菌噬菌體例如、衍生物或M13。特別優(yōu)選的載體是含有人Ig重鏈和人輕鏈的恒定區(qū)的載體，例如Persic等人描述的用于免疫球蛋白真核表達(dá)的聯(lián)合載體系統(tǒng)(Persic等人，1997.Gene.187(1):9-18)。載體可以進(jìn)一步包括編碼His-標(biāo)記的核苷酸序列，從而表達(dá)一種構(gòu)建物以產(chǎn)生特定的融合產(chǎn)物，該融合產(chǎn)物在人單克隆抗體輕鏈和/或重鏈的N端處具有His-標(biāo)記，這有助于在鎳柱上通過螯合物的形成來純化蛋白質(zhì)。而且，本發(fā)明提供了包括載體和/或適合于表達(dá)該載體的核酸的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域中已知有許多種原核和真核表達(dá)系統(tǒng)，其中優(yōu)選真核宿主細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如HEK293-細(xì)胞、PerC6-細(xì)胞、CHO-細(xì)胞、COS-細(xì)胞或HELA-細(xì)胞及其衍生物。特別優(yōu)選人生產(chǎn)細(xì)胞系。優(yōu)選轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞將產(chǎn)生的抗體分泌至培養(yǎng)基中。如果實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，則根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行復(fù)性，所述方法例如BenettiPH等人，ProteinExprPurifAug;13:283-290,(1998)。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生人單克隆抗體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過培養(yǎng)上述的雜交瘤產(chǎn)生人單克隆抗體。產(chǎn)生的單克隆抗體分泌到上清液中，并通過采用傳統(tǒng)色譜技術(shù)從其中純化。可選的方案是，人單克隆抗體由包括根據(jù)本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞產(chǎn)生，并將宿主細(xì)胞在適合于編碼的抗體鏈的重組表達(dá)的條件下培養(yǎng)。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞包括至少一種編碼輕鏈的核酸和至少一種編碼重鏈的核酸，并且能夠組裝人單克隆抗體，使得產(chǎn)生的三維結(jié)構(gòu)與人-B細(xì)胞產(chǎn)生的人單克隆抗體的三維結(jié)構(gòu)相同。如果輕鏈獨(dú)立于重鏈產(chǎn)生，則可以純化兩條鏈，隨后將其組裝，產(chǎn)生基本上具有人B-細(xì)胞所產(chǎn)生的人單克隆抗體的三維結(jié)構(gòu)的人單克隆抗體。人單克隆抗體也可通過所編碼輕鏈和/或重鏈的重組表達(dá)獲得，其中通過以已知方式分離編碼人單克隆抗體的核酸，將編碼權(quán)利要求中定義的CDR的核酸序列移植在分離的核酸上，從而產(chǎn)生核酸。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的人單克隆抗體是被修飾的。修飾包括單體形式的二聚、低聚或聚合，例如，通過使用二環(huán)己基碳化二亞胺進(jìn)行交聯(lián)。由此產(chǎn)生的二聚體、低聚體或聚合物可以通過凝膠過濾彼此分離。進(jìn)一步修飾包括側(cè)鍵修飾，例如，s-氨基-賴氨酸殘基的修飾，或者氨基和羧基端的分別修飾。進(jìn)一步修飾包括翻譯后修飾，例如，蛋白的糖基化和/或部分或全部去糖基化，以及二硫鍵的形成?？贵w也可與標(biāo)記物如酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記或放射性同位素標(biāo)記相結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括至少一種人單克隆抗體和/或至少一種編碼人單克隆抗體輕鏈和/或重鏈的核酸的藥物組合物。藥物組合物可以進(jìn)一步包括本領(lǐng)域已知的制藥學(xué)可接受的成分。