專利名稱：一種ShRNA的克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種ShRNA的克隆方法。
背景技術(shù)：
小干擾核糖核酸(siRNA)具有基因沉默作用，發(fā)夾狀核糖核酸(ShRNA)是siRNA的一種。有研究顯示，無(wú)論是根據(jù)微小核糖核酸(miRNA)設(shè)計(jì)的ShRNA，或基于siRNA的ShRNA在體內(nèi)都表現(xiàn)出有效地基因抑制作用，效果較別的siRNA方法更好。
ShRNA的常規(guī)制備方法主要有兩種體外轉(zhuǎn)錄合成ShRNAs法和編碼ShRNA的轉(zhuǎn)錄DNAs法。
體外轉(zhuǎn)錄合成ShRNAs法，是按照生命合成RNA過(guò)程的原理，用轉(zhuǎn)錄方法來(lái)合成ShRNAs，其ShRNA最接近生命自然狀態(tài)中的dsRNA，RNA干擾效果也最好。較化學(xué)合成而言，體外轉(zhuǎn)錄制備ShRNA的優(yōu)勢(shì)在于成本低、質(zhì)量高、毒性小和穩(wěn)定性均較好。轉(zhuǎn)錄ShRNAs只要較低的濃度就可以達(dá)到化學(xué)合成ShRNAs較高濃度得到的效果；而且，直接使用dsRNA易轉(zhuǎn)染，非常有效，使用范圍也較廣。但是，由于在哺乳動(dòng)物中不存在RNAi的擴(kuò)增機(jī)制，導(dǎo)入RNA產(chǎn)生的RNAi作用不可避免的具有瞬時(shí)性。為了克服這個(gè)弱點(diǎn)，現(xiàn)已發(fā)展了基于DNA載體在體內(nèi)表達(dá)siRNA的技術(shù)，即編碼ShRNA的轉(zhuǎn)錄DNAs法。
傳統(tǒng)的ShRNA克隆方法，是將載體用限制性內(nèi)切酶雙酶切得到線性化的載體；需要同時(shí)合成兩種序列不完全相同的寡核苷酸片段，這兩種寡核苷酸片段在退火后形成雙鏈DNA片段；載體和雙鏈DNA片段通過(guò)T4 DNA連接酶連接，得到環(huán)型的DNA分子。最后將連接得到的DNA分子轉(zhuǎn)化細(xì)菌，通過(guò)篩選得到正確的基因克隆。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于對(duì)傳統(tǒng)的ShRNA克隆方法進(jìn)行改進(jìn)，從而提供一種新型的ShRNA克隆方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種用于所述ShRNA克隆的載體。
本發(fā)明的ShRNA克隆方法包括制備合適的載體，將載體和雙鏈DNA片段連接得到環(huán)形的DNA分子，其特征在于
只合成一種寡核苷酸片段，該寡核苷酸片段由回文結(jié)構(gòu)部分和突出部分兩部分組成，兩條所述寡核苷酸片斷在退火后能夠通過(guò)回文結(jié)構(gòu)互補(bǔ)配對(duì)而形成雙鏈DNA片段；所述載體的兩端具有堿基序列相同的突出端，且同為5’端或3’端的突出端；所述寡核苷酸片段突出部分的堿基序列與所述載體的突出端堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。
根據(jù)本發(fā)明，所述載體的突出端長(zhǎng)度為1-5個(gè)堿基，所述堿基包括A、T/U、C、G(T和U在突出堿基中視為地位等同)。
根據(jù)本發(fā)明，所述寡核苷酸片斷的突出部分的長(zhǎng)度為1-5個(gè)堿基，所述堿基包括A、T/U、C、G(T和U在突出堿基中視為地位等同)。
根據(jù)本發(fā)明，最后還包括將連接得到的DNA分子轉(zhuǎn)化細(xì)菌，通過(guò)篩選得到正確的基因克隆。
本發(fā)明的用于ShRNA克隆的載體，其兩端具有堿基序列相同的突出端，且同為5’端或3’端的突出端。
根據(jù)本發(fā)明，所述突出端長(zhǎng)度為1-5個(gè)堿基，所述堿基包括A、T/U、C、G(T和U在突出堿基中視為地位等同)。
利用本發(fā)明提供的載體以及ShRNA克隆方法，只需合成一種寡核苷酸片段(該寡核苷酸片段由回文結(jié)構(gòu)部分和突出部分兩部分組成，兩條所述寡核苷酸片斷在退火后能夠通過(guò)回文結(jié)構(gòu)互補(bǔ)配對(duì)而形成雙鏈DNA片段)，便可以方便、迅速地實(shí)現(xiàn)ShRNA克隆，不僅簡(jiǎn)化了操作，而且成功率高。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件進(jìn)行。
