專利名稱：：產(chǎn)生l-谷氨酸的細(xì)菌和用于產(chǎn)生l-谷氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及發(fā)酵工業(yè)，并且本發(fā)明涉及使用棒狀桿菌型細(xì)菌(coryneformbacterium)有效產(chǎn)生L-谷氨酸的方法。
背景技術(shù)：
：通常使用具有產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的屬于短桿菌屬O^W^cfeWwm)或棒桿菌屬(Cwy"eZ^c&n'Mm)等的棒狀桿菌型細(xì)菌通過發(fā)酵來產(chǎn)生L-谷氨酸。為了改進(jìn)這些棒狀桿菌型細(xì)菌的生產(chǎn)力，使用從自然界分離的細(xì)菌菌抹，或它們的人工突變菌林或它們通過基因重組修飾的菌株。作為通過基因重組技術(shù)將產(chǎn)生L-谷氨酸的能力改進(jìn)的棒狀桿菌型細(xì)菌，迄今為止已經(jīng)開發(fā)的是將谷氨酸脫氫酶活性、檸檬酸合酶活性和丙酮酸羧化酶活性增強(qiáng)的^f奉狀桿菌型細(xì)菌(專利文獻(xiàn)l)，將a-酮戊二酸脫氫酶活性、或a-酮戊二酸脫氫酶和異檸檬酸裂合酶活性降低的棒狀桿菌型細(xì)菌(專利文獻(xiàn)2和3)等。同時(shí)，谷氨酸才奉斥干菌(Coo^e^c&n'MWg/wtom/cww)染色體的完整核苦酸序列已經(jīng)測(cè)定(非專利文獻(xiàn)1)。然而，其3099個(gè)推定的orf中的大約40%與功能已知的其它微生物的基因顯示低同源性，其編碼功能未知的蛋白質(zhì)，并且缺失這些基因的影響至今未知。專利文獻(xiàn)1:InternationalPatentPublicationWO00/18935專利文獻(xiàn)2:InternationalPatentPublicationW095/34672專利文獻(xiàn)3:JapanesePatentLaid-open(KOKAI,JP畫A)No.01-296994非專利文獻(xiàn)1:Appl.Microbiol.Biotechnol"62(2-3),pp.99-109(2003)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供將產(chǎn)生L-谷氨酸的能力改進(jìn)的棒狀桿菌型細(xì)菌，和提供使用這種細(xì)菌有效產(chǎn)生L-谷氨酸的方法。本發(fā)明的發(fā)明人為了達(dá)到上述目的進(jìn)行了多方面研究。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)如果在棒狀桿菌型細(xì)菌中將g/wX基因失活，能夠改進(jìn)該細(xì)菌產(chǎn)生L-谷氨酸的能力，并且由此完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)。(1)具有產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的棒狀桿菌型細(xì)菌，對(duì)所述棒狀桿菌型細(xì)菌進(jìn)行修飾以使g/wZ基因失活。(2)根據(jù)(1)的棒狀桿菌型細(xì)菌，通過將突變引入染色體上的g/wX基因或其表達(dá)調(diào)控區(qū)來修飾所述棒狀桿菌型細(xì)菌，以使g/wZ基因的表達(dá)量降低。(3)根據(jù)(1)或(2)的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中將染色體上的g/"X基因破壞。(4)用于產(chǎn)生L-谷氨酸的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)(1)-(3)任一項(xiàng)的棒狀桿菌型細(xì)菌以產(chǎn)生和積累L-谷氨酸；和從所述培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸。附圖簡(jiǎn)述圖1:顯示質(zhì)粒pBS3的構(gòu)建方法的圖示。圖2:顯示質(zhì)粒pBS4S的構(gòu)建方法的圖示。圖3:顯示用于破壞g/wZ的質(zhì)粒pBXGXD的構(gòu)建方法的圖示。優(yōu)選實(shí)施方式描述在下文中，將詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式。<1>本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌用于本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌包括棒桿菌屬細(xì)菌，和曾經(jīng)歸類于短桿菌屬，但是已經(jīng)重新歸類于棒桿菌屬的那些細(xì)菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1981)),并且進(jìn)一步包括屬于極其接近棒桿菌屬的短桿菌屬的細(xì)菌。具體實(shí)例包括以下p者乙醜乙酉吏才奉斥干菌(CV7we6acfen.wwace^acz.<iop/n7Mm)醋谷才奉4干菌(Cor_yMe6acfer/t/wacetog7wtamz'cww)坑醇棒軒菌(Co^yweZacte"'wwa/^awo/,'cww)美棒軒菌(Cwy"e6acfen-畫ca〃ww—谷氨酸棒桿菌百合花棒軒菌(Co/^"e^c欣z'畫朋簡(jiǎn))棲糖蜜棒軒菌(Cc^"e6ac敏/MWme/aweco/a)p者產(chǎn)氛才奉^干菌(C"o^ywe6ac/gn.Mw^^7wo"mz'"oge"es)力士棒軒菌(Cc^"eZacm-廳/ze/rwfo)二:t支-豆^干菌(5;-ev/6acfen'ww(i/van'ca加w)黃色短軒菌(8rev/6ac妙/謂y/av畫)吝'L發(fā)酵4豆4干菌(5rev沾acfeWM附/actoy^附e"ftw2)(谷氨酉交才奉4干菌)玫瑰色短軒菌(&evAfl"en.畫msew附)解糖短軒菌(5rev/6ac妙/wwsacc/zara一c訓(xùn))生石克短軒菌(5reW6ac敏/謂A/oge"/tofc)產(chǎn)氛短桿菌(5wvz'6"c/m'w附"mmo"/age"as)白色少豆沖干菌(B;-eW6acfer/wwa/6ww)錯(cuò)狀短軒菌(5rev/Z)acto^w7ce".w訓(xùn))p耆氨4敖4干菌(Af/cro6ac&n'ww"m附ow/a//w7i/m)具體而言，可包括以下菌林嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870醋谷才奉桿菌ATCC15806烷醇棒桿菌ATCC21511美棒桿菌ATCC15991谷氨酸棒桿菌ATCC13020、ATCC13032、ATCC13060、ATCC13869百合花棒桿菌ATCC15990棲糖蜜棒桿菌ATCC17965嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌AJ12340(FERMBP-1539)力士棒桿菌ATCC13868二歧短桿菌ATCC14020黃色短桿菌ATCC13826、ATCC14067、AJ12418(FERMBP-2205)5rev/Zac/en'wm/7附0"'0/>/2//讓ATCC14068乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13869玫3鬼色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240產(chǎn)氨短桿菌ATCC6871、ATCC6872白色短桿菌ATCC15111蠟狀短4干菌ATCC15112嗜氨微桿菌ATCC15354這些菌株可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)獲得。