優(yōu)選地，藥物組合物用于治療綠膿假單胞菌感染引起的疾病，例如血流感染、肺炎、慢性支氣管炎、局部感染，其包括創(chuàng)口感染和關(guān)節(jié)侵襲性感染，主要見于免疫受損患者和/或呼吸功能受損的患者。藥物組合物進(jìn)一步用于，但不限于，預(yù)防和/或治療醫(yī)院內(nèi)獲得性(醫(yī)院內(nèi))感染。由于綠膿假單胞菌感染的主要受害者是囊性纖維化患者、燒傷受害者、插管患者、手術(shù)室和/或重癥監(jiān)護(hù)室中的患者、癌癥和AIDS患者、免疫受損的患者、免疫抑制的患者、糖尿病患者，以及靜脈內(nèi)藥物濫用者，藥物組合物尤其適用于預(yù)防和/或治療所述類型患者中綠膿假單胞菌所致的疾病。藥物組合物可以進(jìn)一步包括抗生素藥物，優(yōu)選與新的單克隆抗體抄厶知口o藥物組合物包括濃度范圍為0.1-30mg/kg體重的新的單克隆抗體。藥物組合物可以通過任何已知方式給藥，例如經(jīng)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、局部、鼻內(nèi)給藥，或者吸入噴霧給藥。本發(fā)明還提供用于診斷綠膿假單胞菌感染的檢測試劑盒，其包括至少一種本發(fā)明的人單克隆抗體，任選進(jìn)一步包括甩于進(jìn)行診斷檢測的合適成分。檢測試劑盒適用于綠膿假單胞菌感染的特異性可靠診斷。測定試驗(yàn)可以基于液相或膜結(jié)合形式的傳統(tǒng)ELISA試驗(yàn)。如本領(lǐng)域所知，檢測可以是直接或間接的，其中抗體任選地結(jié)合有酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記或放射性同位素標(biāo)記。以下實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，但并非要限制本發(fā)明的范閨。當(dāng)閱讀說明書并參考公知常識(shí)時(shí)，其它實(shí)施方案對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。圖1涉及l(fā)BOll重鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列。圖2涉及l(fā)BOllk輕鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列。圖3a涉及單克隆抗體lBOll對IATSOil血清型的臨床綠膿假單胞菌分離株的識(shí)別圖譜。圖3b涉及單克隆抗體lBOll對其它血清型的臨床綠膿假單胞菌分離物的識(shí)別圖譜，與對所述其它血清型特異的單克隆抗體進(jìn)行比較。與lBOll的結(jié)合通過全細(xì)胞ELISA檢測。圖4涉及單克隆抗體lBOll針對綠膿假單胞菌IATSOil血清型的調(diào)理吞噬活性。圖5涉及單克隆抗體lBOll在小鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)。lBOll的體內(nèi)保護(hù)能力在鼠燒傷創(chuàng)面膿毒癥模型中進(jìn)行驗(yàn)證。將不同劑量的lBOll通過腹腔注射或靜脈注射給予NMRI小鼠。顯示了免疫激發(fā)3天后的生存率。圖6涉及單克隆抗體lBOll在小鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)。肺感染之后lBOll介導(dǎo)從肺和脾中清除綠膿假單胞菌的能力在小鼠急性肺感染模型中進(jìn)行驗(yàn)證。在使用綠膿假單胞菌進(jìn)行肺感染之前將lBOll經(jīng)靜脈注射給藥。感染之后的6、12、24和48小時(shí)，檢驗(yàn)肺和脾中的荷菌量。圖7涉及單克隆抗體lBOll的補(bǔ)體活化。圖中顯示了體外試驗(yàn)的結(jié)果，該試驗(yàn)測定了將1B011與人正常血清混合時(shí)的補(bǔ)體成分C4d的生成情況。產(chǎn)生的C4d通過ELISA進(jìn)行檢測。檢測兩種不同的血清濃度100嗎/mg和10嗎/ml的兩批lBOll。單獨(dú)為血清的對照物記為0[ig/ml。具體實(shí)施方式材料和方法實(shí)施例中使用如下材料和方法。測定細(xì)胞上清液中的LPS-特異性和對IgM定量為了對細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的抗體進(jìn)行篩選和分析，如他處所述進(jìn)行ELISA(Cryz，S.J.