專利名稱：：利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于香蕉遺傳轉(zhuǎn)化
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
：目前，病蟲害日益猖獗，香蕉生產(chǎn)面臨著嚴(yán)峻的考驗(yàn)，急需培育品質(zhì)優(yōu)良的抗病新品種。由于栽培蕉高度不育、無種子，因此通過傳統(tǒng)雜交育種的方法難于獲得新品種，而利用基因工程技術(shù)獲得抗病的轉(zhuǎn)基因香蕉是有效的育種途徑之一。建立適合于所有基因型的穩(wěn)定高效的香蕉基因轉(zhuǎn)化體系是進(jìn)行香蕉基因工程育種的前提。目前研究表明香蕉ECS是最理想的轉(zhuǎn)化受體，但現(xiàn)有技術(shù)存在的不足導(dǎo)致某些香蕉品種無法進(jìn)行遺傳改良，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化香蕉胚性懸浮細(xì)胞(embryogeniccellsuspensions,ECS)的現(xiàn)有技術(shù)為香蕉ECS在根癌農(nóng)桿菌菌液中浸泡后，轉(zhuǎn)移到添加了乙酰丁香酮的半固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3或6天，將根癌農(nóng)桿菌侵染后的香蕉ECS接種到添加了相應(yīng)抗生素的半固體增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選，培養(yǎng)約23個(gè)月后，把篩選得到的抗性克隆轉(zhuǎn)移到添加了相應(yīng)抗生素的體胚誘導(dǎo)和發(fā)育培養(yǎng)基上，獲得成熟的抗性體胚后轉(zhuǎn)移到體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，最后將萌發(fā)的體胚轉(zhuǎn)接到添加了相應(yīng)抗生素的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根篩選培養(yǎng)，獲得完整的轉(zhuǎn)基因植株。主要存在兩方面的不足(1)某些香蕉品種的ECS與根癌農(nóng)桿菌在半固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，極易褐化從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失?。?2)共培養(yǎng)后，將根癌農(nóng)桿菌侵染的香蕉ECS先接種到半固體增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選，延長(zhǎng)了獲得轉(zhuǎn)化植株的周期。
發(fā)明內(nèi)容為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法。該方法可解決共培養(yǎng)過程中香蕉ECS的褐化問題，保證轉(zhuǎn)化的成功，而且可縮短獲得轉(zhuǎn)化植株的周期。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟(1)將導(dǎo)入了質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌于YEB固體培養(yǎng)基上劃線，26±rC，黑暗條件下培養(yǎng)，然后挑取單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基中，26±1°C，振蕩培養(yǎng)得到菌液；菌液離心去上清后，用10倍體積的香蕉ECS液體培養(yǎng)基即繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基(MLM)重懸菌體，得到工程菌液。(2)取在香蕉ECS液體培養(yǎng)基即繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基(MLM)中繼代培養(yǎng)35天的香蕉ECS，離心去上清后，每0.5mlPCV(密實(shí)體積)ECS加入10ml經(jīng)步驟(1)獲得的工程菌液，26±1°C，黑暗靜置26小時(shí)。(3)然后加入香蕉ECS液體培養(yǎng)基即繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基(MLM)共培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)條件為26±1°C，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，所述振蕩培養(yǎng)條件如下將培養(yǎng)物于90120rpm轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)168240小時(shí)；或者將培養(yǎng)物先在3050rpm轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)1014小時(shí)，然后再提高轉(zhuǎn)速至90120rpm，繼續(xù)培養(yǎng)60156小時(shí)。采用液體培養(yǎng)基和共培養(yǎng)條件組成共培養(yǎng)體系，稱之為液體共培養(yǎng)系統(tǒng)。(4)共培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)物靜置去上清，用香蕉ECS液體培養(yǎng)基即繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基(MLM)將沉淀稀釋10倍，然后將懸浮物均勻鋪于體胚誘導(dǎo)和發(fā)育選擇培養(yǎng)基(EIM)上，26±1°C，黑暗培養(yǎng)3個(gè)月，每個(gè)月更換一次體胚誘導(dǎo)和發(fā)育選擇培養(yǎng)基(EIM)。(5)將成熟的抗性體胚轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，光暗交替條件下培養(yǎng)至體胚萌發(fā)得到小苗，然后將小苗轉(zhuǎn)移至生根篩選培養(yǎng)基上，光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)可獲得完整的轉(zhuǎn)化植株。