即，給予每個(gè)菌抹登記號(hào)。使用該登記號(hào)能夠訂購菌抹。對(duì)應(yīng)于各菌抹的登記號(hào)列于ATCC的目錄。根據(jù)布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)的規(guī)定，將AJ12340菌抹于1989年10月27日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NationalInstituteofBioscienceandHumanTechnology,AgencyofIndustrialScienceandTechnology,MinistryofinternationalTradeandIndustry)(目前為，獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心(InternationalPatentOrganismDepositary,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology),^f立于TsukubaCentral6，1-1，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-5466，Japan),并給予登錄號(hào)FERMBP-1539。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，將AJ12418菌株于1989年1月5日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，并給予登錄號(hào)FERMBP-2205。在本發(fā)明中，"產(chǎn)生L-谷氨酸的能力"的意思是當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌時(shí)，在培養(yǎng)基中積累L-谷氨酸的能力。本發(fā)明的細(xì)菌可能具有這種產(chǎn)生L-谷氨酸的能力作為所述棒狀桿菌型細(xì)菌野生菌抹的特性，或所述能力可能是通過培育賦予的性質(zhì)。此外，可以通過下文描述的方式來修飾細(xì)菌以使g/wX失活來賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力。為了通過培育來賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力，可以使用通常用于培育棒狀桿菌型細(xì)菌的方法，例如，用于獲得代謝調(diào)節(jié)突變菌抹、構(gòu)建將目標(biāo)物質(zhì)生物合成系統(tǒng)中的酶增強(qiáng)的重組菌林(參考"AminoAcidFermentation",theJapanScientificSocietiesPress[GakkaiShuppanCenter],1stEdition,publishedonMay30,1986，pp.77-100)等的那些方法。在那些方法中，有待賦予的代謝調(diào)節(jié)突變，或目標(biāo)物質(zhì)合成系統(tǒng)酶的增強(qiáng)等可以單獨(dú)賦予或進(jìn)行，或者可以將它們中的兩個(gè)或更多個(gè)組合賦予?？梢詫⒋x調(diào)節(jié)突變的賦予和生物合成系統(tǒng)酶的增強(qiáng)進(jìn)行組合。在下文中，將描述用于賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的方法。用于通過培育來賦予產(chǎn)生L-谷氨酸能力的方法的實(shí)例包括增強(qiáng)基因的表達(dá)，所述基因編碼涉及L-谷氨酸生物合成的酶。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的實(shí)例包括谷氨酸脫氬酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶、葡糖磷酸異構(gòu)酶等。增強(qiáng)這些基因的表達(dá)能夠通過以下方法完成引入擴(kuò)增質(zhì)粒，通過在適合的質(zhì)粒中引入含有這些基因中任一的DNA片段來獲得所述質(zhì)粒，例如，含有至少負(fù)責(zé)質(zhì)粒在棒狀桿菌型細(xì)菌中復(fù)制的基因的質(zhì)粒載體；通過接合、基因轉(zhuǎn)移等增加這些基因在染色體中的拷貝數(shù)；將突變引入這些基因的啟動(dòng)子區(qū)；或?qū)?dòng)子用更強(qiáng)的啟動(dòng)子替代(參考InternationalPatentPublicationWO00/18935)。當(dāng)擴(kuò)增質(zhì)粒或染色體中的基因時(shí)，用于基因表達(dá)的啟動(dòng)子可以是任何啟動(dòng)子，只要選擇在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子，而且可為所使用的基因的固有啟動(dòng)子。還能夠通過適當(dāng)?shù)剡x擇啟動(dòng)子來控制基因的表達(dá)量。經(jīng)修飾以使檸檬S吏合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、谷氨酸脫氫酶基因和/或異檸檬酸脫氫酶基因的表達(dá)增強(qiáng)的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括InternationalPatentPublicationWO00/18935和EuropeanPatentPublicationNo.1010755中描述的微生物。此外，也可以通過降低或缺失下述酶的活性來獲得賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的修飾，所述酶催化從L-谷氨酸生物合成途徑分支的反應(yīng)以產(chǎn)生另外的化合物。催化合成除L-谷氨酸以外化合物的反應(yīng)的酶的實(shí)例包括異檸檬酸裂合酶、a-酮戊二酸脫氫酶、乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合酶、乙酰乳酸合酶、乙酰曱酸轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、l-吡咯啉脫氫酶(l-pyrrolinedehydrogenase)等。為了降低或缺失上述酶中任一種的活性，可以通過常規(guī)誘變方法，將降低或缺失所述酶胞內(nèi)活性的突變引入染色體上前述酶的基因中。例如，其能夠通過缺失染色體上編碼所述酶的基因，或通過基因重組修飾表達(dá)調(diào)控序列如啟動(dòng)子、Shine-Dalgamo(SD)序列、操縱基因、終止子和弱化子來實(shí)現(xiàn)。此外，其能夠通過引入氨基酸取代的突變ei晉義突變)、終止密碼子(無義突變)或在染色體上的酶編碼區(qū)中添加或缺失一個(gè)或兩個(gè)核苷酸的移碼突變來實(shí)現(xiàn)，或通過將基因部分或整體地缺失來實(shí)現(xiàn)(JoumalofBiologicalChemistry,272:8611-8617(1997))。此外，還能夠通過構(gòu)建編碼突變酶的基因來使酶活性降低或缺失，其中將編碼區(qū)缺失，并且通過同源重組等用構(gòu)建的基因取代染色體上的正常基因。