等人，1987.J.Clin.Invest.80(1):51-56)，并加以一些變化。簡言之，制備綠膿假單胞菌脂多糖(自制)LPS儲(chǔ)存液，其濃度為在2mg/ml(在36mM三乙胺中)。為進(jìn)行涂層，將溶液在含有0.02X疊氮化鈉(PBS-Az)的PBS中稀釋至10jig/ml。通過將該溶液與等體積IO嗎/ml甲基化人血清白蛋白(HSA;如下自制將2g凍干的HSA溶解在200ml無水甲醇中。加入1.68ml37.%HC1后，將溶液在室溫下在暗處、間或振蕩的條件下存儲(chǔ)至少3天。通過10min離心(4500rpm，GS1轉(zhuǎn)子)收集沉淀物，通過將沉淀團(tuán)懸浮在溶劑中，將其用無水甲醇洗滌兩次，用無水乙醚洗滌兩次。將沉淀在干燥器中干燥2小時(shí)，干燥的沉淀團(tuán)懸浮在H20中，以等份形式存儲(chǔ)于-20"C下。蛋白濃縮物為8.05mg/ml)在PBS-Az中混合，在室溫下輕輕攪拌5分鐘。將NUNC⑧ELISA板涂以100pl/孔LPS-HSA溶液，在室溫下過夜。將板用300pipH7.4的含有0.05%Tween20(#93773;FlukaChemieAQSwitzerland)的PBS(PBS-T)(自制)洗滌3次之后，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液在PBS中k2稀釋，在37'C下孵育2小時(shí)。將板用PBS-T洗滌3次之后，用含有5%(v/v)FCS的在PBS中1:2000稀釋的辣根過氧化物酶-交眹的羊抗人IgM抗體(#074-1003;KPL;Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc.Gaithersburg，MD)來檢測結(jié)合的抗體。將板在37°C下孵育1小時(shí)，用PBS-T洗滌3次。通過以100^/孔加入含有0.0012%(V/V)11202底物溶液的OPD(在24mM檸檬酸和52mM磷酸氫二鈉中的0.4mg/ml鄰苯二胺)，對抗體的結(jié)合進(jìn)行顯色。2-3分鐘后以50pi/孔加入1MHC1來終止顯色反應(yīng)。使用SoftmaxPro⑧軟件在ELISA讀數(shù)器上讀取490nm下的光密度。為了對細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的IgM進(jìn)行定量，將ELISA板涂以1[ig/ml未交聯(lián)羊抗人IgM抗體/PBS，在4。C下過夜。將板用PBS-T洗滌3次，將細(xì)胞上清液和標(biāo)準(zhǔn)品以2倍稀釋液進(jìn)，孵育。使用起始濃度為0.5嗎/ml的標(biāo)準(zhǔn)人血清(Behring)作為標(biāo)準(zhǔn)品。所有稀釋液均使用PBS-T來完成。將板在振動(dòng)臺(tái)上在室溫下孵育2小時(shí)。將板用PBS-T洗滌3次后，用在含有5%(Wv)FCS的PBS中以1:2000稀釋的辣根過氧化物酶-交聯(lián)的羊抗人IgM抗體(KPL)檢測結(jié)合的抗體。將板在振動(dòng)臺(tái)上在室溫下孵育1小時(shí)，用PBS-T洗滌3次。以150pl/孔加入OPD底物溶液，對抗體、的結(jié)合進(jìn)行顯色。1分鐘后以50nl/孔加入1MHC1終止顯色反應(yīng)。使用SoftmaxPro⑧軟件在ELISA讀數(shù)器上讀取490nm下的光密度。序列分析使用獲自Qiagen的RNeasy-試劑盒分離雜交瘤鉀胞的RNA。通過SMART技術(shù)(BectonDickenson)合成cDNA。對于第二條鏈的PCR，使用如下引物(表III):(1)IgM反向恒定區(qū)(con:5，陽GCCACGCTGCTCGTATCCGACG-3，(SEQIDNO:11);(2)k反向恒定區(qū)(conk):5，-AGCAGGCACACAACAGAGGCAGTTCC畫3，(SEQIDNO:12)。正向引物包括在SMART-試劑盒中。為進(jìn)行測序，使用以下引物(3)IgM序列(n序列)5,-GCTGCTCGTATCCGACGG-3，(SEQIDNO:13)和(4)Kappa序列(k序列):5,-CACAACAGAQGCAGTTCC-3,(SEQIDNO:14)。測序在MicrosynthAG(Balgach,Switzerland)上進(jìn)斗亍，并4吏用V-BaseDNAplot軟件(http:〃www.mrc-cpe.cam.ac.uk/DNAPLOT.phpmenu=901)將序列與現(xiàn)有種系的序列進(jìn)行比較。