專利名稱：牙齒的制造方法、牙齒的集合體及組織的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牙齒的制造方法、牙齒的集合體及組織的制造方法，尤其 涉及采用細(xì)胞的牙齒的制造方法、牙齒的集合體及組織的制造方法。
背景技術(shù)：
牙齒是一種器官，具有在最外層有釉質(zhì)、在其內(nèi)層有象牙質(zhì)這樣的硬 組織，另外，在其內(nèi)側(cè)具有產(chǎn)生象牙質(zhì)的象牙芽細(xì)胞，在中心部具有齒髓， 有時因齲蝕或牙周病等而失去。 一般，關(guān)于牙齒的損失，由于認(rèn)為對生命 的危懼小，所以現(xiàn)在主要多通過鑲牙或嵌植來彌補。但是，牙齒的有無對 外觀或食物的味覺有較大影響，此外從維持健康或維持高質(zhì)量的生活的觀 點考慮，提高了對開發(fā)牙齒再生技術(shù)的關(guān)心。
牙齒，是通過胎兒期的生成過程的誘導(dǎo)而形成的，由多種細(xì)胞種構(gòu)筑 的機能單位，認(rèn)為與器官或內(nèi)臟相同。因此，牙齒，如果不通過從成體內(nèi) 的造血干細(xì)胞或間充質(zhì)系干細(xì)胞這樣的干細(xì)胞生成細(xì)胞種的干細(xì)胞系統(tǒng) 生成，而是只通過再生醫(yī)療進行的干細(xì)胞移入(干細(xì)胞移入療法)，現(xiàn)在 還不能再生牙齒。此外，還考慮同定在牙齒的生成過程中特異發(fā)現(xiàn)的遺傳 因子，人為地誘導(dǎo)牙胚的牙齒的再生，但如果只特定遺傳因子，不能完全 誘導(dǎo)牙齒的再生。
因此，近年來，研究的中心是，再構(gòu)成采用離析的牙胚細(xì)胞的牙胚， 然后移植該再構(gòu)成牙胚，從而再生牙齒。
例如，在非專利文獻l中，公開了通過將從牙胚離析的上皮系細(xì)胞或 間充質(zhì)系的齒囊細(xì)胞等細(xì)胞，與生物體吸收性的載體一同移植到老鼠的腹 腔內(nèi)，再生牙齒組織的方法。
此外，在非專利文獻2中，記載了作為可實現(xiàn)下一代的培養(yǎng)細(xì)胞的上 皮一間充質(zhì)相互作用的系統(tǒng)，利用膠原凝膠的共培養(yǎng)是有效的方法。
作為牙胚的再生方法，例如，在專利文獻l中，記載了在纖維芽細(xì)胞 增殖因子等生理活性物質(zhì)的存在下培養(yǎng)牙胚細(xì)胞。此外，在專利文獻2中， 提出了與含有血纖維蛋白的載體一同培養(yǎng)牙胚細(xì)胞及可在這些細(xì)胞中分 化的細(xì)胞中的至少l種。此處，含有血纖維蛋白的載體，使用牙胚目標(biāo)形 狀的載體，形成具有特有形態(tài)的"牙齒"形成。
在專利文獻3及4中，記載了從6個月的豬的下顎骨，將含有形成象
牙質(zhì)的源自齒髓的間充質(zhì)系細(xì)胞和有助于釉形成的上皮系細(xì)胞的牙胚的 細(xì)胞混合物，播種到由聚乙二醇酸-聚醋酸共聚物構(gòu)成的使生物分解性聚合
物固化的載體(Scafford)中，移植到動物體內(nèi)，形成牙齒的方法。此處， 載體記載為使用牙胚目標(biāo)形狀的載體，形成具有特有形態(tài)的"牙齒"。
另一方面，在專利文獻5中，公開了用于治療骨損壞或損傷的患者的 牙齒再生方法。根據(jù)該方法，在將間充質(zhì)系細(xì)胞播種在聚乙二醇酸網(wǎng)式載 體中后，通過與膠原一同重疊或用上皮細(xì)胞片包覆上皮系細(xì)胞，可形成骨。 另外，在專利文獻5中，為構(gòu)筑骨的形狀采用了載體。
非專利文獻1: J. Dent. Res" 2002, Vol.81(10), pp.695-700
非專利文獻2:"牙齒及采用源自牙胚細(xì)胞的再生醫(yī)療及其可能性"，
再生醫(yī)療，日本再生醫(yī)療學(xué)會雜志，2005年，Vol.4(l)， pp.79-83
專利文獻l:特開2004—331557號公報
專利文獻2:特開2004—357567號公報
專利文獻3:美國專利申請公開第二 002 / 0119180號公報
專利文獻4:美國專利申請公開第二 004 / 0219489號公報
專利文獻5:國際公開第二 005 / 014070號小冊子
但是，要作為組織發(fā)揮作用，必須將構(gòu)成組織的多種細(xì)胞配置(細(xì)胞 配置)在適當(dāng)?shù)南鄬ξ恢?，具有作為組織的方向性。組織，例如牙齒，是 來源自牙胚的上皮系細(xì)胞和來源自頭部神經(jīng)堤細(xì)胞的間充質(zhì)系細(xì)胞在分 化生成過程中相互作用而生成的一個"內(nèi)臟"或"器官"，如果原狀移植 牙胚，就能生成正常的牙齒，但只通過單一分離培養(yǎng)由多種細(xì)胞構(gòu)成的牙 胚細(xì)胞，不能再生具有作為牙齒功能單位的特征的細(xì)胞配置及方向性的牙 齒。
所述技術(shù)都采用細(xì)胞或細(xì)胞因子等進行牙胚的再構(gòu)筑，但不能再現(xiàn)可 發(fā)現(xiàn)作為牙齒的良好功能的特征的細(xì)胞配置或方向性。
此外，如果只通過單一地離析培養(yǎng)構(gòu)成組織的多個細(xì)胞，很難再構(gòu)筑 具備特有細(xì)胞配置的組織。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是，提供一種保持特有的細(xì)胞配置的牙齒的制造 方法及用此方法制造的牙齒的集合體以及牙周組織的制造方法。
此外，本發(fā)明的另一目的是，提供一種保持特有的細(xì)胞配置的組織的 制造方法。
本發(fā)明的牙齒的制造方法，其特征在于，包含以下工序?qū)嵸|(zhì)上只 由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的任何一方構(gòu)成的第一細(xì)胞集合體、和實 質(zhì)上只由任何另一方構(gòu)成的第二細(xì)胞集合體接觸配置的工序，其中，間充 質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的至少任何一方是源自牙胚；和在所述支乘載體 的內(nèi)部培養(yǎng)所述第一及第二細(xì)胞集合體的工序。
本發(fā)明的牙周組織的制造方法，其特征在于，包括以下工序?qū)嵸|(zhì) 上只由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的任何一方構(gòu)成的第一細(xì)胞集合體、 和實質(zhì)上只由任何另一方構(gòu)成的第二細(xì)胞集合體接觸配置的工序，其中， 間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的至少任何一方是源自牙胚；在所述支乘載 體的內(nèi)部，培養(yǎng)所述第一及第二細(xì)胞集合體，直到得到牙齒和與其連續(xù)的 牙周組織的工序；和離析通過所述培養(yǎng)得到的牙周組織的工序。
一種牙齒的集合體，其特征在于，所述牙齒是通過以下工序得到的， 即，在支乘載體的內(nèi)部，將實質(zhì)上只由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的任 何一方構(gòu)成的第一細(xì)胞集合體、和實質(zhì)上只由任何另一方構(gòu)成的第二細(xì)胞 集合體接觸配置的工序，其中間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞至少任何一方是 源自牙胚；和在所述支乘載體的內(nèi)部培養(yǎng)所述第一及第二細(xì)胞集合體的工 序。
在所述兩制造方法或牙齒的集合體中，優(yōu)選，所述第一細(xì)胞集合體及 第二細(xì)胞集合體都是源自牙胚。
此外，此處，所述第一細(xì)胞集合體及第二細(xì)胞集合體也可以都是單一 細(xì)胞集合體。
此外，本發(fā)明的組織的制造方法，是通過間充質(zhì)系細(xì)胞和上皮系細(xì)胞 的相互作用構(gòu)筑的組織的制造方法，其特征在于，包括以下工序在支乘 載體的內(nèi)部，將實質(zhì)上只由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的任何一方構(gòu)成 的第一細(xì)胞集合體、和實質(zhì)上只由任何另一方構(gòu)成的第二細(xì)胞集合體接觸 配置的工序；和在所述支乘載體的內(nèi)部培養(yǎng)所述第一及第二細(xì)胞集合體的 工序。
在上述組織的制造方法中，優(yōu)選，所述間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中 的至少一方，是源自成為目標(biāo)的組織的細(xì)胞。
此外，上述組織，其特征在于，是從由牙齒、毛發(fā)、腎臟、肺、肝臟 構(gòu)成的組中選擇。
在本發(fā)明中，由于相互接觸地在支乘載體的內(nèi)部配置、培養(yǎng)實質(zhì)上只 由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞集合體，所以細(xì)胞集合體相互間 不會與構(gòu)成另一方的細(xì)胞集合體的細(xì)胞混合，在支乘載體中一邊維持相互 接觸的狀態(tài)一邊發(fā)育。由此，可有效地再現(xiàn)在形成組織時需要的間充質(zhì)系 細(xì)胞及上皮系細(xì)胞的良好的相互作用。
結(jié)果，能夠制作目標(biāo)組織中具有特有的細(xì)胞配置的組織。此外，通過 將間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞的至少一方規(guī)定為源自牙胚，能夠制作具備 外側(cè)具有釉質(zhì)、內(nèi)側(cè)具有象牙質(zhì)這樣的特有的細(xì)胞配置的牙齒及牙齒的集 合體。
根據(jù)本發(fā)明，可提供一種保持特有的細(xì)胞配置的牙齒的制造方法及用 此方法制造的牙齒的集合體以及牙周組織的制造方法。