a-酮戊二酸脫氫酶活性降低的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括以下菌才朱，其在JapanesePatentLaid-openNos.07-834672、06-237779、01-296994等中描述。乳發(fā)酵短桿菌AS菌抹(W095/34672)乳發(fā)酵短桿菌AJ12821菌抹(FERMBP-4172;參見FR9401748)黃色短桿菌AJ12822菌林(FERMBP-4173;參見FR9401748)谷氨酸棒桿菌AJ12823菌株(FERMBP-4174;參見FR9401748)賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的其它方法包括賦予對(duì)有機(jī)酸類似物或呼吸抑制劑的抗性，或賦予對(duì)細(xì)胞壁合成抑制劑的敏感性。這些方法的實(shí)例包括，例如賦予只于苯并p比喃酮(benzopirone)或萘醌類(naphtoquinones)的抗性(JP56-1889A)，賦予對(duì)HOQNO的抗性(JP56-140895A),賦予對(duì)a-酮丙二酸的抗性(JP57-2689A),賦予對(duì)胍的抗性(JP56-35981A)，賦予對(duì)青霉素的敏感性(JP04國(guó)88994A)等。這些細(xì)菌的實(shí)例包括以下菌抹黃色短桿菌AJ11355(FERMP-5007;JP56-1889A)谷氨酸棒桿菌AJ11368(FE函P-5020;JP56-1889A)黃色短桿菌AJ11217(FERMP-4318;JP57-2689A)谷氨酸棒桿菌AJ11218(FERMP-4319;JP57-2689A)黃色短桿菌AJ11564(FERMP-5472;JP56-140895A)黃色短桿菌AJ11439(FERMP-5136;JP56-35981A)谷氨酸棒桿菌H7684(FERMBP-3004;JP04-88994A)本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌獲得自親本菌抹，所述親本菌抹也可以是在誘導(dǎo)L-谷氨酸產(chǎn)生的條件下產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌，所述條件如限制生物素的條件、添加表面活性劑的條件和添加青霉素的條件(為了方便，在下文中稱作"產(chǎn)生L-谷氨酸的條件")。"產(chǎn)生L-谷氨酸的條件"意指將誘導(dǎo)L-谷氨酸產(chǎn)生的物質(zhì)添加至培養(yǎng)基的條件，所述培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和痕量有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物，例如氨基酸和維生素(如有需要)；和對(duì)培養(yǎng)基中抑制L-谷氨酸產(chǎn)生的物質(zhì)的量進(jìn)行限制的條件。誘導(dǎo)L-谷氨酸產(chǎn)生的物質(zhì)包括抗生素如青霉素G和包括飽和脂肪酸的表面活性劑如Tween40、60等。抑制L-谷氛酸產(chǎn)生的物質(zhì)包括生物素(AminoAcidFermentation,JapanScientificSocietiesPress1986)。在本文中，在產(chǎn)生L-谷氨酸的條件下培養(yǎng)基中以上物質(zhì)的濃度如下。生物素的濃度少于30(xg/L，優(yōu)選少于20[ig/L,更優(yōu)選少于10jig/L，并且所述培養(yǎng)基可以完全不含生物素。培養(yǎng)基中青霉素的濃度不少于0.1U/ml，優(yōu)選不少于0.2U/ml,更優(yōu)選不少于0.4U/ml。培養(yǎng)基中表面活性劑的濃度不少于0.5g/L，優(yōu)選不少于lg/L,更優(yōu)選不少f2g/L。然而，只要誘導(dǎo)L-谷氨酸的產(chǎn)生，這些物質(zhì)的任何濃度均可以應(yīng)用。此外，當(dāng)培養(yǎng)基含有抗生素或表面活性劑時(shí)，優(yōu)選所述培養(yǎng)基含有高濃度的生物素。在這種情況下，優(yōu)選所述培養(yǎng)基含有多于50jig/L，優(yōu)選多于100pg/L,更優(yōu)選多于200嗎/L的生物素。本發(fā)明中使用的親本菌林的實(shí)例包括上述的棒狀桿菌型細(xì)菌的野生型菌才朱，或以下菌才朱黃色短桿菌AJ11217(FERMP-4318;JP57-2689A)谷氨酸棒桿菌AJ11218(FERMP國(guó)4319;JP57-2689A)乳發(fā)酵短桿菌AJ11426(FERMP-5123JP56-048890A)谷氨酸棒桿菌AJ11440(FERMP-5137JP56-048890A)乳發(fā)酵短桿菌AJ11796(FERMP-6402JP58-158192A)本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌是具有前文所述的產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的棒狀桿菌型細(xì)菌，并且經(jīng)修飾以使g/wZ基因失活。能夠通過修飾具有產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的棒狀桿菌型細(xì)菌以使g/wX基因失活來獲得本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌。在本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌的培育中，既可以首先進(jìn)行產(chǎn)生L-谷氨酸能力的賦予，也可以首先進(jìn)行使g/wX基因失活的修飾。表述"修飾以使g/MX基因失活"相應(yīng)于下述情況與親本菌抹或野生型菌抹相比，由g/^Z基因編碼的GluX蛋白的每細(xì)胞分子數(shù)降低；每分子GluX蛋白的活性降低；完全不再產(chǎn)生GluX蛋白分子等。例如，該表述意指與未修飾的菌抹或野生型菌抹相比，由g/wZ基因編碼的蛋白質(zhì)的量降低；g/wl基因的表達(dá)量降低；對(duì)所述蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，并且由此不能產(chǎn)生正常的GluX蛋白；或完全不能產(chǎn)生棒狀桿菌型細(xì)菌的野生型菌抹或未修飾菌林能夠產(chǎn)生的GluX蛋白。作為參照用于比較的野生型棒狀桿菌型細(xì)菌是例如谷氨酸棒桿菌(乳發(fā)酵短桿菌)ATCC13869或ATCC13032。能夠通過與野生型或未經(jīng)修飾的菌抹比較g/wX的mRNA量來確認(rèn)g/wX基因表達(dá)量的降低。用于確認(rèn)表達(dá)量的方法的實(shí)例包括Northem雜交和RT-PCR(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA)2001)。只要與野生型菌株或未修飾菌林相比有所降低，不對(duì)表達(dá)量的降低程度作具體限制。然而，期望與野生菌株或未修飾菌林相比降低例如至少75%、50%、25%或10%或更少，或可以將表達(dá)完全消除。能夠通過基于使用抗體的Western印跡的檢測(cè)來確認(rèn)由g/wJT基因編碼的蛋白質(zhì)的量的P爭(zhēng)j氐(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA)，2001)。只要與野生型菌抹或未修飾菌林相比有所降低，不對(duì)產(chǎn)量的降低程度作具體限制。