表I綠膿假單胞菌IATS血清型參考菌株IATS血清型說明01PA53(IT4)02E576(IT3)036510(Habs3)046511(Habs4)06PA220(IT1)07Fisher6(IT6)O10Fisher5(IT5)011Fisher2(IT2)016Fisher7(IT7)表II綠膿假單胞菌IATSOil血清型的臨床分離株分離株編號(hào)分離株來源2309.36尿2309.38耳2309.58血2309.60尿2309.61尿2309.65氣管分泌物2310.49尿2310.55血2311.58氣管分泌物2312.25氣管分泌物V02610膽囊VA1014耳VA26939月巿(BAL)VA28/1創(chuàng)面VA2813創(chuàng)面VA3348月市(BAL)VA3805眼VA4156/1創(chuàng)面VA695創(chuàng)面VA843氣管分泌物FT-2參考菌株全細(xì)胞ELISA將來自不同臨床分離株(見表II)的細(xì)菌在Luria肉湯培養(yǎng)基中在37X:下培養(yǎng)至600nm下的光密度為1，并用37%福爾馬林(福爾馬林最終濃度0.5X)在37i:下固定過夜。將固定的細(xì)菌以PBS1:50稀釋，并在ELISA板上固定化。將板用含有5%(v/v)胎牛血清封閉后，將單克隆抗體lBOll與固定的細(xì)菌一起在37"C下孵育2小時(shí)?？蛇x的方案是，對其它血清型的分離株進(jìn)行上述培養(yǎng)，并與單克隆抗體lBOll孵育，或者與對各個(gè)血清型特異的單克隆抗體孵育(圖3b，血清型特異的陽性對照單克隆抗體，統(tǒng)稱為"陽性對照")作為陽性對照。將板用PBS-T洗滌3次以后，用在含有5%(v/v)FCS的PBS中1:2000稀釋的辣根過氧化物酶-交聯(lián)的羊抗人IgM抗體(#074-1003;KPL;Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc.Gaithersburg,MD)來檢觀!j結(jié)合的抗體。將板在37t:下孵育1小時(shí)，用PBS-T洗滌3次。通過以100/孔加入含有0.0012%(V/V)H202底物溶液的OPD(在24mM檸檬酸和52mM磷酸氫二鈉中的0.4mg/ml鄰苯二胺)，對抗體的結(jié)合進(jìn)行顯色。2-3分鐘后以50^/孔加入1MHC1來終止顯色反應(yīng)。使用SoftmaxPro⑧軟件在ELISA讀數(shù)器上讀取490nm下的光密度。調(diào)理吞噬作用測定為了測定生物活性，對單克隆抗體IBOII的調(diào)理吞噬活性進(jìn)行檢測。為此目的，將根據(jù)表I的綠膿假單胞菌IATSOll血清型在TSBG(30g/l含有l(wèi)。/。(w/v)葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉湯)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將細(xì)菌用冷PBS洗滌兩次之后，將細(xì)菌沉淀團(tuán)重新懸浮在5m10.1M的碳酸氫鹽緩沖液中，加入pH8.0的50[il5-沐-6)-羧酸熒光素、琥珀酰亞胺基酯(5(6)-FAM,SE;MolecularProbes,Eugene,OR;二甲亞砜中10mg/ml)，在37'C下孵育1小時(shí)。加入100|il37%福爾馬林將細(xì)菌固定，在37t:下孵育過夜。為去除未結(jié)合的染料，通過將在20ml冷無菌PBS中的再懸浮液離心，將細(xì)菌洗滌6次。將標(biāo)記的細(xì)菌在4"C下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。為進(jìn)行檢測，將等份細(xì)菌稀釋至550nm下的光密度為1，然后以HBSS-BSA(含有0.1BSA的Hanks平衡鹽溶液)進(jìn)行1:50稀釋。將20細(xì)菌分別與10jal含有單克隆抗體lBOll的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的不同稀釋液，或與非特異性單克隆對照抗體混合。在37。C下孵育30分鐘后，加入10pl仔兔血清(CharlesRiverLaboratories,Germany)作為補(bǔ)體源，將探針在37。C下繼續(xù)孵育30分鐘。