實(shí)施例1、sip53的ShRNA克隆在本實(shí)施例中，突出部分在載體的5’端。
1.1、載體片段制備取pSilencerTM2.0-U6載體(購(gòu)自Ambion公司)10μg，于37℃，BamH I酶切20小時(shí)；取酶切后產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)并回收長(zhǎng)度約為3100bp的pSilencerTM2.0-U6載體片段。
將收獲的pSilencerTM2.0-U6載體片段進(jìn)行修飾加工，具體修飾方法如下反應(yīng)體系載體2μg，dGTP(2.5mM)和dATP(2.5mM)各1μl，10×PCR Buffer 5μl，Taq酶2U，加水至體積為50μl。
反應(yīng)條件72℃，反應(yīng)2小時(shí)。
將修飾反應(yīng)后產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)并回收pSilencerTM2.0-U6修飾載體片段。
由于，在BamH I酶切后，載體3’末端形成GATC-3’(下劃線部分為突出端)四個(gè)未配對(duì)的堿基，由于反應(yīng)體系中添加有dGTP和dATP，因此在經(jīng)過(guò)上述修飾后，C和T配對(duì)加上了G和A，故載體的5’端形成的突出堿基部分為AG。
1.2、制備sip53雙鏈DNA片段1.2.1、設(shè)計(jì)對(duì)humanP53基因有效的寡核苷酸片段sip53設(shè)計(jì)sip53片段，其序列如下sip535’-TCGACTCCAGTGGTAATCTACAACTCGAGTTGTAGATTACCACTGGAGTC-3’；其中，sip53中48個(gè)標(biāo)識(shí)有下劃線的DNA序列是回文結(jié)構(gòu)，在退火時(shí)可以相互配對(duì)，形成雙鏈DNA片段；無(wú)下劃線標(biāo)識(shí)的堿基TC為5’端的突出部分。
1.2.2、sip53片段退火，形成sip53雙鏈DNA片段取sip53片段，進(jìn)行退火反應(yīng)，收獲sip53雙鏈DNA片段，具體反應(yīng)條件如下反應(yīng)體系sip53(100μM)2μl，10×退火B(yǎng)uffer5μl，加水至體積為50μl。
其中，10×退火B(yǎng)uffer配方如下500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，500mM NaCl，1mg/ml BSA，pH7.5。
反應(yīng)條件94℃ 5min；37℃ 2小時(shí)。
1.3、雙鏈DNA片段與載體片段連接并轉(zhuǎn)化DH10B菌株取退火后收獲的雙鏈DNA片段與載體片段連接，具體反應(yīng)條件如下反應(yīng)體系pSilencerTM2.0-U6修飾載體片段100ng，sip53退火產(chǎn)物2μl，10×T4連接酶Buffer1μl，T4連接酶200U，加水至體積為10μl。
其中，T4連接酶Buffer和T4連接酶均購(gòu)自Promega公司。
反應(yīng)條件16℃，反應(yīng)20小時(shí)。
反應(yīng)完畢后，取3μl融合反應(yīng)的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH10B菌株(購(gòu)自Invitrogen公司)，得到約100個(gè)轉(zhuǎn)化子。
1.4、DH10B菌株培養(yǎng)任意挑取3個(gè)克隆，接種到TB培養(yǎng)基(Amp+)，37℃，250rpm，培養(yǎng)20小時(shí)。
1.5、質(zhì)粒純化及測(cè)序參考操作手冊(cè)，用Qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒，純化質(zhì)粒。
將純化獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，收獲了sip53序列完全正確的克隆。
實(shí)施例 2、siPFTK1的ShRNA克隆方法在本實(shí)施例中，突出部分在載體3’端。
2.1、載體片段制備采用實(shí)施例1.1的體系和及其條件，BamH I酶切pSilencerTM2.0-U6載體，獲得載體線性片段。