然而，期望與野生菌株或未修飾菌林相比降低例如至少75%、50%、25%或10%或更少，或可以將活性完全消除，其意味著完全不產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)。由g/wX基因編碼的本發(fā)明所指的蛋白質(zhì)(GluX蛋白)是通過失活染色體上的g/MZ基因而具有改進(jìn)L-谷氨酸產(chǎn)量的功能的蛋白質(zhì)。在本文中，棒狀桿菌型細(xì)菌的GluX蛋白的實(shí)例包括由谷氨酸棒桿菌(乳發(fā)酵短桿菌)ATCC13869或谷氨酸棒桿菌ATCC13032的g/wZ基因(SEQIDNO:16的核苷酸號(hào)1001至1279)編碼的蛋白質(zhì)(SEQIDNO:17)。谷氨酸棒桿菌ATCC13032的g/wX基因由登記為GenbankAccessionNo.NC—003450的基因組序列的核香酸2475838至2476119編碼，并且登記為NCg12252。此外，因?yàn)間/^X基因的核苷酸序列可能依賴于棒狀桿菌型細(xì)菌的菌種或菌林而有差異，g/wZ基因可以是SEQIDNO:16的核苷酸號(hào)1001至1279的核香酸序列的變體。參照SEQIDNO:16的核苷酸號(hào)1001至1279的核苷酸序列，4吏用BLAST或類似方法(http://blast.genome.jp/),能夠搜索g/wX基因的變體。此外，g/wX基因的變體包括g/wZ基因同源物(homologue)，例如，能夠使用棒狀桿菌型細(xì)菌的染色體作為模板和SEQIDNOS:13和14的合成寡核苷酸通過PCR擴(kuò)增的基因。GluX蛋白的實(shí)例包括具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的那些。然而，因?yàn)槭褂玫拿艽a子可能依賴于棒狀桿菌型的菌種或菌抹而有差異，并且所述編碼GluX的基因的核苷酸序列可能有差異，g/wZ可以編碼包括取代、缺失、插入或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的如上所述的氨基S臾序列，只要不改變GluX蛋白的功能。在本文中，術(shù)語"幾個(gè)"所指的數(shù)目是例如2至20，優(yōu)選2至10，更優(yōu)選2至5。前述取代、缺失、插入或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基是保守突變，所述保守突變?cè)试S正常產(chǎn)生GluX蛋白。保守突變包括在芳族氨基酸的情況下Phe、Trp和Tyr的相互取代；在疏水氨基酸的情況下Leu、Ile和Val的相互取代；在極性氨基酸的情況下Gln和Asn的相互取代；在堿性氨基酸的情況下Arg、Lys和His的相互取代；在酸性氨基酸的情況下Asp和Glu的相互取代；和在含羥基氨基酸的情況下Ser和Thr的相互取代。典型的保守突變是保守取代，所述保守取代包括以Ser或Thr取代Ala,以Gln、His或Lys取代Arg，以Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn,以Asn、Glu或Gln耳又代Asp，以Ser或Ala取代Cys,以Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg耳又代Gln，以Gly、Asn、Gln、Lys或Asp耳又代Glu,以Pro耳又代Gly，以Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr耳又代His,以Leu、Met、Val或Phe取代Ile，以Ile、Met、Val、Phe取代Leu,以Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，以Ile、Leu、Val或Phe取代Met，以Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，以Thr或Ala耳又代Ser，以Ser或Ala取代Thr，以Phe或Tyr取代Trp，以His、Phe或Trp取代Tyr和以Met、Ile或Leu取代Val。g/wZ基因的變體還可以是能夠與由SEQIDNO:16的1001至1279組成的核苷酸序列或能夠從所述核芬酸序列制備的探針在嚴(yán)緊條件下雜交的DNA。所述"嚴(yán)緊條件"是形成所謂的特異性雜合體(hybrid),而不形成非特異性雜合體的條件。嚴(yán)緊條件的實(shí)例包括那些條件，在該條件下高度同源的DNA互相雜交，例如，不少于80、90、95或97。/。同源的DNA相互雜交，并且比以上所述同源性^^的DNA不相互雜交；或在相應(yīng)于常^見Southem雜交洗滌的鹽濃度和溫度下，即lxSSC、0.10/。SDS在60。C,優(yōu)選O.lxSSC、0.1%SDS在60。C，更優(yōu)選0.1xSSC、0.1%SDS在68。C洗滌一次或優(yōu)選2或3次。4笨針的長(zhǎng)度可以依賴于雜交條件任意地選擇。但是，所述長(zhǎng)度通常是100bps至lkbps。表述"修飾以使g/wZ基因失活"的意思是進(jìn)行修飾以使GluX蛋白不發(fā)揮正常功能。以這種方式修飾的細(xì)菌能夠通過培育以下細(xì)菌獲得使用試劑等將突變引入GluX蛋白中以使所述蛋白質(zhì)不正常發(fā)揮功能的細(xì)菌；通過基因工程技術(shù)等將突變引入g/MZ基因中以使GluX蛋白的量降低的細(xì)菌；或不再產(chǎn)生GluX蛋白的細(xì)菌等。這可以通過例如缺失染色體上的g/wZ基因，或通過修飾表達(dá)調(diào)控序列例如啟動(dòng)子、ShineDargarno(SD)序列等來完成。此外，所述修飾還可以通過引入氨基酸取代(錯(cuò)義突變)、終止密碼子(無義突變)或在編碼區(qū)添加或缺失一個(gè)或兩個(gè)核苷酸的移碼突變，或通過缺失部分或完整的基因來完成(JoumalofbiologicalChemistry272:8611-8617(1997)，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA955511-5515(1998),JournalofBiologicalChemistry266,20833-20839(1991》。作為待缺失的區(qū)域，可以將N-末端側(cè)的區(qū)域或C-末端側(cè)的區(qū)域缺失，只要產(chǎn)生不正常發(fā)揮功能的GluX蛋白。此外，還能夠通過將轉(zhuǎn)座子引入g/wZ的編碼區(qū)來獲得g/wX基因的失活，所述轉(zhuǎn)座子攜帶抗生素抗性基因或?qū)-谷氨酸的產(chǎn)生有用的基因。能夠通過例如以下方法實(shí)現(xiàn)將如上所述的這些突變引入g/Ml基因制備通過修飾獲得的缺失型基因，所述修飾使基因包括部分g/^Z序列的缺失并且不產(chǎn)生正常發(fā)揮功能的GluX蛋白；和用含有所述基因的DNA轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌，以引起缺失型基因和染色體上基因的同源重組，并且因此破壞染色體上的g/wX基因。已經(jīng)確定了這種基于同源重組使用基因取代的基因破壞，并且這種方法的實(shí)例包4舌DatsenkoandWanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000，Vol.97，No.12,pp.6640-6645)開發(fā)的稱為"Red-driven整合"的使用線性DNA的方法，或使用含有溫度每文感復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法(U.S.PatentNo.6,303,383，JapanesePatentLaid-openNo.05-007491)等。