向受調(diào)理的細(xì)胞中加入40pi分化的HL-60細(xì)胞(通過將細(xì)胞在添加了10%(v/v)胎牛血清和100mM二甲基甲酰胺的IscovesModifiedDulbecco，s培養(yǎng)基(IMDM;Sigma)中孵育，前髓細(xì)胞細(xì)胞系HL-60分化成粒細(xì)胞)，得到的最終濃度為1.25乂106細(xì)胞/匕在振蕩器上在37。C下孵育90分鐘后，轉(zhuǎn)移至2ml細(xì)胞沖洗緩沖液(含有0.02%(v/v)疊氮化物的PBS;BectonDickenson)收獲細(xì)胞。在250xg下離心5分鐘之后，將細(xì)胞沉淀團(tuán)重新懸浮在150pl細(xì)胞沖洗緩沖液中，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。通過與背景染色對比分析HL-60細(xì)胞的綠色熒光來檢測陽性的調(diào)理吞噬活性。通過將熒光素結(jié)合的細(xì)菌在存在補(bǔ)體的條件下與HL-60細(xì)胞孵育，測定背景染色。感染綠膿假單胞菌的小鼠的體內(nèi)保護(hù)小鼠燒傷創(chuàng)面模型1B011的體內(nèi)保護(hù)能力在鼠燒傷創(chuàng)面膿毒癥模型中進(jìn)行測定。NMRI-小鼠(18-20g;CharlesRiverLaboratories)在免疫激發(fā)之前的4小時(shí)靜脈內(nèi)接受0.16-10(ig(對應(yīng)于大約0.4-0.006mg/kg體重)體積為0.1ml的單克隆抗體lBOll。作為對照，注射O.lml非特異性抗體上清液。為進(jìn)行免疫激發(fā)，將每組IO只的雌鼠用1大氣壓的3-氯-1,1，2-三氟乙基-二氟甲基醚(Ethrane,AbbottLab.,Chicago,IL)麻醉。對小鼠背部2cm2的部位進(jìn)行10秒乙醇灼燒。將懸浮在0.5mlPBS中的激發(fā)生物體(綠膿假單胞菌IATSOll;臨床分離株2310.55，見表2)以2xl07cfu/鼠立刻皮下注射到燒傷部位中。對動(dòng)物觀察7天。作為保護(hù)作用的指標(biāo)，顯示了免疫激發(fā)3天后的生存率。急性肺感染模型為了評價(jià)lBOll針對綠膿假單胞菌感染的保護(hù)能力，使用急性肺感染模型。將10嗎(0.4mg/kg)1B011靜脈下注射給BALB/c小鼠。之后，在深度麻醉下使用彎的珠頭針(bead-tippedneedle)將40pl4.0xl()7/ml菌株2310.55(表2)的溶液(對應(yīng)于1.6乂106/鼠)經(jīng)氣管內(nèi)應(yīng)用于左下支氣管。選取該劑量是由于其僅引起很低的死亡率。在6、12、24和48小時(shí)之后，將小鼠處死，在無菌條件下摘除肺和脾。將器官懸浮在3mlPBS中，用攪拌器在冰上勻漿45秒。將連續(xù)稀釋的組織勻漿(0.1ml)在ModifiedConradiDrigalski's瓊脂上點(diǎn)板，測定CFU/肺或CFU/脾。測定單克隆抗體活化的經(jīng)典補(bǔ)體途徑為了測定下游進(jìn)程中形成的IgM-聚集體最終自行觸發(fā)的經(jīng)典補(bǔ)體途徑，將預(yù)定濃度的1B011抗體在37'C下在來自健康捐贈(zèng)者的血清中孵育30分鐘。然后在10mMEDTA中終止反應(yīng)，補(bǔ)體活化片段C4d通過市售的ELISA(QuidelCorp,SanDiego)進(jìn)行檢測。作為陽性對照，使用由1B011抗體及其同族LPS抗原組成的IgM-抗原復(fù)合物。實(shí)施例實(shí)施例l:lBOll的DNA和氨基酸序列抗體特異性分別通過DNA-和氨基酸序列測定。測定重鏈和輕鏈的可變片段的DNA序列。簡言之，分離雜交瘤細(xì)胞的總RNA，并用SMART技術(shù)(BectonDickinson)將其逆轉(zhuǎn)錄到完整的cDNA中。通過該方法，在cDNA的5'端加上通用引物。使用該引物和表III中所述的Ck和Cp-特異性引物，通過PCR對IgM和k可變區(qū)和部分恒定區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。然后通過從瓊脂凝膠中切除，獲得PCR片段，作為用表m所述引物測序的模板。表III<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>隨后將可變區(qū)的序列與VbaseIndex比較。與種系序列比較的結(jié)果表示為"置換和沉默"突變數(shù)(R:S)，如表IV所示。DNA序列和氨基酸序列描繪于圖l和圖2。