此外，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種保持組織特有的細(xì)胞配置的組織的 制造方法。


圖1是模式地表示牙胚的形成的概念圖。
圖2 (A) (D)是概念表示本發(fā)明的實施例中的采用源自牙胚的間 充質(zhì)系細(xì)胞和上皮系細(xì)胞的牙胚再構(gòu)筑的順序的圖示。
圖3是本發(fā)明的比較例1的正常牙胚組織的相位差顯微鏡圖像及染色 圖像、和腎皮膜下移植該正常牙胚時形生成的牙齒的時效染色圖像。
圖4是由本發(fā)明的實施例1的源自牙胚的上皮組織和源自牙胚的間充 質(zhì)系細(xì)胞形成的再構(gòu)成牙胚的相位差顯微鏡圖像、和腎皮膜下移植該再構(gòu) 成牙胚時生成的牙齒的時效染色圖像。
圖5是由本發(fā)明的實施例1的源自牙胚的上皮組織和源自GFP小鼠牙 胚的間充質(zhì)系細(xì)胞形成的再構(gòu)成牙胚的相位差顯微鏡圖像、和腎皮膜下移 植該再構(gòu)成牙胚時生成的牙齒的第十四天的染色圖像。
圖6是由本發(fā)明的實施例2的源自GFP小鼠牙胚的上皮系細(xì)胞和源自 牙胚的間充質(zhì)組織形成的再構(gòu)成牙胚的相位差顯微鏡圖像、和腎皮膜下移 植該再構(gòu)成牙胚時生成的牙齒的第十四天的染色圖像。
圖7是由本發(fā)明的實施例3的源自牙胚的上皮系細(xì)胞和源自牙胚的間 充質(zhì)系細(xì)胞形成的再構(gòu)成牙胚的相位差顯微鏡圖像、和腎皮膜下移植該再 構(gòu)成牙胚時生成的牙齒的第十四天的染色圖像。
圖8是本發(fā)明的比較例2的源自牙胚的上皮組織及源自牙胚的間充質(zhì) 組織的相位差顯微鏡圖像、和單獨腎皮膜下移植其各自時的第十四天的染 色圖像。
圖9是采用本發(fā)明的比較例3的源自牙胚的上皮組織和源自牙胚的間 充質(zhì)系細(xì)胞的低密度再構(gòu)成牙胚的相位差顯微鏡圖像、和腎皮膜下移植該 低密度再構(gòu)成牙胚時生成的牙齒的第二 0天的染色圖像。
圖10是不區(qū)分地高密度再構(gòu)成本發(fā)明的比較例4的源自牙胚的上皮 組織和源自牙胚的間充質(zhì)系細(xì)胞時的再構(gòu)成牙胚的相位差顯微鏡圖像、和 腎皮膜下移植該低密度再構(gòu)成牙胚時生成的牙齒的第二 0天的染色圖像。
圖11是在由本發(fā)明的實施例1 3的再構(gòu)成牙胚生成的牙齒的周圍形 成的牙周組織即牙槽骨和牙根膜的染色圖像。
圖12是在由本發(fā)明的實施例2 (移植后第十七天)和比較例1 (移植 后第十四天)的再構(gòu)成牙胚生成的牙齒的周圍形成的牙周組織即牙根膜中 檢測出特異的periostinmRNA的染色圖像。
圖13是在本發(fā)明的實施例4及5和比較例5的再構(gòu)成牙胚制作后延 長培養(yǎng)工序，通過器官培養(yǎng)生成的牙齒的相位差顯微鏡圖像和染色圖像。
圖14是由本發(fā)明的實施例6的源自牙胚的上皮系細(xì)胞和源自牙胚的 間充質(zhì)系細(xì)胞形成的再構(gòu)成牙胚的相位差顯微鏡圖像、和腎皮膜下移植該
再構(gòu)成牙胚時生成的牙齒的第十四天的染色圖像。
圖15 (A)是本發(fā)明的比較例6的非移植小鼠的拔牙后第十四天的染 色圖像、(B)是(A)中的框內(nèi)放大圖。
圖16是本發(fā)明的實施例6的單個分離的牙胚移植到口腔內(nèi)后第十四 天的染色圖像。
圖17是本發(fā)明的實施例6的單個分離的牙齒移植到口腔內(nèi)后第十四 天的染色圖像。
圖18是由本發(fā)明的實施例8的源自絲胞組織的上皮系細(xì)胞和源自絲 胞組織的間充質(zhì)系細(xì)胞形成的再構(gòu)成絲胞的相位差顯微鏡圖像、和腎皮膜 下移植該再構(gòu)成絲胞時生成的毛的第十四天的染色圖像。
圖19是腎皮膜下移植由本發(fā)明的實施例8的源自絲胞組織的上皮系 細(xì)胞和源自絲胞組織的間充質(zhì)系細(xì)胞形成的再構(gòu)成絲胞時生成的毛的第 十四天的實態(tài)顯微鏡照片。
圖20是由本發(fā)明的比較例7的源自絲胞組織的上皮系細(xì)胞和源自絲 胞組織的間充質(zhì)系細(xì)胞形成的再構(gòu)成絲胞的相位差顯微鏡圖像、和腎皮膜 下移植該再構(gòu)成絲胞時生成的絲胞的第十四天的染色圖像。
圖中IO —凝膠部分(支乘載體)，12 —細(xì)胞凝集塊(第一細(xì)胞集合 體)，14一細(xì)胞凝集塊(第二細(xì)胞集合體)，16—吸管。
具體實施例方式
本發(fā)明的牙齒的制造方法，包括將實質(zhì)上只由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮 系細(xì)胞中的任何一方構(gòu)成的第一細(xì)胞集合體、和實質(zhì)上只由任何另一方構(gòu) 成的第二細(xì)胞集合體接觸配置的工序，其中，間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞 中的至少任何一方是源自牙胚(配置工序)；在所述支乘載體的內(nèi)部培養(yǎng) 所述第一及第二細(xì)胞集合體的工序(培養(yǎng)工序)。
在本制造方法中，由于在支乘載體的內(nèi)部，作為細(xì)胞集合體，使至少 任何一方是源自牙胚的間充質(zhì)系細(xì)胞和上皮系細(xì)胞接觸地發(fā)育，所以能夠 通過緊密的接觸狀態(tài)有效地再現(xiàn)細(xì)胞間相互作用，能夠制造具備內(nèi)側(cè)具有 象牙質(zhì)、外側(cè)具有釉質(zhì)這樣的牙齒特有的細(xì)胞配置的牙齒。
在本發(fā)明中，所謂"牙齒"，說的是在內(nèi)側(cè)連接地具備象牙質(zhì)層、在
外側(cè)連接地具備釉質(zhì)層的組織，具體指的是具備這些層結(jié)構(gòu)且具備具有牙 冠或牙根的方向性的組織。象牙質(zhì)及釉質(zhì)，對于該行業(yè)者，容易通過組織 染色等從形式上特定。此外，釉質(zhì)可通過釉芽細(xì)胞的存在特定，釉芽細(xì)胞 的存在可通過無卵發(fā)育的有無確認(rèn)。另一方面，象牙質(zhì)可通過象牙芽細(xì)胞 的存在特定，象牙質(zhì)芽細(xì)胞的存在可通過牙質(zhì)唾液腺蛋白質(zhì)的有無確認(rèn)。 無卵發(fā)育及牙質(zhì)唾液腺蛋白質(zhì)的確認(rèn)容易用該領(lǐng)域眾所周知的方法實施， 例如，可列舉原地雜交、抗體染色等。
此外，牙齒的方向性可通過牙冠或牙根的配置特定。牙冠或牙根，可 基于形狀或組織染色等通過目視確認(rèn)。
此外，在本發(fā)明中，所謂"牙周組織"，指的是主要形成于牙齒的外 層的牙槽骨及牙根膜。牙槽骨及牙根膜，對于該行業(yè)者，容易通過組織染 色等從形式上特定。
另外，在本發(fā)明中，所謂"間充質(zhì)系細(xì)胞"，指的是原子間充質(zhì)組織 的細(xì)胞，所謂"上皮系細(xì)胞"，指的是源自上皮組織的細(xì)胞。
在本發(fā)明中，所謂"牙胚"及"齒芽"，是對于在后述的生成階段區(qū) 別的內(nèi)容特別說明時所用的表示。所謂此時的"牙胚"是決定了將來形成
牙齒的牙齒初期胚，是在牙齒的生成階段從一般所用的蕾狀期(Bud stage) 到鐘狀期(Bell stage)的階段，尤其是未出現(xiàn)作為牙齒硬組織的特征即象 牙質(zhì)、釉質(zhì)的蓄積的組織，所謂"齒芽"，是本發(fā)明所用的"牙胚"的階 段轉(zhuǎn)移，從牙齒硬組織的特征即象牙質(zhì)、釉質(zhì)的蓄積開始的階段，牙齒從 齒肉萌芽， 一般指的是發(fā)現(xiàn)作為牙齒的功能之前的階段的組織。
牙胚，如圖1所示，在個體生成的過程中，經(jīng)由蕾狀期、帽狀期、鐘 狀前期及后期的各工序進行。此處，在蕾狀期，上皮系細(xì)胞為了包覆間充 質(zhì)系細(xì)胞而陷入(參照圖1 (A)及(B))，如果到達(dá)鐘狀前期及鐘狀后期， 上皮系細(xì)胞部分成為外側(cè)的釉質(zhì)，間充質(zhì)系細(xì)胞部分在內(nèi)部形成象牙質(zhì) (參照圖1 (C)及(D))。因此，通過上皮系細(xì)胞和間充質(zhì)系細(xì)胞的細(xì)胞 間相互作用形成牙胚。
本發(fā)明中的間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞，只要是形成牙胚或具有形成 牙胚的可能性的從所述蕾狀期到鐘狀后期的細(xì)胞(以下簡稱為"牙胚") 就可以，從細(xì)胞的分化階段的幼若性和均質(zhì)性的觀點出發(fā)，優(yōu)選是從蕾狀 期到帽狀期的細(xì)胞。
此外，所謂"細(xì)胞集合體"，指的是細(xì)胞密集的狀態(tài)，可以是組織的 狀態(tài)，也可以是單一細(xì)胞的狀態(tài)。此外，所謂"實質(zhì)上"，指的是盡量不 含對象細(xì)胞以外的細(xì)胞。各個細(xì)胞集合體，由于可規(guī)定為組織本體或其一 部、或單一細(xì)胞的集合體，因此也可以是任何一方由單一細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞 集合體，也可以是都由單一細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞集合體，但為了通過本發(fā)明高 效率地完成組織的再構(gòu)成，優(yōu)選都由單一細(xì)胞構(gòu)成。
第一細(xì)胞集合體和第二細(xì)胞集合體，也可以都是上皮系細(xì)胞及間充質(zhì) 系細(xì)胞，構(gòu)成該細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)因動物的種類、或支乘載體的種類、 硬度及大小而異，但每1個細(xì)胞集合體一般為1(^ 1()S個，優(yōu)選為103 108個。
在配置工序中，在支乘載體的內(nèi)部，接觸配置第一細(xì)胞集合體和第二 細(xì)胞集合體。