此外，這種如上所述使用同源重組基于基因取代的基因破壞還能夠使用質(zhì)粒進(jìn)行，所述質(zhì)粒在宿主中不顯示復(fù)制能力，或所述質(zhì)粒能夠接合轉(zhuǎn)移至棒狀桿菌型細(xì)菌。用于^f奉狀桿菌型細(xì)菌的溫度專丈感質(zhì)粒的實(shí)例包括p48K和pSFKT2(對(duì)于這些參見JapanesePatentLaid-openNo.2000-262288),pHSC4(參見FrenchPatentLaid-openNo.2667875,1992andJapanesePatentLaid-openNo.5-7491)等。在棒狀桿菌型細(xì)菌中，這些質(zhì)粒能夠在至少25。C自主復(fù)制，但是不能在37。C自主復(fù)制。將含有pHSC4的大腸桿菌AJ12571于1990年10月11日保藏在國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(theNationalInstituteofBioscienceandHuman-Technology,theAgencyofIndustrialScienceandTechnology,theMinistryofInternationalTradeandIndustry)(目前為，獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許《鼓生物保藏中心(TsukubaCentral6,1-1,Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,Japan,郵編305-5466))，并得到保藏號(hào)FERMP-ll763。然后根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，在1991年8月26日將所述保藏轉(zhuǎn)化為國(guó)際保藏，并得到保藏號(hào)FERMBP-3524。作為不在棒狀桿菌型細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒，優(yōu)選在大腸桿菌中能夠復(fù)制的質(zhì)粒，實(shí)例包括pHSG299(TakaraBioInc.)、pHSG399(TakaraBioInc.)等。能夠接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的實(shí)例包括pK19mobsacB(J.Bacteriology,174:5462-65(1992))。經(jīng)修飾而不產(chǎn)生GluX蛋白的缺失型基因的實(shí)例包括包括SEQIDNO:16的整體或部分區(qū)域缺失的基因；引入錯(cuò)義突變的基因；插入轉(zhuǎn)座子或標(biāo)記基因的基因；引入無義突變的基因；和引入移碼突變的基因；但是實(shí)例不限于這些基因。g/wX基因的失活可以通過以下方法進(jìn)行。g/wZ基因的缺失型基因能夠通過以下方法獲得。g/t/X基因能夠如下獲得通過SaitoandMiura(參見H.SaitoandK.Miura，Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963》TextforBioengineeringExperiments,EditedbytheSocietyforBioscienceandBioengineering,Japan,pp.97-98,Baifukan，1992)的方法，從棒狀桿菌型細(xì)菌制備染色體DNA;和使用寡核苷酸用所述染色體DNA進(jìn)行PCR，所述寡核苷酸基于已知數(shù)據(jù)庫如Genbank的序列構(gòu)建，并且能夠使用SEQIDNOS:13和14的合成寡核苦酸克隆基因。能夠通過如下獲得缺失型基因用PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)g/wZ基因，并且用切割內(nèi)部位點(diǎn)的限制酶消化PCR產(chǎn)物；或用PCR擴(kuò)增g/wZ基因的編碼區(qū)部分。隨后，將缺失型基因引入棒狀桿菌型細(xì)菌中溫度敏感的質(zhì)粒，或在棒狀桿菌型細(xì)菌中不能復(fù)制的質(zhì)粒；并且用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌。轉(zhuǎn)化可以根據(jù)至今已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)化方法的實(shí)例包括用氯化4丐處理受體細(xì)胞以增加DNA透過性，已有報(bào)導(dǎo)將該方法用于大腸桿菌K-12(Mandel，MandHiga,A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970》；和/人處于生長(zhǎng)期的細(xì)月包制備感受態(tài)細(xì)胞，接著用DNA轉(zhuǎn)化，已有報(bào)導(dǎo)將該方法用于枯草芽孢桿菌C6adssw6"嗣(Duncan,C.H.,Wilson,GA.andYoung,F.E.,Gene,1,153(1977))?；蛘撸部梢圆捎脤⒅亟MDNA引入受體細(xì)胞，已有報(bào)導(dǎo)可將這種方法用于枯草芽孢桿菌、放線菌類和酵母的受體細(xì)胞(Chang,S.andChoen，S.N.,Molec.Gen.Genet.，168，111(1979);Bibb,M丄，Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hi畫n,A.,Hicks，J.B.andFink,GR.,Proc.Natl.Sci"USA,75，1929(1978))。此外，也能夠通過電脈沖方法進(jìn)行棒狀桿菌型細(xì)菌的轉(zhuǎn)化(JP2-207791A)。當(dāng)使用在棒狀桿菌型細(xì)菌中不復(fù)制的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，在如上所述獲得的轉(zhuǎn)化體中質(zhì)粒上的g/wI基因和染色體上的g/^X基因進(jìn)行重組。當(dāng)使用溫度敏感質(zhì)粒時(shí)，將轉(zhuǎn)化體在溫度敏感復(fù)制起點(diǎn)不發(fā)揮功能的溫度(25。C)培養(yǎng)以獲得引入所述質(zhì)粒的菌林。將引入所述質(zhì)粒的菌抹在高溫培養(yǎng)以消除溫度敏感質(zhì)粒，并且將這種菌抹涂布在含有抗生素的平板上。由于溫度敏感質(zhì)粒不能在高溫增殖，將質(zhì)粒消除的菌林無法在含有抗生素的平板上生長(zhǎng)，但是質(zhì)粒上的g/wZ基因和染色體上的g/wZ基因重組的菌抹將出現(xiàn)，盡管這種菌株出現(xiàn)的概率極低。在如上所述染色體中引入了重組DNA的菌株中，引起與原先存在于染色體上的g/wJT基因序列的重組，并且因此在染色體中插入染色體g/wX基因和缺失型g/wZ基因的兩種融合基因，和所述融合基因之間的重組DNA的其它部分(載體部分、溫度每文感復(fù)制起點(diǎn)和藥物抗性標(biāo)記)。然后為了在染色體DNA上只保留缺失型g/wX基因，將g/^Z基因與載體部分(包括溫度敏感復(fù)制起點(diǎn)和藥物抗性標(biāo)記)一起從染色體DNA上消除。在這種情況下，將正常g/wZ基因保留在染色體DNA上，并且將缺失型g/wZ基因切除；或與之相反，將缺失型g/wZ基因保留在染色體DNA上，并且將正常g/wX基因切除。