表IV<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例2:單克隆抗體lBOll對綠膿假單胞菌IATSOil血清型臨床分離株的識(shí)別通過將健康志愿者用八價(jià)OPS-ToxinA疫苗免疫，產(chǎn)生lBOll。疫苗含有IATSOil參考株FT-2。為了研究針對該菌株LPS產(chǎn)生的lBOll是否也會(huì)識(shí)別IATSOil血清型的其它分離株，從不同醫(yī)院中收集了大量的臨床分離株(見表2)。所有分離株的血清型使用市售的血清型凝集試劑盒測定。通過PCR確認(rèn)血清型。然后通過全細(xì)胞ELISA對IATSOil血清型(圖3a)以及其它血清型(圖3b)的不同臨床分離株進(jìn)行IBOII結(jié)合試驗(yàn)。除由于這些分離株表面上LPS的低表達(dá)產(chǎn)生的兩個(gè)弱反應(yīng)之外，]BOll與所有被檢測的IATSOil分離株均呈強(qiáng)烈反應(yīng)。而且，只有在IATSOil血清型中觀察到結(jié)合，在Ol、02、03、06或O10血清型的多種分離株中均沒有發(fā)生結(jié)合。使用針對各個(gè)血清型的其它單克隆抗體作為陽性對照，以確保這些分離株的完整性。實(shí)施例3:lBOll的體外活性調(diào)理吞噬活性使用基于流式細(xì)胞術(shù)的調(diào)理吞噬作用測定評價(jià)lBOll的體外生物學(xué)活性。將FITC-結(jié)合的綠膿假單胞菌IATSOil血清型與連續(xù)稀釋的lBOll在正常家兔血清作為補(bǔ)體源的情況下孵育。經(jīng)調(diào)理的細(xì)胞與分化的HL-60細(xì)胞孵育(前髓細(xì)胞系，ATCC:CCL-240;加入0.1M二甲基甲酰胺，3天完成向單核細(xì)胞的分化)。通過FACS分析調(diào)理吞噬作用。通過與背景染色(在不存在血清但存在補(bǔ)體的情況下HL-60細(xì)胞和FITC-結(jié)合細(xì)胞的染色)對比分析HL-60細(xì)胞的綠色熒光來測定陽性調(diào)理吞噬活性。結(jié)果示于表4。1B011介導(dǎo)的綠膿假單胞菌IATSOil血清型的吞噬作用是劑量依賴方式的(實(shí)心圓圈)。如果使用熱滅活的補(bǔ)體，則觀察不到吞噬作用(空心圓圈)。1B011的調(diào)理吞噬活性(OA5())定義為導(dǎo)致FITC-陽性HL-60細(xì)胞的半數(shù)最大百分比的濃度，其為O.lng/ml。如此低劑量下的活性表明lBOll的效應(yīng)器能力很高。實(shí)施例4:單克隆抗體lBOll的體內(nèi)保護(hù)能力lBOll的體內(nèi)保護(hù)能力在鼠燒傷創(chuàng)面膿毒癥模型中進(jìn)行驗(yàn)證。將不同劑量的lBOll腹腔或靜脈內(nèi)給予NMRI小鼠。3小時(shí)后，造成2x2cm的燒傷創(chuàng)面，在燒傷的皮膚部位皮下注射2x107CFU綠膿假單胞菌菌株2310.55(011)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中小鼠施以麻醉。監(jiān)控生存情況每天3次。免疫激發(fā)后3天的生存率顯示于圖5。包括了來自4項(xiàng)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(標(biāo)記為A-D)的綜合數(shù)據(jù)。劑量>0.2mg/kg體重對70-100%的假單胞菌全身激發(fā)產(chǎn)生了保護(hù)作用。給藥劑量減少導(dǎo)致生存率降低。死亡是假單胞菌感染的直接結(jié)果，因?yàn)橛袩齻麆?chuàng)面但未感染假單胞菌的小鼠生存率為100%。這些數(shù)據(jù)證明了lBOll在體內(nèi)針對綠膿假單胞菌全身感染的功效。實(shí)施例5:急性呼吸系統(tǒng)激發(fā)之后細(xì)菌從肺和脾的清除增加為了評價(jià)lBOll是否能夠清楚呼吸系統(tǒng)的綠膿桿菌感染，使用小鼠急性肺感染模型。為此目的，在用綠膿假單胞菌株2310.55進(jìn)行氣管內(nèi)肺激發(fā)之前，靜脈內(nèi)給予lBOll(0.4mg/kg體重)。選取該激發(fā)劑量僅是為了達(dá)到最小的死亡率。之后，選擇細(xì)菌從肺中的清除率作為評價(jià)參數(shù)。應(yīng)用lBOll能夠迅速地將綠膿假單胞菌從肺中清除(圖6)。這一發(fā)現(xiàn)是出人意料的，因?yàn)镮gM抗體一般不會(huì)滲透入肺組織中。48小時(shí)后細(xì)菌被完全清除，而這時(shí)在未經(jīng)處理的動(dòng)物中感染仍在迸行。