在本發(fā)明的制造方法的配置工序中，由于在可保持細(xì)胞的接觸狀態(tài)的 支乘載體的內(nèi)部配置所述第一及第二細(xì)胞集合體，因此構(gòu)成各個細(xì)胞集合 體的細(xì)胞不會與構(gòu)成另一方的細(xì)胞集合體的細(xì)胞混合。如此在配置工序 中，由于不混合地配置各細(xì)胞集合體，所以可在細(xì)胞集合體間形成邊界線。 在本說明書中將如此的配置形態(tài)適宜表示為"區(qū)分化"。
此處，第一細(xì)胞集合體和第二細(xì)胞集合體，可通過個別的調(diào)制工序(第 一細(xì)胞調(diào)制工序及第二細(xì)胞調(diào)制工序)調(diào)制，以實質(zhì)上由間充質(zhì)系細(xì)胞及 上皮系細(xì)胞構(gòu)成。
本制造方法所用的間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞，為了再現(xiàn)生物體內(nèi)的 細(xì)胞配置，有效地形成具有特有的結(jié)構(gòu)及方向性的牙齒，只要至少任何一 方是源自牙胚的細(xì)胞就可以，但為了確實形成牙齒，更優(yōu)選間充質(zhì)系細(xì)胞 及上皮系細(xì)胞都是源自牙胚。
作為源自牙胚以外的間充質(zhì)系細(xì)胞，可列舉出源自生物體內(nèi)的其它間 充質(zhì)系組織的細(xì)胞，優(yōu)選不含血液細(xì)胞的骨髄細(xì)胞或間充質(zhì)系干細(xì)胞，更 優(yōu)選源自口腔內(nèi)間充質(zhì)系細(xì)胞或顎骨的內(nèi)部的骨髄細(xì)胞、頭部神經(jīng)堤細(xì)胞 的間充質(zhì)系細(xì)胞、可生出所述間充質(zhì)系細(xì)胞的間充質(zhì)系前軀細(xì)胞或其干細(xì) 胞等。
此外，作為源自牙胚以外的上皮系細(xì)胞，可列舉出源自生物體內(nèi)的其 它上皮系組織的細(xì)胞，優(yōu)選皮膚或口腔內(nèi)的粘膜或牙肉的上皮系細(xì)胞，更 優(yōu)選皮膚或粘膜等可生出分化的，例如角化的、或內(nèi)錯角化的上皮系細(xì)胞 的未成熟的上皮系前軀細(xì)胞，例如非角化上皮系細(xì)胞或其干細(xì)胞等。
牙胚及其它的組織，可從哺乳動物的靈長類，例如人、猴等，有蹄類， 例如豬、牛、馬等，小型哺乳類的啃齒類，例如小鼠、鼠、兔子等多種動 物的顎骨等采取。牙胚及組織的采取，通?？芍钢苯討?yīng)用組織采取所用的 條件，可以以無菌狀態(tài)取出，保存在適當(dāng)?shù)谋４嬉褐?。另外，作為人的?胚，除第三大臼齒所謂智齒的牙胚以外，可列舉胎兒牙胚，但從利用自家 組織的觀點考慮，優(yōu)選采用智齒牙胚。
從該牙胚的間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞的調(diào)制，首先可通過根據(jù)形狀 將從周圍的組織離析的牙胚分成牙胚間充質(zhì)組織及牙胚上皮組織來進行。 此時，由于牙胚組織可在顯微鏡下從結(jié)構(gòu)上區(qū)分，因此能夠容易通過用解 剖用剪子或小鑷子等切斷、或剝離來分離。此外，牙胚間充質(zhì)組織及牙胚 上皮組織從牙胚組織的分離，容易依據(jù)其形狀，通過用注射針、鉤針、小 鑷子等切斷或剝離來進行。
優(yōu)選，為了易于從周圍組織分離牙胚細(xì)胞，及/或從牙胚組織分離上 皮組織及間充質(zhì)組織，也可以采用酶。作為用于如此用途的酶，可列舉分 散酶、膠原酶、胰蛋白酶等。
間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞，也可以分別從間充質(zhì)組織及上皮組織以 單一細(xì)胞的狀態(tài)調(diào)制。在調(diào)制工序中，為了易于在單一細(xì)胞中分散，也可 以采用酶。作為此種酶，可列舉分出散酶、膠原酶、胰蛋白酶等。此時， 優(yōu)選，在上皮系細(xì)胞從上皮組織的分離中，在膠原酶處理后進行胰蛋白酶
處理和DNase處理。另外，優(yōu)選，在間充質(zhì)系細(xì)胞從間充質(zhì)組織的分離中， 同時用膠原酶和胰蛋白酶處理，最終進行DNase處理。之所以此時進行 DNase處理，是為了防止酶處理部分細(xì)胞受損，防止因細(xì)胞膜溶解時向溶 液中放出的DNA而使細(xì)胞凝集，進而降低細(xì)胞的回收量。
另外，間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞，為了得到充分的細(xì)胞數(shù)，也可以 分別在配置工序之前，經(jīng)過預(yù)備培養(yǎng)。間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞的培養(yǎng)， 一般可直接采用動物細(xì)胞的培養(yǎng)所用的溫度等條件。
作為培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基， 一般可釆用動物細(xì)胞的培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，
例如FCS改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)等，也可以添加用于促進細(xì)胞增殖 的血清，也可以作為血清的代替物添加例如FGF、 EGF、 PDGF等細(xì)胞增 殖因子或鐵傳遞蛋白等已知的血清成分。另外，添加血清時的濃度，可根 據(jù)此時的培養(yǎng)狀態(tài)適宜變更，但通常為10%。對于細(xì)胞的培養(yǎng)，可采用在 通常的培養(yǎng)條件下的，例如在37t:的溫度下，在5%0)2濃度的恒溫箱內(nèi) 的培養(yǎng)。此外，也可以適宜添加鏈霉素等抗生物質(zhì)。
作為本發(fā)明所用的支乘載體，只要可在內(nèi)部培養(yǎng)細(xì)胞就可以，優(yōu)選是 與所述培養(yǎng)基的混合物。作為如此的支乘載體，可列舉出膠原、血纖維蛋 白、昆布寧、細(xì)胞外母質(zhì)混合物、聚乙二醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、 乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)、泡孔母質(zhì)(商品名)、美比奧爾(乂 e才 一A)凝膠(商品名)、馬托利(7卜y )凝膠(商品名)等。這些支乘 載體，只要具有在將細(xì)胞配置在內(nèi)部時可大致維持配置位置的程度的硬度 就可以，可列舉凝膠狀、纖維狀、固體狀的載體。此處，所謂可維持細(xì)胞 的位置的硬度，通常，只要是能夠保持作為三維培養(yǎng)應(yīng)用的硬度，即能保 持細(xì)胞的配置，同時不妨礙增殖形成的肥大化的硬度就可以，很容易確定。 例如，在是膠原時，使用最終濃度為2.4mg / ml的濃度就可提供適當(dāng)?shù)挠?度。
另外，此處，支乘載體，只要具有能夠在載體內(nèi)部發(fā)育第一及第二細(xì) 胞集合體的程度的厚度就可以，可根據(jù)作為目標(biāo)的組織的尺寸等適宜設(shè) 定。
此外，支乘載體只要可保持細(xì)胞的接觸狀態(tài)就可以，但此處所述的"接 觸狀態(tài)"，為在各細(xì)胞集合體，此外在細(xì)胞集合體間確實使細(xì)胞相互作用， 優(yōu)選是高密度的狀態(tài)。
所謂高密度的狀態(tài)，指的是與構(gòu)成組織時的密度的同等程度的密度， 例如，在細(xì)胞集合體時，在配置細(xì)胞時為5乂107 1乂109個/1111，為了不 損失細(xì)胞的活性，確實使細(xì)胞相互作用，優(yōu)選1X10S lXl(^個/ml，更 優(yōu)選2Xl()S 8X10S個/ml的密度。為了將細(xì)胞集合體調(diào)制到如此的細(xì) 胞密度，同時為了不損失細(xì)胞活性地簡便地進行高密度化，優(yōu)選通過離心 使細(xì)胞凝集，實現(xiàn)沉淀化。這樣的離心，只要以不有損細(xì)胞生存的適合
300 1200Xg、優(yōu)選500 1000Xg的離心力的旋轉(zhuǎn)數(shù)進行3 10分鐘就 可以。如果離心低于300Xg，有時細(xì)胞的沉淀不充分，細(xì)胞密度降低，另 一方面，如果離心高于1200Xg，有時細(xì)胞受損，因此高低都不優(yōu)選。
在通過離心分離調(diào)制高密度的細(xì)胞的情況下，通常，只要在細(xì)胞離心 分離所用的管等容器內(nèi)，在調(diào)制好單一細(xì)胞的懸濁液后進行離心分離，殘 存作為沉淀物的細(xì)胞，盡量除去上清液就可以。此時使用的管等容器，從 完全除去上清液的觀點出發(fā)，優(yōu)選是涂敷了硅的容器。
在規(guī)定為通過離心分離得到的沉淀物的情況下，只要將沉淀物直接配 置在支乘載體的內(nèi)部就可以。此時，優(yōu)選目標(biāo)細(xì)胞以外的成分(例如，培 養(yǎng)液、緩沖液、支乘載體等)在與細(xì)胞容量的等量以下，更優(yōu)選不含目標(biāo) 細(xì)胞以外的成分。如果是如此的高密度的細(xì)胞集合體，細(xì)胞緊密接觸，可 有效地發(fā)揮細(xì)胞間相互作用。
在以組織的狀態(tài)使用的情況下，優(yōu)選通過進行酶處理等除去成為對象 的細(xì)胞以外的結(jié)合組織等。在目標(biāo)細(xì)胞以外的成分多的情況下，例如如果 達(dá)到與細(xì)胞容量的等量以上，不能充分發(fā)揮細(xì)胞間相互作用，因此不優(yōu)選。
此外，第一細(xì)胞集合體和第二細(xì)胞集合體的接觸越緊密越好，更優(yōu)選 相對于第一細(xì)胞集合體壓緊第二細(xì)胞集合體地配置。此外，由于用不阻礙 培養(yǎng)液、氧透過的固形物包圍第一細(xì)胞集合體和第二細(xì)胞集合體的周圍， 對于使細(xì)胞集合體間的接觸緊密相接也是有效的，在粘度不同的溶液中加 入密度高的細(xì)胞懸濁液，然后配置，直接固化溶液，也容易實現(xiàn)細(xì)胞接觸 的保持，因此優(yōu)選此方法。此時，在以第一細(xì)胞集合體作為牙胚間充質(zhì)系 細(xì)胞的單一細(xì)胞集合物，以第二細(xì)胞集合體作為牙胚上皮組織的情況下， 優(yōu)選，牙胚上皮組織的釉連接點與第一細(xì)胞集合體接觸配置，但也不限定 于此。