通過用PCR或Southem雜交來選擇將缺失型g/wX基因保留在染色體上的菌抹，能夠獲得將g/wZ基因破壞的菌抹。此外，在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮致死功能的編碼果聚糖蔗糖酶的MC^基因，也可以用作同源重組的標(biāo)記(Schafer,A.etal.，Gene,145,pp.69-73(1994》。即，如果果聚糖蔗糖酶在棒狀桿菌型細(xì)菌中表達(dá)，由蔗糖同化產(chǎn)生的果聚糖發(fā)揮致死功能，因而所述細(xì)菌不能生長(zhǎng)。因此，如果將編碼果聚糖蔗糖酶的載體保留在染色體上的菌林在含有蔗糖的平板中培養(yǎng)，所述菌抹不能生長(zhǎng)，因此只有消除所述載體的菌林能夠在含有蔗糖的平板上選出。作為^cS基因或其同源基因，可以使用以下序列。枯草芽孢桿菌^c5GenBankAccessionNumberX02730(SEQIDNO:7)解5定4分芽孑包^干菌(5flc/〃wsam_y/o//《we々c/em):sacSGenBankAccessionNumberX52988運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z，owo"osmoM/力sacBGenBankAccessionNumberL33402嗜熱月旨肪芽孑包桿菌(5腦7/wsWewo/ZzemopM"":swr萬GenBankAccessionNumberU34874丄acto6腦7/wsa腦、ce服S:GenBankAccessionNumberAJ508391Jceto&"erxy/zV2紅/sx4GenBankAccessionNumberAB03415214G7wcowaceto6ac^d/azo/ra//z/c紅Zs<iv4GenBankAccessionNumberL41732除了前文所述的將染色體上編碼g/wX的基因缺失之外，還能夠通過引入通過修飾表達(dá)調(diào)控序列如啟動(dòng)子、Shine-Dalgamo(SD)序列、操縱基因、終止Genetix,或用于表達(dá)分析的載體如啟動(dòng)子探針載體，或基于已知信息如獲得自Genbank等的信息，能夠確定染色體上的表達(dá)調(diào)控序列。使g/^Z失活的突變是例如用較弱啟動(dòng)子取代g/wZ啟動(dòng)子區(qū)的突變，或使啟動(dòng)子遠(yuǎn)離共有序列的突變。使用溫度敏感質(zhì)?；虿痪哂袕?fù)制能力的質(zhì)粒能夠?qū)崿F(xiàn)這些突變的引入，如前文所述的情況。除了前文所述的基因操作方法之外，用于使g/wl失活的方法的實(shí)例包括，例如，用紫外照射或用于常規(guī)誘變的誘變劑如N-曱基-N，-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸處理棒狀桿菌型細(xì)菌，并且選擇g/wZ失活的菌抹。此外，還能夠通過用基于易錯(cuò)PCR、DNA改組或SffiP-PCR(FirthAE,PatrickWM，Bioinformatics,2005Jun2,Statisticsofproteinlibraryconstruction)的基因重纟且人工將突變引入g/wX來獲得失活的g/wX基因。<3>使用本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌產(chǎn)生L-谷氨酸能夠通過如下方法有效地產(chǎn)生L-谷氨酸在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述獲得的棒狀桿菌型細(xì)菌，以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸；和從所述培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸。為了使用本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌產(chǎn)生L-谷氨酸，可以通過常規(guī)方法使用普通培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所述普通培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和任選地有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)物(micronutrients)如氨基酸和維生素?？梢允褂煤铣膳囵B(yǎng)基或天然培養(yǎng)基?？梢允褂萌魏畏N類的碳源和氮源，只要它們能夠被所培養(yǎng)的菌林利用。糖類例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物、糖蜜等可以用作碳源。另外，有機(jī)酸例如乙酸和檸檬酸，和醇例如乙醇也可以單獨(dú)使用或與其它碳源組合使用。氨、銨鹽例如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨和醋酸銨、硝酸鹽等可以用作氮源?？蓪被?、維生素、脂肪酸、核酸，和含有這些物質(zhì)的胨、酪蛋白氨基酸(casaminoacid)、酵母提取物和大豆蛋白分解物用作有機(jī)樣i量營(yíng)養(yǎng)物。當(dāng)使用生長(zhǎng)需要氨基酸等的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌林時(shí)，優(yōu)選加入這樣的所需的營(yíng)養(yǎng)物。磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等可以用作無機(jī)鹽。通過將發(fā)酵溫度控制在20至45。C并且將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至5-9來進(jìn)行需氧培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間當(dāng)pH降低時(shí)，通過添加堿例如碳酸4丐或氨氣來中和培養(yǎng)基。培養(yǎng)大約10至大約120小時(shí)導(dǎo)致在培養(yǎng)基中積累可觀量的L-谷氨酸，其通過利用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生。當(dāng)用于本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌是在誘導(dǎo)L-谷氨酸產(chǎn)生的條件如限制生物素的條件、添加表面活性劑的條件和添加青霉素的條件下產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌時(shí)，優(yōu)選將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至這些L-谷氨酸產(chǎn)生條件中的任一。在本文中，以上物質(zhì)在培養(yǎng)基中的濃度如下。生物素的濃度少于30嗎/L,優(yōu)選少于20嗎/L，更優(yōu)選少于10pg/L,并且所述培養(yǎng)基可以完全不含生物素。培養(yǎng)基中青霉素的濃度不少于O.lU/ml，優(yōu)選不少于0.2U/ml，并且更優(yōu)選不少于0.4U/ml。培養(yǎng)基中表面活性劑的濃度不少于0.5g/L，優(yōu)選不少于lg/L，更優(yōu)選不少于2g/L。然而，只要誘導(dǎo)L-谷氨酸的產(chǎn)生，這些物質(zhì)的任何濃度均可應(yīng)用。將抗生素或表面活性劑加入培養(yǎng)基時(shí)，優(yōu)選所述培養(yǎng)基含有足夠量的生物素。