與人綠膿假單胞菌肺炎的進(jìn)程類似，細(xì)菌感染可發(fā)展成為全身性的，在該實(shí)驗(yàn)中反映為脾中出現(xiàn)綠膿假單胞菌。全身感染的完全消退由1B011介導(dǎo)的，而未經(jīng)處理的小鼠中仍存在細(xì)菌(圖6)。這些結(jié)果說明了lBOll具有治療呼吸系統(tǒng)綠膿假單胞菌感染如醫(yī)院性肺炎的能力。實(shí)施例6:單克隆抗體IBOII對人的組織的交叉反應(yīng)性為了排除不希望發(fā)生的1B011與人組織的非特異性結(jié)合，根據(jù)"FDAPointstoConsiderintheManufactureandTestingofMonoclonalAntibodyProductsforHumanUse(FDA對用于人的單克隆抗體產(chǎn)品的制造和檢測的觀點(diǎn))(1997)"和"TheRulesGoverningMedicinalProductsintheEuropeanCommunity(歐盟醫(yī)藥產(chǎn)品管理?xiàng)l例)Vol.3a(1994)"對IBOII進(jìn)行交叉反應(yīng)性檢測。所用的組織列于下表。組織均獲自3名不相關(guān)的捐贈(zèng)者，以盡量減小捐贈(zèng)者的特殊因素對抗體結(jié)合的影響。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>內(nèi)膜)*僅有來自一名捐贈(zèng)者的組織可用沒有觀察到與這些組織中任一個(gè)的交叉反應(yīng)性(數(shù)據(jù)未顯示)?；谶@些結(jié)果，似乎不會(huì)在體內(nèi)發(fā)生非特異性結(jié)合，因此引起的炎性副作用很小。實(shí)施例7:單克隆抗體lBOll的補(bǔ)體活化體內(nèi)給予的人抗體可以通過補(bǔ)體的自發(fā)活化引起不良反應(yīng)。這種經(jīng)典補(bǔ)體途徑的活化可以通過體外試驗(yàn)來檢測，該體外試驗(yàn)測定當(dāng)lBOll與人正常血清混合時(shí)補(bǔ)體成分C4d的生成情況并通過市售的EUSA(QuidelCorp.，SanDiego)來檢測C4d。在GMP條件下產(chǎn)生兩批次1B011(稱為"第1批"和"第2批")，以在血清中的不同濃度(100pg/ml和10pg/ml)來進(jìn)行檢驗(yàn)。單獨(dú)血清的對照物記為0jug/ml。結(jié)果顯示于圖7。在血清中1B011沒有觸發(fā)C4d的自發(fā)生成(白色條)，而在存在10pg/ml綠膿假單胞菌IATS011血清型LPS的情況下產(chǎn)生了水平很高的C4d(黑色條)。這些結(jié)果表明，當(dāng)用于人時(shí)，lBOll表現(xiàn)的自發(fā)性炎性副作用的程度將是最小的。權(quán)利要求1.一種對綠膿假單胞菌LPSIATSO11血清型的脂多糖(LPS)特異的人單克隆抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)具有氨基酸序列SEQIDNO7，重鏈的可變區(qū)具有氨基酸序列SEQIDNO8；或者能夠結(jié)合所述LPS的所述抗體的變體，其中所述抗體輕鏈的可變區(qū)的氨基酸序列與SEQIDNO7的同源性至少為85％，并且所述抗體重鏈的可變區(qū)的氨基酸序列與SEQIDNO8的同源性至少為85％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人單克隆抗體，其中所述的輕鏈?zhǔn)荎型的。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人單克隆抗體，其中所述的輕鏈?zhǔn)侨诵偷摹?.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體，其中所述的重鏈?zhǔn)荌gM、IgA或IgG型的。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人單克隆抗體，其中所述的重鏈?zhǔn)荌gM型的。6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體，其中所述的抗體完全由人氨基酸序列組成。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體，其中所述抗體表現(xiàn)為基本上是識(shí)別人抗原的。