所述液體培養(yǎng)基組成為以MS為基本培養(yǎng)基，添加lmgl"生物素、100mgl"谷氨酰胺、100mgr1麥芽提取物、lmgl"2,4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和45gl—1蔗糖，高壓滅菌前pH為5.3。所述體胚誘導(dǎo)和發(fā)育選擇培養(yǎng)基組成為SH大量元素，SH微量元素，MS維生素，添加lmgri生物素，100mgr'谷氨酰胺，100mgri麥芽提取物，230mgl"脯氨酸，0.2mgl"NAA(萘乙酸)，0.1mgl"激動(dòng)素，45gl"蔗糖，10g1"乳糖，3g1"gelrite，500mgr1先鋒霉素和50100mg1"的相應(yīng)的篩選抗生素，高壓滅菌前pH為5.3;所述抗生素根據(jù)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒上所用的篩選標(biāo)記基因而定，如卡那霉素、geneticin或潮霉素等。為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述香蕉包括貢蕉、龍芽蕉或巴西香蕉等。所述質(zhì)粒為pCAMBIA2301。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)改變共培養(yǎng)條件，解決共培養(yǎng)過程中香蕉ECS的褐化問題，保證了轉(zhuǎn)化的成功。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化要取得成功，必須保證農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)均良好。當(dāng)植物細(xì)胞生長(zhǎng)較慢就容易造成農(nóng)桿菌過度生長(zhǎng)，從而毒害植物細(xì)胞使其褐化死亡，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失敗。本發(fā)明用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)代替現(xiàn)有技術(shù)中的半固體共培養(yǎng)系統(tǒng)，由于液體培養(yǎng)基比半固體培養(yǎng)基更適合香蕉ECS的生長(zhǎng)，因此香蕉ECS生長(zhǎng)旺盛，不易受農(nóng)桿菌的毒害而褐化，最后成功獲得轉(zhuǎn)化植株。主要原因?yàn)棰倥c半固體培養(yǎng)基相比，植物細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中與營(yíng)養(yǎng)成分的接觸更加充分，且氣體交換更加活躍，不易造成植物細(xì)胞缺氧死亡；②培養(yǎng)物分泌的有害物質(zhì)可以被液體培養(yǎng)基稀釋，從而減輕對(duì)植物細(xì)胞的毒害。在進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化貢蕉ECS的研究表明，采用半固體培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)，貢蕉ECS很快褐化，最后篩選不到轉(zhuǎn)化植株；而采用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)，共培養(yǎng)過程中貢蕉ECS不褐化，最后篩選到280490棵轉(zhuǎn)化植株/0.5mlPCVECSo(2)縮短了獲得香蕉轉(zhuǎn)化植株的周期由于共培養(yǎng)后的香蕉ECS不需要先轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行23個(gè)月的細(xì)胞篩選培養(yǎng)，而是直接轉(zhuǎn)移到體胚誘導(dǎo)和發(fā)育培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，因此獲得轉(zhuǎn)化植株的周期縮短了23個(gè)月。圖1為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化貢蕉ECS研究結(jié)果圖。圖2為貢蕉轉(zhuǎn)基因抗性植株中g(shù)附A的PCR檢測(cè)圖。圖3為貢蕉轉(zhuǎn)基因抗性植株中的PCR檢測(cè)圖。圖4為貢蕉轉(zhuǎn)基因抗性植株中的Southern印跡檢測(cè)(Sco7I酶切)圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。本發(fā)明所需培養(yǎng)基(1)YEB培養(yǎng)基含0.5%(w/v)胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5%蔗糖和2mM硫酸鎂，pH為7.2。固體YEB培養(yǎng)基中添加15g1"瓊脂粉。(2)香蕉ECS液體培養(yǎng)基即繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基(MLM):以MS為基本培養(yǎng)基，添加lmgl"生物素，100mgr1谷氨酰胺，100mgr1麥芽提取物，lmgl"2,4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和45g1"蔗糖，pH為5.3。(3)體胚誘導(dǎo)和發(fā)育選擇培養(yǎng)基(EIM):SH大量元素，SH微量元素，MS維生素，添加1mg1"生物素，100mgl'1谷氨酰胺，100mg1"麥芽提取物，230mgl"脯氨酸，0.2mgl"NAA(萘乙酸)，0.1mgl"激動(dòng)素，45g1"蔗糖，10g1"乳糖，3g1"gelrite，500mg1"先鋒霉素和50mg1"geneticin，pH為5.3。(4)體胚萌發(fā)培養(yǎng)基MS大量元素，MS微量元素，MW維生素，0.5mgl"BAP(6-節(jié)基氨基嘌呤)，2mg1"IAA(吲哚乙酸)，30g1"蔗糖，2g1"gelrite和200mg1"先鋒霉素，pH為5.8。(5)生根篩選培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加igr1活性炭，30gr1蔗糖，7gl"瓊脂粉，200mgl'1先鋒霉素和50mgr1geneticin，pH為5.8。