在支乘載體是凝膠狀或溶液狀等的情況下，也可以在配置工序后設(shè)置 固化支乘載體的固化工序。通過固化工序，可使配置在支乘載體內(nèi)部的細(xì) 胞在支乘載體內(nèi)部固定化。在支乘載體的固化中，也可以直接應(yīng)用一般所 用的支乘載體的固化條件。例如，在支乘載體采用膠原等可固化的化合物 的情況下，能夠通過在通常所用的條件下，例如在培養(yǎng)溫度下靜置幾分 鐘 幾十分鐘來固化。由此，能夠使支乘載體內(nèi)部的細(xì)胞間的結(jié)合固定化，同時還可形成強固的結(jié)合。
在本發(fā)明的制造方法的培養(yǎng)工序中，在支乘載體內(nèi)部培養(yǎng)第一細(xì)胞集 合體及第二細(xì)胞集合體。在該培養(yǎng)工序中，通過相互緊密接觸的第一細(xì)胞 集合體及第二細(xì)胞集合體可有效地進行細(xì)胞間相互作用，可再構(gòu)成組織， 即牙齒。
培養(yǎng)工序，可通過用支乘載體維持第一細(xì)胞集合體和第二細(xì)胞集合體 的接觸狀態(tài)來進行，可以是具有第一及第二細(xì)胞集合體的只利用支乘載體 的培養(yǎng)，也可以是其它動物細(xì)胞存在下的培養(yǎng)。
作為培養(yǎng)時間，因配置在支乘載體內(nèi)部的細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞集合體的狀 態(tài)、以及培養(yǎng)工序的實施條件而異，但一般為1 300天，為了形成在外
側(cè)具有釉質(zhì)、在內(nèi)側(cè)具有象牙質(zhì)的牙齒，優(yōu)選1 120天，從可迅速提供 的觀點出發(fā)，優(yōu)選為1 60天。另夕卜，為了形成具備牙周組織牙齒， 一般 規(guī)定為1 300天，優(yōu)選為1 60天。
在只利用支乘載體培養(yǎng)的情況下，可規(guī)定為在動物細(xì)胞培養(yǎng)所用的通 常的條件下的培養(yǎng)。此處的培養(yǎng)， 一般可直接采用動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件， 也能夠直接采用前面所述的條件。此外，在培養(yǎng)中也可以添加源自哺乳動 物的血清，此外也可以添加對這些細(xì)胞的增殖或分化有效的已知的各種細(xì) 胞因子。作為這樣的細(xì)胞因子，可列舉FGF、 BMP等。
此外，從組織或細(xì)胞集合體的氣體交換或營養(yǎng)供給的觀點出發(fā)，優(yōu)選 采用器官培養(yǎng)。在器官培養(yǎng)中， 一般，使多孔性的膜浮在適合動物細(xì)胞的 增殖的培養(yǎng)基上，在該膜上放置用支乘載體包埋的細(xì)胞集合體，如此進行 培養(yǎng)。關(guān)于此處所用的多孔性的膜，優(yōu)選具有多個0.3 5|im左右的孔的 膜，具體可列舉出泡孔培養(yǎng)嵌件(商品名)、同孔過濾器(商品名)。
在是其它動物細(xì)胞的存在下的培養(yǎng)的情況下，由于通過接受來源自動 物細(xì)胞的各種胞質(zhì)分裂等的作用，能夠早期形成具有特有的細(xì)胞配置的牙 齒，因此優(yōu)選此方法。如此的在其它動物細(xì)胞存在下的培養(yǎng)，也可以采用 離析細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞，通過生物體外的培養(yǎng)進行。
此外，為了能夠早期進行牙齒及/或牙周組織的形成，更優(yōu)選將具有 第一及第二細(xì)胞集合體的支乘載體移植在生物體中，在生物體內(nèi)進行培 養(yǎng)。在此種情況下，可與支乘載體一同將第一及第二細(xì)胞集合體移植到生物體內(nèi)。
可用于此用途的動物，可優(yōu)選列舉哺乳動物，例如人、豬、小鼠等， 更優(yōu)選來源自與牙胚組織同一種的哺乳動物。在移植人牙胚組織的情況 下，優(yōu)選采用人、或免疫不全地改變的人以外的其它哺乳動物。作為適合 這樣的生物體內(nèi)發(fā)育的生物體部位，為了盡量正常生成動物細(xì)胞的器官或 組織，優(yōu)選腎臟皮膜下、腸間膜、皮下移植等。
關(guān)于利用移植的發(fā)育時間，因移植時的尺寸和生成牙齒的尺寸而異，
一般可規(guī)定為3 400天。例如，腎臟皮膜下移植的時間因移植的培養(yǎng)物
的尺寸和再生牙齒的尺寸而異，但從牙齒的再生和移植前生成的牙齒的尺
寸方面考慮，優(yōu)選7 60天。
也可以在進行向生物體移植之前，進行生物體外的培養(yǎng)(預(yù)培養(yǎng))。 通過此種預(yù)培養(yǎng)，可加強細(xì)胞間的結(jié)合和第一及第二細(xì)胞集合體相互間的 結(jié)合，能夠更加加強細(xì)胞間相互作用，因此優(yōu)選預(yù)培養(yǎng)。其結(jié)果，能夠縮 短整體的發(fā)育時間。
預(yù)培養(yǎng)的時間可以是短的，也可以是長的。長時間，例如在規(guī)定為3 天以上，優(yōu)選7天以上的情況下，由于能從牙胚向齒芽生長，進而在移植 后還可縮短到生成牙齒的時間，因此優(yōu)選此時間。作為預(yù)培養(yǎng)的時間，例 如作為進行腎臟皮膜下移植時的器官培養(yǎng)，優(yōu)選規(guī)定為1 7天，以便高 效率地再生牙齒。
用本發(fā)明的制造方法制造的牙齒，具有在內(nèi)側(cè)具有象牙質(zhì)、外側(cè)具有 釉質(zhì)這樣的作為牙齒特有的細(xì)胞配置(結(jié)構(gòu))，此外優(yōu)選，還具備稱為牙 齒的頂端(牙冠)和牙根的方向性。通過至少除如此的特有的細(xì)胞配置、 優(yōu)選的細(xì)胞配置以外還具有方向性，能發(fā)揮作為牙齒的功能。因此，可廣 泛用作牙齒的代替物。尤其，在采用來源自自家牙胚的間充質(zhì)系細(xì)胞及上 皮系細(xì)胞的情況下，能夠回避拒絕反應(yīng)帶來的問題地使用。此外，在一般 采用來源自移植抗原適合的他人的牙胚的細(xì)胞的情況下，也能夠回避拒絕 反應(yīng)帶來的問題。
另外，在本發(fā)明中，通過延長培養(yǎng)時間，除牙齒本身外，還能夠?qū)⒀?齒支乘在顎骨上，形成固定化的牙槽骨或牙根膜等牙周組織。結(jié)果，可提 供移植后可實用的牙齒。
艮口，本發(fā)明的牙周組織的制造方法，其特征在于，包含以下工序?qū)?所述第一及第二細(xì)胞集合體培養(yǎng)到得到牙齒和與之連接的牙周組織的工 序(培養(yǎng)工序)、以及離析通過所述培養(yǎng)得到的牙周組織的工序。
在此方法中，通過根據(jù)延長到得到牙周組織的培養(yǎng)時間，與牙齒連接 地形成牙周組織，從牙齒分離，可只得到牙周組織。牙周組織的離析，也 可以通過能夠分離在培養(yǎng)工序的過程中形成的牙周組織和牙齒的任何方 法進行，可列舉出利用小鑷子等的分離、或利用酶的部分消化等。
另外，在所述牙齒的制造方法中說明的事項，只要不限制培養(yǎng)時間， 都能用于本牙周組織的制造方法。
通過本發(fā)明的所述牙齒的制造方法及牙周組織的制造方法得到的牙 齒及牙周組織，除用作移植片外，還能有效地用于探討牙齒生成過程的研 究，對于今后的與牙齒相關(guān)的組織成長也能用作有效的研究方法。
另外，在作為移植片采用得到的齒或牙周組織的情況下，優(yōu)選，將制 造方法中的培養(yǎng)工序規(guī)定為，不與其它動物細(xì)胞接觸并且可全程在體外調(diào) 制的器官培養(yǎng)的工序。
本發(fā)明的牙齒的集合體，是具有用所述牙齒的制造方法得到的牙齒特 有的細(xì)胞配置的牙齒的集合體。
這樣的牙齒的集合體，由于由具有牙齒特有的細(xì)胞配置的多個牙齒構(gòu) 成，因此能夠從集合體分離各個牙齒，如下所述可用作1個牙齒的移植片。 如此本發(fā)明的牙齒的制造方法，在同時制作多個牙齒的情況下，還能夠以 由多個牙齒構(gòu)成的牙齒集合體提供牙齒。結(jié)果，能夠高效率地制作作為移 植片的牙齒。
牙齒的集合體，通過直接采用所述牙齒的制造方法能夠很容易得到。 尤其，由于在所述第一及第二細(xì)胞調(diào)制工序中，分別調(diào)制第一及第二細(xì)胞 集合體，并在配置工序中相互接觸地將其配置在支乘載體內(nèi)部，所以在支 乘載體內(nèi)部，能夠容易從本來形成l個牙齒的細(xì)胞群形成多個牙齒。
在牙齒的集合體的制造方法中，第一及第二細(xì)胞集合體，為了易于進 行用于生成多個牙齒的牙胚的再誘導(dǎo)，優(yōu)選都由單一細(xì)胞構(gòu)成。另外，培 養(yǎng)工序，與所述同樣可以是器官培養(yǎng)，也可以是腎臟皮膜下的培養(yǎng)。但在 作為移植片采用得到的牙齒的情況下，優(yōu)選規(guī)定為不與其它動物細(xì)胞接觸
的且全程能夠在體外調(diào)制的器官培養(yǎng)。
此外，本發(fā)明中包含牙齒的移植方法。該移植方法包括得到所述牙 齒的集合體的工序、從牙齒的集合體分離各個牙齒的工序、和與移植部位 上的其它牙齒具有相同的方向性地移植對齊分離的牙齒的工序。
由此，能夠高效率地實施牙齒的移植，同時得到具備特有的細(xì)胞配置 和方向性的多個牙齒。
根據(jù)本發(fā)明的牙齒，還可用于伴有牙齒損壞及損傷的各種癥狀，例如， 齲蝕、邊緣性牙周炎(牙槽膿漏)、牙周病造成的牙齒損壞，事故等造成 的折損或脫落等的治療或處置。
艮口，本發(fā)明的治療方法，包含將用本發(fā)明的制造方法得到的牙齒及/ 或牙周組織移植到損壞及/或損傷部位的伴有。由此，能夠治療及/或緩 和損壞及/或損傷部位的所述癥狀。
本發(fā)明的另一治療方法，包含對損壞及/或損傷部位只實施本發(fā)明的 培養(yǎng)伴有，或者實施配置伴有及培養(yǎng)伴有。在此種情況下，作為支乘載體， 除以上所述的以外，也可以作為支乘載體采用損壞及/或損傷部位的周圍 組織本身。由此，通過從生物體內(nèi)的周邊組織的胞質(zhì)分裂等，能夠更迅速 地進行損壞及/或損傷部位的治療等。