在這種情況下，優(yōu)選所述培養(yǎng)基含有多于50嗎/L,優(yōu)選多于IOO嗎/L，并且更優(yōu)選多于200嗎/L的生物素。此外，還能夠使用液體培養(yǎng)基以在培養(yǎng)基中使L-谷氨酸析出的方式進(jìn)行培養(yǎng)，將所述液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至L-谷氨酸在培養(yǎng)基中析出的條件。L-谷氨酸析出的條件的實(shí)例包括pH5.0-4.0，優(yōu)選pH4.5至4.0,更優(yōu)選pH4.3至4.0,特別優(yōu)選pH4.0。在培養(yǎng)之后可以通過已知方法從培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸。例如，通過從培養(yǎng)基中去除細(xì)胞，和通過濃縮引起結(jié)晶，通過離子交換層析等來完成收集。當(dāng)在L-谷氨酸析出的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可通過離心或過濾來收集培養(yǎng)基中析出的L-谷氨酸。在這種情況下，可以將溶解在培養(yǎng)基中的L-谷氨酸析出然后一起分離。實(shí)施例在下文中，將參考以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明。然而，本發(fā)明不限于所述實(shí)施例。實(shí)施例l:用于破壞^c5基因的載體的構(gòu)建(A)pBS3的構(gòu)建使用枯草芽孢桿菌的染色體DNA作為模板和SEQIDNOS:l和2的寡核苦酸作為引物通過PCR獲得^W基因(SEQIDNO:7)。使用LATaq(TaKaRa)進(jìn)行PCR,在94。C溫育5分鐘，并且將94。C變性30秒、49。C退火30秒和72。C延伸2分鐘的循環(huán)重復(fù)25次。將PCR產(chǎn)物以常規(guī)方式純化，然后通過用Sg/II和5amHI的消化來平端化。將這種片^a插入已經(jīng)用爿vall切割并且平端化的pHSG299。使用這種DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(TakamBioInc.)，并且將所述細(xì)胞涂布在含有25嗎/ml卡那霉素(以下簡(jiǎn)寫為Km)的LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)過夜。其后，收集出現(xiàn)的菌落，并且分離獨(dú)立的單菌落以獲得轉(zhuǎn)化體。從所得轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒，并且將插入了目標(biāo)PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒命名為pBS3。pBS3的構(gòu)建方案示于圖l。(B)pBS4S的構(gòu)建由于pBS3中存在的卡那霉素抗性基因中含有限制酶Smal的識(shí)別位點(diǎn)，通過交換PCR獲得攜帶6Vwal位點(diǎn)被破壞的卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒，所述破壞通過不引起氨基酸取代的核普酸取代進(jìn)行。首先，使用pBS3作為模板和SEQIDNOS:3和4的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR以獲得卡那霉素抗性基因N末端側(cè)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。然后，為了獲得Km抗性基因C末端側(cè)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，使用pBS3作為模板和SEQIDNOS:5和6的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR。目標(biāo)PCR產(chǎn)物能夠通過使用PyrobestDNA聚合酶(TakaraBioInc.)如下進(jìn)行PCR來獲得在98。C溫育5分鐘，并且將98。C變性10秒、57。C退火30秒和72。C延伸1分鐘的循環(huán)重復(fù)25次。SEQIDNOS:4和5的序列彼此部分互補(bǔ)，并且曾經(jīng)存在于這些序列中的5V^I位點(diǎn)已通過不引起氨基酸取代的核香酸取代破壞。其后，為了獲得將Smd位點(diǎn)破壞的突變卡那霉素抗性基因片段，將前述卡那霉素抗性基因的N末端側(cè)序列和C末端側(cè)序列的基因產(chǎn)物以基本上等摩爾地混合，并且使用這種混合物作為模板和SEQIDNOS:3和6的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得引入了突變的Km抗性基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。能夠通過使用PyrobestDNAPolymerase(TakaraBioInc.)如下進(jìn)行PCR來獲得PCR產(chǎn)物在98。C溫育5分鐘，并且將98。C變性10秒、57。C退火30秒和72。C延伸1.5分鐘的循環(huán)重復(fù)25次。將PCR產(chǎn)物以常規(guī)方式純化，然后用萬fl"II消化，并且插入上述pBS3的5a"II位點(diǎn)。用獲得的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(TakaraBioInc.),并且將細(xì)胞涂布在含有25嗎/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，并培養(yǎng)過夜。其后，將單菌落從出現(xiàn)的菌落中分離以獲得轉(zhuǎn)化體。從獲得的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并且將插入了目標(biāo)PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒命名為pBS4S。pBS4S的構(gòu)建方案示于圖2。實(shí)施例2:谷氨酸棒桿菌ATCC13869的g/wX缺陷型菌抹的制備制備用于缺失g/wX基因的質(zhì)粒。使用BacterialGenomicDNAPurif.Kit(MSTechnoSystems)從谷氨酸棒桿菌ATCC13869提取染色體，并且使用這種染色體作為模板，以及SEQIDNOS:9和10的引物組合，和SEQIDNOS:11和12的引物組合，分別擴(kuò)增大約650bp的片段。使用ExTaq(TakaraBioInc.)進(jìn)行PCR，其中將94。C變性30秒、55。C退火30秒和72。C延伸1分鐘的循環(huán)重復(fù)25次。設(shè)計(jì)引物SEQIDNOS:9和10以擴(kuò)增SEQIDNO:16的核香酸號(hào)401至1040的區(qū)域，并且設(shè)計(jì)引物SEQIDNOS:11和12以擴(kuò)增SEQIDNO:16的核香酸號(hào)1241至1920的區(qū)域。其后，將這兩種片段混合制成溶液，使用這種溶液作為模板和SEQIDNOS:13和14的引物進(jìn)行PCR以擴(kuò)增大約1.3kb的片段。使用ExTaq(TakaraBioInc,)進(jìn)行PCR,其中將94。C變性30秒、55。C退火10秒和72。C延伸1.5分鐘的循環(huán)重復(fù)25次。