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體，其中所述抗體是N-端、內(nèi)部、和/或C-端修飾的。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的人單克隆抗體，其中所述修飾選自低聚、和與藥物和/或標(biāo)記物結(jié)合中的至少一種。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體，其是從人B-細(xì)胞、或者是所述人B-細(xì)胞與骨髓瘤或雜合骨髓瘤細(xì)胞融合得到的雜交瘤獲得的。11.一種雜交瘤，其能夠產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-7或10中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體。12.—種核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-7或10中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體的輕鏈。13.—種核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-7或10中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體的重鏈。14.一種載體，其包括至少一種編碼權(quán)利要求12所述輕鏈的核酸和/或至少一種編碼權(quán)利要求13所述重鏈的核酸。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的載體，其中所述載體還包括與所述核酸可操作連接以促進(jìn)其表達(dá)的啟動(dòng)子。16.—種宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求14所述的載體和/或權(quán)利要求12或13所述的核酸。17.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1-7或10中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體的方法，其包括將權(quán)利要求11所述的雜交瘤在使其分泌抗體的條件下培養(yǎng)，或者將權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞在適合其表達(dá)人單克隆抗體的條件下培養(yǎng)，和任選地包括從培養(yǎng)物上清液中純化所述的抗體。18.—種藥物組合物，其包括至少一種權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體和/或至少一種權(quán)利要求12或13所述的核酸，和任選地包括制藥學(xué)可接受的成分。19.權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體和/或權(quán)利要求12或13所述的核酸在預(yù)防和/或治療人患者綠膿假單胞菌感染中的用途。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，其中所述的綠膿假單胞菌感染是醫(yī)院內(nèi)獲得性感染。21.—種用于診斷標(biāo)本中綠膿假單胞菌感染的試驗(yàn)試劑盒，其包括至少一種權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體和/或至少一種權(quán)利要求12或13所述的核酸，并任選地進(jìn)一步包括進(jìn)行診斷試驗(yàn)的合適成分。全文摘要本發(fā)明涉及一種對綠膿假單胞菌IATSO11血清型特異的人單克隆抗體、產(chǎn)生其的雜交瘤、其編碼核酸、以及用其轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。而且，本發(fā)明涉及產(chǎn)生所述單克隆抗體的方法。此外，本發(fā)明涉及包括至少一種抗體或至少一種編碼所述抗體的核酸的藥物組合物。文檔編號(hào)C12N15/79GK101120018SQ200680004847公開日2008年2月6日申請日期2006年2月13日優(yōu)先權(quán)日2005年2月14日發(fā)明者A·B·朗,A·齊歇爾,M·A·英博登,M·P·霍恩申請人:肯塔生物技術(shù)有限公司