在本發(fā)明中，由于基于間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞的細(xì)胞間相互作 用，能夠有效地再構(gòu)成組織，因此可提供通過間充質(zhì)系細(xì)胞和上皮系細(xì)胞 的相互作用構(gòu)筑的組織的制造方法。
艮P，本發(fā)明的組織的制造方法，是通過間充質(zhì)系細(xì)胞和上皮系細(xì)胞的 相互作用構(gòu)筑的組織的制造方法，其中包括在支乘載體內(nèi)部接觸配置， 實質(zhì)上只由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的任何一方構(gòu)成的第一細(xì)胞集 合體、和實質(zhì)上只由任何另一方構(gòu)成的第二細(xì)胞集合體的工序；和在所述 支乘載體的內(nèi)部培養(yǎng)所述第一及第二細(xì)胞集合體的工序。
另外，所述牙齒的制造方法中說明的事項，只要不特別說明，都能同 樣地用于本組織的制造方法。
作為可用由本組織的制造方法制造的組織，通過間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮 系細(xì)胞的細(xì)胞間相互作用構(gòu)筑的組織比較適合，除上述的牙齒外，還可列 舉毛發(fā)、腎臟、肺、肝臟等，可以是這些組織整體，也可以是其一部分。
此時，優(yōu)選，間充質(zhì)系細(xì)胞和上皮系細(xì)胞的至少一方，來源自目標(biāo)組 織。由此，采用已對目標(biāo)組織進行了方向附加的細(xì)胞，能夠容易形成組織。 此外，為更可靠地制造目標(biāo)組織，更優(yōu)選都來源自目標(biāo)組織。
作為用于調(diào)制分別由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞集合體 的組織，在是牙齒時，可列舉出牙胚或齒髓細(xì)胞、牙根膜細(xì)胞、口腔內(nèi)上 皮-間充質(zhì)細(xì)胞，在是毛發(fā)時，可列舉出生成過程中的絲胞器官原基或成 體的絲胞組織，在是腎臟時，可列舉出生成過程中的腎內(nèi)臟官原基或成體 的腎臟組織，在是肺時，可列舉出生成過程中的肺器官原基或成體的肺組 織，在是肝臟時，可列舉出生成過程的肝內(nèi)臟官原基或成體的肝臟組織。
為了從這些組織調(diào)制各細(xì)胞集合體，如上所述，只要從組織分離間充 質(zhì)系細(xì)胞和上皮系細(xì)胞，與所述同樣地調(diào)制第一及第二細(xì)胞集合體，與所 述同樣地配置在支乘載體內(nèi)部，然后進行培養(yǎng)及/或移植就可以。
由此，能夠與所述的牙齒同樣地，得到目標(biāo)組織具有特有的細(xì)胞配置 的組織。
以下，說明本發(fā)明的實施例，但也不限定于此。此外，實施例中的％， 只要不特別指出，為重量(質(zhì)量)百分比。
實施例 (1)牙胚上皮系細(xì)胞和牙胚間充質(zhì)系細(xì)胞的調(diào)制 為了進行牙齒的形成，進行了牙胚的再構(gòu)筑。作為此實驗標(biāo)本采用小鼠。
C57BL / 6N小鼠(從日本CLEA購入)或Green Fluorescence Protein (EGFP)基因轉(zhuǎn)移小鼠即C57BL / 6—TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131 (GFP小鼠理研生物源中心)的胎齡14.5天，在顯微鏡下利用通常的方 法從胚仔摘取下顎切齒牙胚組織。用不含Ca2+、 Mg^的磷酸緩沖液(PBS(-)) 清洗下顎切齒牙胚組織，用在PBS(-)中添加了最終濃度為1.2U/ml的 Dispase II (Roche, Mannheim, Germany)的酶液，室溫處理12.5分鐘后， 用添加了 10%FCS (JRHBiosciences, Lenexa， KS)的DMEM (Sigma, St. Louis，MO)清洗3次。另外，以達(dá)到最終濃度為70U / ml的方式添加DNase
I溶液(Takara， Siga， Japan),使牙胚組織分散，采用25G注射針(Terumo， Tokyo, Japan),用外科分離牙胚上皮組織和牙胚間充質(zhì)組織。
牙胚上皮系細(xì)胞，用PBS(-)3次清洗通過所述得到的牙胚上皮組織， 用在PBS(-)中溶解了最終濃度為100U / ml的Collagenase I (Worthington， Lakewood， NJ)的酶液，在37°C2次重復(fù)20分鐘的處理。將通過離心分 離沉淀回收的細(xì)胞，再用0.25%Trypsin(Sigma)—PBS(-)，在37。C處理5分 鐘。在用添加有10%FCS的DMEM， 3次清洗細(xì)胞后，在細(xì)胞中添加最終 濃度為70U / ml的DNase I溶液，通過吸取得到單一的牙胚上皮系細(xì)胞。
另一方面，牙胚間充質(zhì)系細(xì)胞，通過用PBS(-)3次清洗牙胚間充質(zhì)組 織，用含有0.25%Trypsin(Sigma)、 50U / ml的Collagenase I (Worthington) 的PBS(-)進行了處理。添加70U / ml的DNase I(Takara)，通過吸取得到了 單一的牙胚間充質(zhì)系細(xì)胞。 (2)再構(gòu)成牙胚的制作
接著，采用按所述調(diào)制的牙胚上皮系細(xì)胞及牙胚間充質(zhì)系細(xì)胞，進行 了牙胚再構(gòu)筑。
在涂布有硅酮脂膏的1.5mL微型管(Eppendorf， Hamburg, Germany) 中，裝入用添加有10%FCS (JRHBiosciences)的DMEM (Sigma)懸濁的 牙胚上皮系細(xì)胞、或牙胚間充質(zhì)系細(xì)胞，通過離心分離(580Xg)作為沉 淀物回收細(xì)胞。盡量除去離心后的培養(yǎng)液的上清液，進行再次離心操作， 用實體顯微鏡觀察，同時采用GELoaderTipO， 5 —Z0pL(eppendorf)完全除 去殘存在細(xì)胞沉淀物周圍的培養(yǎng)液，準(zhǔn)備好用于再構(gòu)成牙胚制作的細(xì)胞。
在涂布有硅酮脂膏的培養(yǎng)盤上，滴下30pL的用所述培養(yǎng)液調(diào)制到 2.4mg / ml的濃度的Cellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan),制作 膠原凝膠溶液的落滴(凝膠落滴)。在該溶液中，采用0.1_10pL的吸管 (Quality Scientific plastics),應(yīng)用0.2—0.3pL的所述牙胚上皮系細(xì)胞、或牙 胚間充質(zhì)系細(xì)胞的離心后的沉淀物，制作了作為細(xì)胞集合體的細(xì)胞凝集塊。
參照圖2說明上述過程。
用吸管16先前配置在凝膠落滴10內(nèi)的細(xì)胞凝集塊12在凝膠落滴10 內(nèi)構(gòu)成球體(參照圖2 (B))。然后多通過推入另一方的細(xì)胞凝集塊14， 壓破球體的細(xì)胞凝集塊12，包覆另一方的細(xì)胞凝集塊14 (參照圖2 (C))。
然后通過使凝膠落滴IO固化，加強細(xì)胞間的結(jié)合(參照圖2 (D))。
在本實施例中，作為細(xì)胞集合體，分別調(diào)制由上皮系細(xì)胞或間充質(zhì)系
細(xì)胞的單一細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞凝集塊、和牙胚中的由上皮系細(xì)胞構(gòu)成的部分
組織及由間充質(zhì)系細(xì)胞構(gòu)成的部分組織，然后使用。
在本實施例中，在組合由細(xì)胞凝集塊和組織形成的再構(gòu)成牙胚時(實
施例1及2)中，在從牙胚上皮系細(xì)胞、或間充質(zhì)系細(xì)胞制作的細(xì)胞凝集
塊中，在將由上皮系細(xì)胞或間充質(zhì)系細(xì)胞構(gòu)成的部分組織移到凝膠落滴中
后，采用鎢針，使各個組織的牙胚上的組織邊界面?zhèn)让芎显诩?xì)胞凝集塊上，
制作成再構(gòu)成牙胚。
另一方面，在采用由單一細(xì)胞形成的牙胚上皮系細(xì)胞和牙胚間充質(zhì)系
細(xì)胞的再構(gòu)成牙胚(實施例3)中，以接合在先前制作的牙胚間充質(zhì)系細(xì)
胞的細(xì)胞凝集塊上的方式，用同樣的方法應(yīng)用牙胚上皮系細(xì)胞，制作細(xì)胞 凝集塊，使兩者相互緊密接觸，如此制作了再構(gòu)成牙胚。
將在凝膠落滴中制作的再構(gòu)成牙胚在C02恒溫箱中靜置IO分鐘，固 化Cellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)，與支乘載體即周圍的凝膠一 同將細(xì)胞 凝集塊移到培養(yǎng)容器的泡孔培養(yǎng)嵌件的膜上，該培養(yǎng)容器被配置成泡孔培 養(yǎng)嵌件(細(xì)孔尺寸為0.4微米的PET膜片；BD， Franklin Lakes, NJ)與 添加10%FCS (JRH)的DMEM (Sigma)接觸，器官培養(yǎng)18 — 24小時。 培養(yǎng)后，連周圍的凝膠一齊移植到8周齡C57BL/6的腎皮膜下，進行不 同位置的牙齒的生成，或繼續(xù)泡孔培養(yǎng)嵌件上的器官培養(yǎng)，分析了牙齒的 生成。
此外，作為比較例，分別與所述同樣地調(diào)制了，將牙胚組織直接移植 到腎皮膜下的(比較例1)、分別單獨移植從牙胚分離的上皮組織和間充質(zhì) 組織的(比較例2)、此外采用含有與細(xì)胞容量等量的培養(yǎng)液的低密度凝集 塊的(比較例3)、從牙胚分離，混合上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，不區(qū)分上皮 細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞地在支乘載體中形成細(xì)胞凝集塊的(比較例4)，相同地 進行了分析。另外，在比較例4中，上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的混合，分別 在按1對1的比率穩(wěn)定混合后，與實施例1 3同樣地，作為用于再構(gòu)成 牙胚制作的1個細(xì)胞凝集塊調(diào)制。 (3)組織學(xué)的解析在腎皮膜下移植的情況下，在移植后第七天或第十四天，連周圍的腎 組織一齊摘取再構(gòu)成牙胚，在用4%多聚甲醛一磷酸緩沖液固定6小時后，