設(shè)計(jì)引物SEQIDNOS:13和14以將S"mHI序列添加至5，端，并且擴(kuò)增SEQIDNO:16的核苦酸號(hào)441至1870的區(qū)域(包括核苷酸號(hào)1041至1240區(qū)域的缺失)。將擴(kuò)增的片段用B"wHI完全消化，并且連接至已經(jīng)相似地用SamHI完全消化的實(shí)施例1中所述的pBS4S載體(使用LigationKitVer.2(TakaraBioInc.)),以構(gòu)建g/wX破壞的載體pBSGXD。構(gòu)建方案示于圖3。將pBSGXD通過電脈沖方法(JapanesePatentLaid-openNo.2畫207791)引入谷氨酸棒桿菌ATCC13869，并且將細(xì)胞涂布在含有25嗎/ml卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基(5g/l葡萄糖、10g/l聚胨、10g/l酵母提取物、1g/lKH2P04、0.4g/lMgSO4.7H2O、0.01g/lFeS04.7H20、0.01g/1MnS04.4-5H20、3g/l尿素、1.2g/l大豆蛋白水解物、20g/l瓊脂，用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.5)上。在31.5。C進(jìn)行培養(yǎng)，然后通過PCR確認(rèn)了生長(zhǎng)的菌林是通過同源重組將pBSGXD并入染色體中的一次重組菌抹(onetime-recombinantstrain)。能夠使用菌抹的染色體作為模板，pBS4S上的特異性序列(SEQIDNO:15)和染色體上的序列(SEQIDNO:9)作為引物通過進(jìn)行PCR來筒單地確認(rèn)候選菌抹是否為一次重組菌林。由于pBS4S的序列不存在于非重組菌株的染色體上，PCR擴(kuò)增的任何片段都不會(huì)出現(xiàn)于(appearfor)非重組菌林，由此能夠進(jìn)行鑒別。將獲得的一次重組菌抹在含有25嗎/ml卡那霉素的CM-Dex液體培養(yǎng)基中在31.5。C培養(yǎng)一整天，并且將這種培養(yǎng)液適當(dāng)?shù)叵♂?，再涂布至S10平板上(具有上述CM-Dex培養(yǎng)基的成分，其中將5g/l葡萄糖用100g/l蔗糖替換)。選擇了幾個(gè)在S10平板上生長(zhǎng)并且表現(xiàn)出卡那霉素敏感性的菌株，并且使用這些菌抹的染色體作為才莫板和SEQIDNOS:13和14的序列作為引物進(jìn)4亍PCR,確認(rèn)了它們之中的一個(gè)菌抹是目標(biāo)的g/MX缺陷型菌林。由于在缺陷型菌抹中缺失核苷酸號(hào)1041至1240的區(qū)域，所以擴(kuò)增的片段短于非缺陷型菌抹的擴(kuò)增片段，因此能夠進(jìn)行鑒別。將如所述獲得的缺陷型菌抹命名為ATCC13869AgluX。實(shí)施例3:ATCC13869AgluX菌林的谷氨酸產(chǎn)量的測(cè)量通過使用Sakaguchi搖瓶進(jìn)行培養(yǎng)來檢驗(yàn)ATCC13869AgluX菌抹的谷氨酸產(chǎn)生能力。將ATCC13869和ATCC13869AgluX菌林在31.5。C在CM-2B瓊脂培養(yǎng)基(10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/lNaCl、10jig/l生物素、20g/l瓊脂，用KOH調(diào)節(jié)至pH7.0)上培養(yǎng)一整天，并且接種至20ml種子培養(yǎng)基(50g/l葡萄糖、30g/l硫酸銨、Ig/1KH2P04、0.4g/1MgS04'7H20、0.01g/1FeSO(7H20、0.01g/lMnS04'4-5H20、200昭/l維生素Bl、0.48g/l大豆蛋白水解物、300生物素，用KOH調(diào)節(jié)至pH8.0)中。將lg事先經(jīng)過干熱滅菌的碳酸釣添加至培養(yǎng)基，其后在31.5。C以115rpm的速度搖動(dòng)進(jìn)行培養(yǎng)。在確認(rèn)了全部糖被完全消耗之后，將lml種子培養(yǎng)液接種至20ml主培養(yǎng)基中(50g/l葡萄糖、30g/l硫酸銨、1g/1KH2P04、0.4g/1MgS04'7H20、0,01g/1FeS04.7H20、0.01g/1MnS04'4-5H20、200嗎/l維生素Bl、0.48g/l大豆蛋白水解物、300pg/l生物素，用KOH調(diào)節(jié)至pH8.0)，其后添加lg事先經(jīng)過干熱滅菌的碳酸4丐，然后在31.5。C以115rpm的速率搖動(dòng)進(jìn)行培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)2.5小時(shí)之后，添加4g/1Tween40(Sigma)。17.5小時(shí)后的細(xì)胞量(在620nm測(cè)量吸光度)、積累的谷氨酸量和殘余的糖量示于表l。確認(rèn)了ATCC13869AgluX菌株的谷氨酸積累與ATCC13869相比有增加，并且由此確認(rèn)了g/^Z基因的缺失對(duì)于改進(jìn)谷氨酸產(chǎn)生有效。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，在使用棒狀桿菌型細(xì)菌通過發(fā)酵產(chǎn)生L-谷氨酸的方法中能夠?qū)-谷氨酸的發(fā)酵收率(fermentationyield)增加。此外，本發(fā)明能夠用于培育產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌。權(quán)利要求1.具有產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的棒狀桿菌型細(xì)菌，對(duì)所述棒狀桿菌型細(xì)菌進(jìn)行修飾以使gluX失活。2.根據(jù)權(quán)利要求1的棒狀桿菌型細(xì)菌，通過在染色體上的g/wX基因或其表達(dá)調(diào)控區(qū)中引入突變來修飾所述棒狀桿菌型細(xì)菌，以使g/^r基因的表達(dá)量降低。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中將染色體上的所述g/^基因破壞。4.用于產(chǎn)生L-谷氨酸的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)的棒狀桿菌型細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)以產(chǎn)生和積累L-谷氨酸，和從所述培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸。全文摘要用于產(chǎn)生L-谷氨酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產(chǎn)生L-谷氨酸的能力并且經(jīng)修飾以使gluX失活的棒狀桿菌型細(xì)菌，以在培養(yǎng)基或細(xì)胞中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸；和從所述培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸。文檔編號(hào)C12N1/21GK101248169SQ20068003115公開日2008年8月20日申請(qǐng)日期2006年8月23日優(yōu)先權(quán)日2005年8月26日發(fā)明者中村純,伊藤久生,平野圣子申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社