將收獲的pSilencerTM2.0-U6載體片段進(jìn)行修飾加工，具體反應(yīng)條件如下反應(yīng)體系pSilencerTM2.0-U6載體2μg，dNTP(10mM)各1μl，10×PCR Buffer5μl，Taq酶2U，加水至體積為50μl。
反應(yīng)條件72℃，反應(yīng)2小時(shí)。
將修飾反應(yīng)后的產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)并回收pSilencerTM2.0-U6修飾載體片段。
由于，在BamH I酶切后，載體末端形成GATC-3’(下劃線部分為突出端)，進(jìn)行修飾、補(bǔ)平末端后，由于Taq酶自身的特性，會(huì)在載體的3’末端加上了堿基A，所以載體的3’端形成的突出堿基部分為A。
2.2、制備siPFTK1雙鏈DNA片段2.2.1、設(shè)計(jì)對(duì)human PFTK1基因有效的寡核苷酸片段siPFTK1設(shè)計(jì)siPFTK1片段，其序列如下siPFTK 15’-AAGCATGGAATAAGCTCAGCTCTCGAGAGCTGAGCTTATTCCATGCTTT-3’；其中，siPFTK1中的48個(gè)標(biāo)識(shí)有下劃線的DNA序列是回文結(jié)構(gòu)，在退火時(shí)可以互相配對(duì)形成雙鏈DNA片段；無(wú)下劃線標(biāo)識(shí)的堿基T為3’端突出部分。
2.2.2、siPFTK1片段退火，形成siPFTK1雙鏈DNA片段取siPFTK1片段，按實(shí)施例1.2.2的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，進(jìn)行退火反應(yīng)，收獲siPFTK1雙鏈DNA片段。
2.3、雙鏈DNA片段與載體片段連接并轉(zhuǎn)化DH10B菌株采用實(shí)施例1.3的連接條件，將退火后收獲的siPFTK1雙鏈DNA片段2μl與pSilencerTM2.0-U6修飾載體片段100ng，在實(shí)施例1.3連接體系中進(jìn)行連接，獲得融合反應(yīng)產(chǎn)物。
取3μl融合反應(yīng)的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH10B菌株，得到約100個(gè)轉(zhuǎn)化子。
2.4、DH10B菌株培養(yǎng)任意挑取3個(gè)克隆，接種到TB培養(yǎng)基(Amp+)，37℃，250rpm，培養(yǎng)20小時(shí)。
2.5、質(zhì)粒純化及測(cè)序參考操作手冊(cè)，用Qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒，純化質(zhì)粒。
將純化獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，收獲了siPFTK1序列完全正確的克隆。
實(shí)施例3、siTSSK1的ShRNA克隆方法在本實(shí)施例中，突出部分在載體3’端。
3.1、載體片段制備委托上海德聚生物技術(shù)有限公司(中國(guó)上海市宜山路705號(hào)B座5樓)，對(duì)pSilencerTM2.0-U6載體進(jìn)行改造，得到線性載體，改造過(guò)程具體如下1、HindIII和BamH I雙酶切，去除pSilencerTM2.0-U6載體酶切位點(diǎn)HindIII(399)和BamH I(461)之間的DNA序列，載體其余部分不變；2、對(duì)酶切位點(diǎn)HindIII(399)和BamH I(461)之間區(qū)域進(jìn)行修飾，使之變?yōu)槿缦滦问降木€性載體；其中，帶下劃線的DNA序列為修飾后加入的部分，載體的3’端的突出堿基部分為A。
361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTTTCCAAAAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAAAAGGTT411AAAATTT461GGGATCCCGCG TCCTTTCCAC AAGATATATA AACCCAAGAA ATCGAAATACACCCTAGG6CGC AGGAAAGGTG TTCTATATAT TTGGGTTCTT TAGCTTTATG511 TTTCAAGTTA CGGTAAGCAT ATGATAGTCCAAAGTTCAAT GCCATTCGTA TACTATCAGG