用4.5。/。的EDTA (pH7.2)脫灰24小時，利用通常的方法石蠟包埋，制作 10pm的切片。為了進行組織學(xué)的分析，用通常的方法進行了蘇木精一曙 紅染色。
在作為再構(gòu)成牙胚釆用源自GFP小鼠的牙胚的時候，在用50% (w/ v)蔗糖一4%多聚甲醛一磷酸緩沖液固定18小時后，用4.5%的EDTA
(pH7.2)脫灰24小時，包埋在OCT compound (Miles Inc， Naperville， IL)中，用低溫恒溫器(夕U才,夕7卜)(Leica， Wetzlar， Germany)制 作10pn的切片，然后用熒光顯微鏡(Zeiss公司制)觀察。
圖3示出牙胚組織的原樣培養(yǎng)的結(jié)果，圖4 7示出按本發(fā)明的制造 方法培養(yǎng)的結(jié)果。
在進行了摘取的牙胚的原樣腎皮膜下移植的比較例1中，如圖3所示， 由于構(gòu)成牙胚的間充質(zhì)系細(xì)胞和上皮系細(xì)胞的細(xì)胞間相互作用未受損害， 因此形成來源自上皮系細(xì)胞的釉質(zhì)、來源自間充質(zhì)系細(xì)胞的象牙質(zhì)和齒 髓，將釉質(zhì)及象牙質(zhì)配置在所定的位置，同時形成了具有牙齒前端部和牙 根的牙齒。
另一方面，如圖4 6所示，按照本發(fā)明，在采用從牙胚調(diào)制的單一 細(xì)胞形態(tài)時，即，在通過牙胚上皮組織中組合牙胚間充質(zhì)系細(xì)胞再構(gòu)成時 (參照實施例l、圖4及圖5)、和通過在牙胚上皮系細(xì)胞中組合牙胚間充 質(zhì)組織再構(gòu)成時(參照實施例2、圖6)，分別，能夠用11 14天的時間， 通過腎皮膜下移植，生成內(nèi)側(cè)具有象牙質(zhì)及外側(cè)具有釉質(zhì)的具備特有細(xì)胞 配置的牙齒。此處得到的牙齒，表示能夠再構(gòu)成與通過直接培養(yǎng)牙胚得到 的正常生成的牙齒(圖3)同樣的牙齒。
另外，如圖4所示，通過本再構(gòu)成和腎皮膜下移植，在移植后第十一 天，很容易認(rèn)出外側(cè)的釉質(zhì)、釉芽細(xì)胞、釉芽細(xì)胞、象牙質(zhì)、象牙芽細(xì)胞。 還認(rèn)出牙根部分也與正常生成無變化，在牙根部分的外周還認(rèn)出牙槽骨。 此外，根據(jù)經(jīng)時觀察，在移植后第三天很容易認(rèn)出象牙質(zhì)、象牙芽細(xì)胞， 在組織配置上開始形成牙齒特征的結(jié)構(gòu)。此外，在第七天還存在象牙質(zhì)的 蓄積、和象牙芽細(xì)胞及釉芽細(xì)胞，其后進行牙齒的生成(未示出數(shù)據(jù))。
此外，在剛配置在凝膠落滴內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)構(gòu)成細(xì)胞凝集塊的細(xì)胞在顯微 鏡下單獨存在，但通過l天的短期培養(yǎng)，與摘取的正常牙胚同樣，細(xì)胞的 結(jié)合變得強固，變化成如l個的組織。由此表明，移植前的短期培養(yǎng)對于 牙齒的形成是有效的。
此外，在采用源自GFP小鼠的間充質(zhì)系細(xì)胞的情況下，表明局限于源 自內(nèi)側(cè)的間充質(zhì)細(xì)胞的齒髓細(xì)胞和象牙芽細(xì)胞(圖5)，另一方面，在釆用
源自GFP小鼠的上皮系細(xì)胞的情況下，表明局限于外側(cè)的釉芽細(xì)胞，使用 的細(xì)胞種和熒光一致(圖6)。因此，說明與正常生成同樣地進行了細(xì)胞相 互作用，不損害生成時的細(xì)胞的方向性地進行了組織的再構(gòu)成。
另外，即使在不采用腎皮膜下的移植，繼續(xù)器官培養(yǎng)的情況下，從培 養(yǎng)開始，經(jīng)時培養(yǎng)的再構(gòu)成牙胚也逐漸長大，在移植后第十六天，容易認(rèn) 出象牙質(zhì)、象牙芽細(xì)胞，認(rèn)出在組織配置上形成牙齒特征的結(jié)構(gòu)(未示出 數(shù)據(jù))。如此的利用器官培養(yǎng)的構(gòu)筑，不僅在作為組織采用一方時，即使 在采用上皮系細(xì)胞及間充質(zhì)系細(xì)胞雙方時也同樣被認(rèn)可。
此外，在采用牙胚上皮系細(xì)胞及牙胚間充質(zhì)系細(xì)胞時(實施例3)，如 圖7所示，與作為組織采用任何一方時同樣，能夠確認(rèn)象牙質(zhì)及釉質(zhì)的存 在。在采用牙胚上皮系細(xì)胞及牙胚間充質(zhì)系細(xì)胞時，認(rèn)出屢次發(fā)現(xiàn)由l個 再構(gòu)成牙胚生成具有多個方向性和結(jié)構(gòu)的牙齒，暗示有通過分離生成后的 齒芽生成多個牙齒的可能性。尤其，在先將牙胚間充質(zhì)系細(xì)胞配置在凝膠 落滴內(nèi)，然后接觸配置牙胚上皮系細(xì)胞的情況下，能夠更明確地構(gòu)筑釉質(zhì) 及象牙質(zhì)分別被配置在外側(cè)及內(nèi)側(cè)的具有特征性的結(jié)構(gòu)，更容易選擇牙齒 的形態(tài)，顯示出利于牙齒形成的可能性(未示出數(shù)據(jù))。
另外，通過器官培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明配置上皮系細(xì)胞和間充質(zhì)系細(xì)胞，再 構(gòu)成的牙胚，屢次認(rèn)出多個牙胚及/或齒芽的形成。這暗示通過外科分離 這些多個牙胚及/或齒芽，有從1個再構(gòu)成牙胚生成多個牙齒的可能性。
另一方面，在只用上皮組織或只用間充質(zhì)組織培養(yǎng)的比較例2的情況 下，如圖8所示，不能構(gòu)成上述這樣的特定結(jié)構(gòu)的牙齒。因此，在本發(fā)明 的方法中，暗示通過進行細(xì)胞相互作用，再構(gòu)成了具有特定結(jié)構(gòu)的組織。
此外，在采用低密度的細(xì)胞凝集塊的比較例3的情況下，如圖9所示， 在膠原凝膠落滴中的培養(yǎng)中單一細(xì)胞已經(jīng)分散，即使移植到腎臟皮膜下，
也不能再構(gòu)成作為牙齒的特定結(jié)構(gòu)。這暗示，要通過細(xì)胞相互作用再構(gòu)成 牙齒，優(yōu)選盡可能采用高密度的細(xì)胞凝集塊。
另外，在是事前1對1地混合牙胚上皮系細(xì)胞和牙胚間充質(zhì)系細(xì)胞， 高密度且不區(qū)分這些細(xì)胞地形成細(xì)胞凝集塊的比較例4的情況下，如圖10 所示，未認(rèn)出釉質(zhì)或象牙質(zhì)的硬組織。這表明，重要的是在個別地調(diào)制了 牙胚上皮系細(xì)胞的集合體和牙胚間充質(zhì)系細(xì)胞的集合體后，區(qū)分地形成細(xì) 胞凝集塊。
(4)牙周組織的確認(rèn)
接著，確認(rèn)用本方法形成的齒是否具備牙周組織。牙周組織的確認(rèn)， 除利用所述的HE染色圖像觀察外，還采用了下記的原地雜交。
在移植后的第十四天摘取腎皮膜下移植的再構(gòu)成牙胚，用通常的方法 進行石蠟包埋，形成l(^m厚的切片。將切片浸入二甲苯和乙醇稀釋系列 中，除去石蠟。用含有10昭/ml Protease K(Nacalaitesque， kyoto， Japan) 的PBS(-)處理3分鐘，用4。/。多聚甲醛(Nacalai tesque)磷酸緩沖液固定15 分鐘。用含有0.1%(v/v)TritonX-100(Sigma)的PBS(陽)處理3分鐘，用 PBS(-)清洗3分鐘。用0.2N HCl(Wako)處理10分鐘，用PBS(-)和DEPC (焦碳酸二乙酯)水分別清洗5分鐘。用含有1.5。/。(v/v)三乙醇胺(nacalai tesque)、 0.33N HCl(Wako)、 0.25%(v / v)乙酐(Nacalai tesque)的DEPC水 處理10分鐘后，用2XSSC進行10分鐘清洗2次。Periostin (Genbank accession no. NM#015784)探測器，采用讀取最初(-7， ggctgaagatggttcctctc、 配列番號1)和反讀取最初(573， gtacattgaaggaataacca、配列番號2)， DIG 標(biāo)識通過PCR取得的cDNA斷片。按照通用方法進行原地雜交，用抗DIG 一AP Fab碎片(Roche)和NBT / BCIP Stock Solution (Roche)使其發(fā)色， 用Axio Imager A. l(Zeiss)和AxioCam MRc5(Zeiss)進行了分析。
就牙周組織的有無，詳細(xì)觀察了所述實施例中的牙周組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 在實施例1 3的所有例中，如圖4 圖7所示，在移植后第十四天的牙齒 的周圍，形成了與移植正常牙胚的比較例1 (參照圖3)同樣的牙槽骨。
另外，如圖11所示，盡管單一細(xì)胞和組織的組合不同，在實施例1 3的所有例中，在得到的牙齒的周圍，都形成了與移植了正常牙胚的比較 例1同樣的牙槽骨及牙根膜。此外，在實施例2的牙齒中確認(rèn)的地方，如
圖12所示，在通過HE染色認(rèn)出牙根膜形成的區(qū)域，認(rèn)出牙根膜特異的遺 傳因子即periostinmRNA的出現(xiàn)(在實施例1及3中也同樣)。
這表明，根據(jù)實施例1 3制作的牙胚，能夠形成牙槽骨或牙根膜等 牙周組織。
在與所述同樣地結(jié)束了配置工序后，作為培養(yǎng)工序，在整個14天中 繼續(xù)實施一般所用的器官培養(yǎng)，分析了牙齒的生成。以源自牙胚的上皮組 織和間充質(zhì)細(xì)胞的組合作為實施例4，以源自牙胚的上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì) 胞的組合作為實施例5。另外，將采用正常牙胚器官培養(yǎng)的例子作為比較 例5。圖13示出其結(jié)果。
如圖13所示，實施例4及5都隨著培養(yǎng)時間的延長而增大牙胚的尺 寸，認(rèn)出生成具有與實施腎皮膜下移植時大致同樣的特征結(jié)構(gòu)的牙齒。
此外，在實施例4及5的所有例中，通過器官培養(yǎng)得到的牙齒，形成 由多個牙齒構(gòu)成的集合體(例如，在采用間充質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞時為6個， 在圖13的最下段)。
如實施例5所示，從再構(gòu)成牙胚得到的牙齒，盡管從l個再構(gòu)成牙胚 調(diào)制了間充質(zhì)細(xì)胞及上皮細(xì)胞，但仍被朝多個牙齒再誘導(dǎo)。如此分析了用 再構(gòu)成牙胚同時再誘導(dǎo)的各個牙齒是否可作為1個牙齒生長。
(1)從再構(gòu)成牙胚生成的多個牙胚的分離和朝牙齒生成的能力分析
1)多個生成的牙胚的單個分離和器官培養(yǎng)
將與實施例3同樣地得到的再構(gòu)成牙胚器官培養(yǎng)2 5天，從1個再 構(gòu)成牙胚生成多個牙胚。然后，在器官培養(yǎng)第二 5天，在實體顯微鏡下， 用注射針和小鑷子，用外科將生成多個牙胚的再構(gòu)成牙胚分離為1個牙胚。
在涂布有硅酮脂膏的培養(yǎng)盤上，與實施例1同樣地，滴下30pL的 Cellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan),制作凝膠落滴。在該凝 膠落滴中加入所述單個分離牙胚，在C02恒溫箱中靜置10分鐘，使 Cellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)固形化，與支乘載體即周圍的凝膠一同將
單個分離牙胚移入到培養(yǎng)容器的泡孔培養(yǎng)嵌件的膜上，該培養(yǎng)容器被配置 成泡孔培養(yǎng)嵌件(細(xì)孔尺寸為0.4微米的PET膜片，BD， Franklin Lakes,
NJ)與添加10%FCS (JRH)的DMEM (Sigma)接觸，如此器官培養(yǎng)18 一24小時。
2) 組織學(xué)的分析
培養(yǎng)后，連周圍的凝膠一齊移植在8周齡C57BL/6的腎皮膜下，在 第十四天連周圍的腎組織一齊摘取單個分離牙胚。在用4%多聚甲醛一磷 酸緩沖液固定組織6小時后，用通常的方法石蠟包埋，制作10|im的切片。 為進行組織學(xué)的分析，按照通常的方法，進行勒蘇木精一曙紅染色。
3) 結(jié)果
將分離的牙胚移植到腎臟皮膜下，使其生成14天，圖14示出組織學(xué) 上的分析結(jié)果。如圖14所示，移植的分離牙胚，分別生成在具有釉質(zhì)和 象牙質(zhì)、齒髓、牙冠、牙根等特征的l個"牙齒"上。此外，分別確認(rèn)在 得到的牙齒的牙冠部存在釉質(zhì)和象牙質(zhì)(參照圖14中段及下段上的a)、 及在牙根部存在牙根的開口部(參照圖14中段上的b)。
這些表示，與正常生成的牙齒同樣地在牙冠部存在釉芽細(xì)胞和象牙芽 細(xì)胞，此外具有與正常生成的牙齒相同的形態(tài)，作為牙齒的集合體同時生 成的各個牙齒，在細(xì)胞配置及方向性上都與正常生成的牙齒相同。 (2)通過口腔內(nèi)移植再構(gòu)成牙胚生成牙齒
1)單個分離牙胚和單個分離牙的制作
與所述同樣地，在器官培養(yǎng)第二 5天，從生成多個牙胚的再構(gòu)成牙 胚制作單個分離的牙胚。另一方面，在實體顯微鏡下，用注射針和小鑷子， 外科單個分離腎皮膜下移植14天后摘取的、由再構(gòu)成牙胚多個生成的牙 齒。
在是單個分離牙胚時，與所述同樣地，在涂布有硅酮脂膏的培養(yǎng)盤上， 滴下30pL的用所述培養(yǎng)液調(diào)制到2.4mg / ml的濃度的Cellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan),制作凝膠落滴。在該凝膠落滴中，加入所 述單個分離牙胚，在C(V恒溫箱中靜置IO分鐘，固化Cellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)。接著，與支乘載體即周圍的凝膠一同將單個分離牙胚移入 到培養(yǎng)容器的泡孔培養(yǎng)嵌件的膜上，該培養(yǎng)容器被配置成泡孔培養(yǎng)嵌件 (細(xì)孔尺寸為0.4微米的PET膜片，BD， Franklin Lakes， NJ)與添加10%FCS (JRH)的DMEM (Sigma)接觸，如此器官培養(yǎng)18—24小時。 培養(yǎng)后，用注射針和小鑷子，外科除去周圍的凝膠，移植到8周齡
C57BL/6的下顎切齒拔牙孔內(nèi)，作為實施例6。另一方面，在是從移植 到腎臟皮膜下的再構(gòu)成牙胚單個分離的牙齒的情況下，分離后不用凝膠包 覆，直接移植到8周齡C57BL/6的下顎切齒拔牙孔內(nèi)，作為實施例7。
2) 切齒的拔牙和口腔內(nèi)移植的方法
在口腔內(nèi)移植的3天前，對用二乙醚吸引麻醉的8周齡C57BL / 6， 相對于體重20g，按200^1的比例腹腔注射含有5mg / ml的戊巴比妥鈉的 生理食鹽水。用手術(shù)刀剝離痛覺麻痹的小鼠的下顎切齒萌出部附近的下顎 骨，露出埋在顎骨內(nèi)的切齒頂端部。用小鑷子從下顎拔掉切齒，用脫脂棉 擦拭血液，并止血。為攝取食物，規(guī)定拔牙只拔掉單側(cè)的下顎切牙齒，每 日供給粉末狀粉碎的詞養(yǎng)用餌料。
用二乙醚吸引麻醉用所述方法拔掉牙的8周齡C57BL / 6，相對于體 重20g，按200W的比例腹腔注射含有5mg / ml的戊巴比妥鈉的生理食塩 水。將痛覺麻痹的小鼠，以拔牙的一側(cè)的顎朝上的方式固定在解剖臺上， 由拔牙孔牙根部區(qū)域的頭部橫面切開皮膚和肌肉層，使下顎骨露出。用手 術(shù)刀，在覆蓋拔牙孔牙根部區(qū)域的下顎骨，在是單個分離牙胚時開直徑 lmm的孔，在是單個分離牙時開直徑2mm的孔，從此出將單個分離牙胚 和單個分離齒牙移植在拔牙孔牙根部區(qū)域。移植的單個分離牙胚和單個分 離牙齒的朝向，與正常生成的牙齒的方向一致，此外也與在成體小鼠下顎 切齒看到的釉質(zhì)、牙根膜的方向性一致。用通常的方法縫合切開的肌肉層 和皮膚。對進行了口腔內(nèi)移植的8周齡C57BL/6，每日供給粉末狀粉碎 的飼養(yǎng)用的餌料。
另外，將切齒拔牙后未移植的小鼠作為比較例6。
3) 組織學(xué)的分析
在口腔內(nèi)移植后第十四天，摘取移植了單個分離牙胚、以及單個分離 牙齒的下顎骨。在用4%多聚甲醛一磷酸緩沖液固定16小時后，用22.5% 的甲酸脫灰72小時，用通常的方法石蠟包埋，制作10pm的切片。脫灰液 兩個下顎骨為50ml，在脫灰第四8小時時交換了總量。為了進行組織學(xué)的 分析，按通常的方法進行了蘇木精一曙紅染色。
在作為單個分離牙胚、以及單個分離齒牙，采用源自C57BL / 6—TgN
(act—EGFP) OsbC14-Y01-FM131小鼠的牙胚的時候，在用4%多聚甲醛 —磷酸緩沖液固定16小時后，用22.5%的甲酸脫灰72小時，用通常的方 法包埋在OCT compound (Miles Inc., Naperville, IL)中，用低溫恒溫器
(夕'J才^夕'7卜)(Leica， Wetzlar， Germany)制作lOpm的切片，用熒 光顯微鏡(Zeiss公司制)觀察。 4)結(jié)果
圖15中示出切齒拔牙后不移植的比較例6的小鼠的拔牙14天后的組 織圖像，圖16及圖17中分別示出將單個分離的牙胚(實施例6)、以及牙 齒(實施例7)移植在切齒拔牙孔內(nèi)14天后的組織圖像。
如圖15所示，在比較例6的非移植小鼠上，只認(rèn)出浸潤在切齒拔牙 孔的符合移植部位的位置上的細(xì)胞和生成的骨，未發(fā)現(xiàn)具有硬組織的牙 齒。
相反，如圖16所示，在作為實施例6移植單個分離的牙胚的適宜部 位上，生成外側(cè)具有釉質(zhì)、內(nèi)側(cè)具有象牙質(zhì)的牙齒。在生成的牙齒，認(rèn)出 牙齒的頂端和牙根，存在牙齒的方向性，具有與正常生成的牙齒相同的結(jié) 構(gòu)。
此外，對于把腎臟皮膜下移植生成后分離的牙齒移植到拔牙孔的實施 例7的小鼠，如圖17所示，在適宜部位生成了外側(cè)具有釉質(zhì)、內(nèi)側(cè)具有 象牙質(zhì)的牙齒。生成的牙齒，具有牙齒的頂端和牙根，在齒髓內(nèi)部發(fā)現(xiàn)血 管，同時牙齒的周圍具有牙根膜和牙槽骨，具有與正常生成的牙齒相同的 結(jié)構(gòu)。 (1)絲胞(日語毛胞)的再構(gòu)成 本發(fā)明中開發(fā)的技術(shù)，由于顯示出不僅有助于牙胚的生成，而且還能 用于其它器官形成，因此實施了絲胞的再構(gòu)成。作為該實驗標(biāo)本采用小鼠。 1)細(xì)胞的分離方法
在C57BL / 6N小鼠(從日本CLEA購入)或Green Fluorescence Protein (EGFP)基因轉(zhuǎn)移小鼠即C57BL / 6—TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131
(理研生物源中心)的胎齡14.5天，在顯微鏡下利用通常的方法從胚仔摘 取上顎須絲胞組織。用不含Ca2+、 Mg^的磷酸緩沖液(PBS(-))清洗下顎須
絲胞組織，用在PBS(-)中添加了最終濃度為1.2U / ml的Dispase II (Roche， Mannheim, Germany)的酶液，室溫處理60分鐘后，用添加了 10%FCS(JRH Biosciences, Lenexa， KS)的DMEM (Sigma， St, Louis， MO)清洗3次。 另夕卜，以達(dá)到最終濃度70U / ml的方式，添加DNase I溶液(Takara， Siga， Japan),使絲胞組織分散，采用25G注射針(Terumo， Tokyo, Japan),外 科分離絲胞上皮組織和絲胞間充質(zhì)組織。