3.2、制備siTSSK1雙鏈DNA片段3.2.1、設(shè)計(jì)對(duì)human TSSK1基因有效的寡核苷酸片段siTSSK1設(shè)計(jì)siTSSK1片段，其序列如下siTSSK15’-GTCGAATGGCATTAAGCAATTCTCGAGAATTGCTTAATGCCATTCGACT-3’；其中，siTSSK1中的48個(gè)標(biāo)識(shí)有下劃線的DNA序列是回文結(jié)構(gòu)，在退火時(shí)可以互相配對(duì)形成雙鏈DNA片段；無(wú)下劃線標(biāo)識(shí)的堿基T為3’端突出部分。
3.2.2、siTSSK1片段退火，形成siTSSK1雙鏈DNA片段取siTSSK1片段，按實(shí)施例1.2.2的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，進(jìn)行退火反應(yīng)，收獲siTSSK1雙鏈DNA片段。
3.3、雙鏈DNA片段與載體片段連接并轉(zhuǎn)化DH10B菌株采用實(shí)施例1.3的連接條件，將退火后收獲的siTSSK1雙鏈DNA片段2μl與pSilencerTM2.0-U6修飾載體片段100ng，在實(shí)施例1.3連接體系中進(jìn)行連接，獲得融合反應(yīng)產(chǎn)物。
取3μl融合反應(yīng)的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH10B菌株(購(gòu)自Invitrogen公司)，得到約100個(gè)化子。
3.4、DH10B菌株培養(yǎng)任意挑取3個(gè)克隆，接種到TB培養(yǎng)基(Amp+)，37℃，250rpm，培養(yǎng)20小時(shí)。
3.5、質(zhì)粒純化及測(cè)序參考操作手冊(cè)，用Qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒，純化質(zhì)粒。
將純化獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，收獲了siTSSK1序列完全正確的克隆。
實(shí)施例4、siP21的ShRNA克隆方法在本實(shí)施例中，突出部分在載體3’端。
4.1、載體片段制備委托上海德聚生物技術(shù)有限公司(中國(guó)上海市宜山路705號(hào)B座5樓)，對(duì)pSilencerTM2.0-U6載體進(jìn)行改造，得到線性載體，修飾改造后，獲得的載體的3’端突出部分堿基為AAAAA。具體改造過(guò)程，步驟同實(shí)施例3.1。
對(duì)酶切位點(diǎn)Hind III(399)和BamH I(461)之間區(qū)域進(jìn)行修飾后，變?yōu)槿缦滦问降木€性載體361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTTTCCAAAAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAAAAGGT411AAAA461 CCCGCG TCCTTTCCAC AAGATATATA AACCCAAGAA ATCGAAATACAAAAAGGGCGC AGGAAAGGTG TTCTATATAT TTGGGTTCTT TAGCTTTATG511 TTTCAAGTTA CGGTAAGCAT ATGATAGTCCAAAGTTCAAT GCCATTCGTA TACTATCAGG4.2、制備siP21雙鏈DNA片段4.2.1、設(shè)計(jì)對(duì)human P21基因有效的寡核苷酸片段siP21設(shè)計(jì)siP21片段，其序列如下siP215’-AACTTCGACTTTGTCACCGAGCTCGAGCTCGGTGACAAAGTCGAAGTTTTTTT-3’其中，siP21中的48個(gè)標(biāo)識(shí)有下劃線的DNA序列是回文結(jié)構(gòu)，在退火時(shí)可以互相配對(duì)形成雙鏈DNA片段；無(wú)下劃線標(biāo)識(shí)的堿基TTTTT為3’端突出部分。
4.2.2、siP21片段退火，形成siP21雙鏈DNA片段取siP21片段，按實(shí)施例1.2.2的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，進(jìn)行退火反應(yīng)，收獲siP21雙鏈DNA片段。