對于絲胞上皮系細(xì)胞，用PBS(-)3次清洗按所述得到的絲胞上皮組織， 用在PBS(-)中溶解了最終濃度100U / ml的Collagenase I (Worthington， Lakewood， NJ)的酶液，在37°C2次重復(fù)20分鐘的處理。另外用 0.25%Trypsin(Sigma)—PBS(-)， 37°C、 5分鐘處理通過離心分離沉淀回收 的細(xì)胞。在用添加10%FCS的DMEM 3次清洗細(xì)胞后，在細(xì)胞中添加最 終濃度70U / ml的DNase I溶液，通過吸取得到單一的絲胞上皮系細(xì)胞。
另一方面，對于絲胞間充質(zhì)系細(xì)胞，用PBS(-)3次清洗絲胞間充質(zhì)組 織，用含有0.25%Trypsin(Sigma)、 50U / ml的Collagenase I (Worthington) 的PBS(-)處理。添加70U / ml的DNase I(Takara)，通過吸取得到單一的絲 胞間充質(zhì)系細(xì)胞。
2) 再構(gòu)成絲胞的制作方法
接著，除采用按所述調(diào)制的絲胞上皮系細(xì)胞及絲胞間充質(zhì)系細(xì)胞以 外，與實施例1同樣地準(zhǔn)備用于再構(gòu)成絲胞制作的細(xì)胞，在膠原凝膠落滴 中分別應(yīng)用0.2 — 0.3^L，制作各自的細(xì)胞凝集塊，兩者相互緊密接觸地制 作成再構(gòu)成絲胞。
3) 腎皮膜下移植
在凝膠中制作的再構(gòu)成絲胞，與實施例1同樣地，將細(xì)胞塊與支乘載 體即周圍的凝膠一同移到培養(yǎng)容器的泡孔培養(yǎng)嵌件的膜上，器官培養(yǎng)18 一48小時。培養(yǎng)后，連周圍的凝膠一齊移植到8周齡C57BL/6的腎皮膜 下，進行不同部位的毛的生成，分析了毛的生成。
另一方面，比較例7，除采用絲胞上皮系細(xì)胞及絲胞間充質(zhì)系細(xì)胞以 外，與比較例4同樣地在生物體外混合2種細(xì)胞，制作1個細(xì)胞凝集體， 與實施例8同樣地移植到腎皮膜下。
4) 組織學(xué)的分析
在移植到腎皮膜下的情況下，在移植后第十四天，連周圍的腎組織一 齊摘取再構(gòu)成絲胞。在器官培養(yǎng)的情況下，在培養(yǎng)同樣的天數(shù)后，回收細(xì) 胞凝集塊。在用4%多聚甲醛一磷酸緩沖液6小時固定了組織、或細(xì)胞凝
集塊后，用通常的方法石蠟包埋，制作l(Him的切片。為了進行組織學(xué)的 分析，用通常的方法進行了蘇木精一曙紅染色。 5)結(jié)果
圖18示出將實施例8的絲胞移植到同系小鼠的腎臟皮膜下的結(jié)果。 如圖18所示，如果移植再構(gòu)成絲胞，由于不會損害構(gòu)成初期絲胞的上皮 細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間相互作用，因此在絲胞的縱斷面(切片A)， 認(rèn)出來源自上皮細(xì)胞的毛包或內(nèi)毛根鞘、外毛根鞘、以及來源自間充質(zhì)細(xì) 胞的毛乳頭的細(xì)胞。另外，在切片A，盡管毛在組織染色時溶解，.但還認(rèn) 出了沒有完全溶解的毛。在橫斷面(切片B)，認(rèn)出了內(nèi)毛根鞘或外毛根 鞘等細(xì)胞以上皮細(xì)胞圍住毛孔的方式配置。由于毛在組織染色時溶解，因 而認(rèn)出了毛的溶解殘存物。
此外，如圖19所示，在將再構(gòu)成絲胞移植在腎臟皮膜下14天后摘取 的移植片上，認(rèn)出了從絲胞生出的毛。
另一方面，在是預(yù)先混合上皮以及間充質(zhì)細(xì)胞，在支乘載體中再構(gòu)成 的比較例7的情況下，如圖20所示，未發(fā)現(xiàn)絲胞組織。
因此，根據(jù)實施例8，能夠與采用實施例1 7的牙胚制作牙齒時同樣 地，從絲胞組織制作毛。
如此，根據(jù)本發(fā)明，不局限于牙齒或毛，通過以有效地發(fā)揮上皮系細(xì) 胞和間充質(zhì)系細(xì)胞的細(xì)胞間相互作用的方式，單個調(diào)制上皮組織 細(xì)胞及 間充質(zhì)組織，細(xì)胞，并將它們區(qū)分化，使其高密度接觸地培養(yǎng)，能夠有效 地誘導(dǎo)細(xì)胞的分化，制作具備組織特有的細(xì)胞配置和方向性的組織。
因此，根據(jù)本發(fā)明，可不損害細(xì)胞間相互作用地從多種單一細(xì)胞再構(gòu) 筑組織，因而能夠人為地制作通過細(xì)胞相互作用構(gòu)筑的組織。
權(quán)利要求
1.一種牙齒的制造方法，包括在支乘載體的內(nèi)部，將實質(zhì)上只由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的任何一方構(gòu)成的第一細(xì)胞集合體、和實質(zhì)上只由任何另一方構(gòu)成的第二細(xì)胞集合體接觸配置的工序，其中，間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中至少任何一方是源自牙胚；在所述支乘載體的內(nèi)部，培養(yǎng)所述第一及第二細(xì)胞集合體的工序。
2. 如權(quán)利要求1所述的牙齒的制造方法，其中，所述間充質(zhì)系細(xì)胞及 上皮系細(xì)胞全部都源自牙胚。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的牙齒的制造方法，其中，在所述接觸配置 之前還包括調(diào)制第一細(xì)胞集合體的第一調(diào)制工序、和調(diào)整第二細(xì)胞集合體 的第二調(diào)制工序。
4. 如權(quán)利要求1 3中的任何一項所述的牙齒的制造方法，其中，包 括在其它動物細(xì)胞存在的情況下進行的在所述支乘載體內(nèi)部的發(fā)育工序。
5. 如權(quán)利要求1 4中的任何一項所述的牙齒的制造方法，其中，所 述第一細(xì)胞集合體及所述第二細(xì)胞集合體都是單一細(xì)胞集合物。
6. 如權(quán)利要求1 5中的任何一項所述的牙齒的制造方法，其中，將 所述培養(yǎng)繼續(xù)到形成牙周組織。
7. —種牙周組織的制造方法，包含在支乘載體的內(nèi)部，將實質(zhì)上只由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的任 何一方構(gòu)成的第一細(xì)胞集合體、和實質(zhì)上只由任何另一方構(gòu)成的第二細(xì)胞 集合體接觸配置的工序，其中，間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中至少任何一 方是源自牙胚；在所述支乘載體的內(nèi)部，培養(yǎng)所述第一及第二細(xì)胞集合體，直到得到 牙齒和與其連續(xù)的牙周組織的工序；離析通過所述培養(yǎng)得到的牙周組織的工序。
8. —種牙齒的集合體，其中，該牙齒是通過在支乘載體的內(nèi)部，將實 質(zhì)上只由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的任何一方構(gòu)成的第一細(xì)胞集合 體、和實質(zhì)上只由任何另一方構(gòu)成的第二細(xì)胞集合體接觸配置，并且在所 述支乘載體的內(nèi)部培養(yǎng)所述第一及第二細(xì)胞集合體而得到的，其中，間充 質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的至少任何一方是源自牙胚。
9. 如權(quán)利要求8所述的牙齒的集合體，其中，所述間充質(zhì)系細(xì)胞及上 皮系細(xì)胞全部都是源自牙胚。
10. —種組織的制造方法，是通過間充質(zhì)系細(xì)胞和上皮系細(xì)胞的相互 作用而構(gòu)筑的組織的制造方法，包括在支乘載體的內(nèi)部，將實質(zhì)上只由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的任 何一方構(gòu)成的第一細(xì)胞集合體、和實質(zhì)上只由任何另一方構(gòu)成的第二細(xì)胞 集合體接觸配置的工序；在所述支乘載體的內(nèi)部培養(yǎng)所述第一及第二細(xì)胞集合體的工序。
11. 如權(quán)利要求io所述的組織的制造方法，其中，在所述接觸配置之前還包括調(diào)制第一細(xì)胞集合體的第一調(diào)制工序、和調(diào)整第二細(xì)胞集合體的 第二調(diào)制工序。
12. 如權(quán)利要求10或11所述的組織的制造方法，其中，所述間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的至少一方是源自成為目標(biāo)的組織的細(xì)胞。
13. 如權(quán)利要求10 12中的任何一項所述的組織的制造方法，其中， 所述組織是從由牙齒、毛發(fā)、腎臟、肺以及肝臟構(gòu)成的組中選擇。
全文摘要
將實質(zhì)上只由間充質(zhì)系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中的任何一方構(gòu)成的第一細(xì)胞集合體、和實質(zhì)上只由另一方構(gòu)成的第二細(xì)胞集合體，在可保持細(xì)胞的接觸狀態(tài)的支乘載體的內(nèi)部接觸配置、培養(yǎng)，得到具有特有的細(xì)胞配置的牙齒。優(yōu)選將具有各細(xì)胞集合體的支乘載體在培養(yǎng)后與腎臟細(xì)胞一同培養(yǎng)。
文檔編號C12N5/071GK101189033SQ20068001941
公開日2008年5月28日 申請日期2006年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月30日
發(fā)明者中尾一久, 孝 辻 申請人:學(xué)校法人東京理科大學(xué)