4.3、雙鏈DNA片段與載體片段連接并轉(zhuǎn)化DH10B菌株采用實(shí)施例1.3的連接條件，將退火后收獲的siP21雙鏈DNA片段2μl與pSilencerTM2.0-U6修飾載體片段100ng，在實(shí)施例1.3連接體系中進(jìn)行連接，獲得融合反應(yīng)產(chǎn)物。
取3μl融合反應(yīng)的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH10B菌株，得到約100個(gè)轉(zhuǎn)化子。
4.4、DH10B菌株培養(yǎng)任意挑取3個(gè)克隆，接種到TB培養(yǎng)基(Amp+)，37℃，250rpm，培養(yǎng)20小時(shí)。
4.5、質(zhì)粒純化及測(cè)序參考操作手冊(cè)，用Qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒，純化質(zhì)粒。
將純化獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，收獲了siP21序列完全正確的克隆。
權(quán)利要求
1.一種ShRNA的克隆方法，包括制備合適的載體，將載體和雙鏈DNA片段連接得到環(huán)形的DNA分子，其特征在于只合成一種寡核苷酸片段，該寡核苷酸片段由回文結(jié)構(gòu)部分和突出部分兩部分組成，兩條所述寡核苷酸片斷在退火后能夠通過(guò)回文結(jié)構(gòu)互補(bǔ)配對(duì)而形成雙鏈DNA片段；所述載體的兩端具有堿基序列相同的突出端，且同為5’端或3’端的突出端；所述寡核苷酸片段突出部分的堿基序列與所述載體的突出端堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體的突出端長(zhǎng)度為1-5個(gè)堿基。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述堿基包括A、T/U、C、G。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸片斷的突出部分的長(zhǎng)度為1-5個(gè)堿基。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述堿基包括A、T/U、C、G。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括將連接得到的DNA分子轉(zhuǎn)化細(xì)菌，通過(guò)篩選得到正確的基因克隆的步驟。
7.一種用于ShRNA克隆的載體，其特征在于，所述載體的兩端具有堿基序列相同的突出端，且同為5’端或3’端的突出端。
8.如權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于，所述突出端的長(zhǎng)度為1-5個(gè)堿基。
9.如權(quán)利要求8所述的載體，其特征在于，所述堿基包括A、T/U、C、G。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種ShRNA的克隆方法和一種用于ShRNA克隆的載體。所述的克隆方法包括制備合適的載體，將載體和雙鏈DNA片段連接得到環(huán)形的DNA分子，將連接得到的DNA分子轉(zhuǎn)化細(xì)菌，通過(guò)篩選得到正確的基因克隆等步驟；所述的載體兩端具有堿基序列相同的且同為5’端或3’端的突出端，同時(shí)，所述的寡核苷酸兩端也具有堿基序列相同的且同為5’端或3’端的突出端，且所述載體的突出端堿基序列與所述寡核苷酸片段突出部分的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。利用本發(fā)明提供的載體以及ShRNA克隆方法，只需合成一種寡核苷酸片段，便可以方便、迅速地實(shí)現(xiàn)ShRNA克隆，不僅簡(jiǎn)化了操作，而且成功率高。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101024830SQ20071000686
公開(kāi)日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2007年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月1日
發(fā)明者邱文英 申請(qǐng)人:王鴻艷