實(shí)施例1一種利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟(1)采用凍融法將質(zhì)粒pCAMBIA2301(CAMBIA實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞)轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105(CAMBIA實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞)中。pCAMBIA2301含有g(shù)^A報(bào)告基因和"/^II篩選標(biāo)記基因。(黃霞.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉(7l^Mspp.)基因轉(zhuǎn)化的研究.中山大學(xué)博士學(xué)位論文，2002)(2)取導(dǎo)入了pCAMBIA2301的EHA105菌種于添加30mgl"利福平和100mgl"卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，26±1°C，黑暗條件下培養(yǎng)48小時(shí)。然后，挑取單菌落接種于含30mgl"利福平和100mgl"卡那霉素的10mlYEB液體培養(yǎng)基中，26土rC，250rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，用新鮮的YEB培養(yǎng)基稀釋5倍后，繼續(xù)26士rC，250rpm振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，得到菌液。(3)菌液于5000rpm離心10分鐘，去上清后用10倍體積的香蕉ECS繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基(MLM)重懸菌體，得到工程菌液。(4)取MLM中繼代培養(yǎng)4天的貢蕉ECS，4000rpm離心10分鐘，去上清后，每0.5mlPCV(密實(shí)體積)ECS加入10ml經(jīng)步驟(3)獲得的工程菌液，置于100ml錐形瓶中，26±rC，黑暗靜置2小時(shí)。香蕉ECS的獲得參照魏岳榮等的方法(魏岳榮.貢蕉胚性細(xì)胞懸浮系的建立和植株再生.生物工程學(xué)報(bào)，2005,21(1):58-65)。(5)加入10ml新鮮的MLM共培養(yǎng)，共培養(yǎng)條件為26±1°C，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為100rpm振蕩培養(yǎng)168小時(shí)。(6)共培養(yǎng)完成后，培養(yǎng)物靜置5分鐘，去上清，用新鮮的MLM將沉淀稀釋10倍，然后取lml懸浮物均勻鋪于下述準(zhǔn)備好的EIM上。26±1°C，黑暗培養(yǎng)3個(gè)月，每個(gè)月更換一次新鮮的EIM。EIM按下述方法準(zhǔn)備將體胚誘導(dǎo)和發(fā)育選擇培養(yǎng)基(EIM)倒入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，凝固后表面覆蓋一張普通定性濾紙。(7)將成熟的抗性體胚轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，于26士rC，16小時(shí)/8小時(shí)的光暗交替條件下培養(yǎng)1個(gè)月左右。(8)將體胚萌發(fā)得到的小苗轉(zhuǎn)移至生根篩選培養(yǎng)基上，于26土rC，16小時(shí)/8小時(shí)的光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)，約1個(gè)月后可獲得完整的轉(zhuǎn)化植株。實(shí)施例2一種利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟(1)采用凍融法將質(zhì)粒pCAMBIA2301(CAMBIA實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞)轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105(CAMBIA實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞)中。(2)取導(dǎo)入了pCAMBIA2301的EHA105菌種于添加30mgl'1利福平和100mgl"卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，26±rC，黑暗條件下培養(yǎng)48小時(shí)。然后，挑取單菌落接種于含30mgl"利福平和100mgl"卡那霉素的10mlYEB液體培養(yǎng)基中，26±1°C，250rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，用新鮮的YEB培養(yǎng)基稀釋5倍后，繼續(xù)26土rC，250卬m振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，得到菌液。(3)菌液于5000rpm離心10分鐘，去上清后用10倍體積的香蕉ECS繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基(MLM)重懸菌體，得到工程菌液。(4)取MLM中繼代培養(yǎng)4天的貢蕉ECS，4000rpm離心10分鐘，去上清后，每0.5mlPCV(密實(shí)體積)ECS加入10ml經(jīng)步驟(3)獲得的工程菌液，置于100ml錐形瓶中，26±rC，黑暗靜置2小時(shí)。(5)加入10ml新鮮的MLM共培養(yǎng)，共培養(yǎng)條件為26±1°C，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為先40rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，然后轉(zhuǎn)速提高至100rpm繼續(xù)培養(yǎng)60小時(shí)。(6)共培養(yǎng)完成后，培養(yǎng)物靜置5分鐘，去上清，用新鮮的MLM將沉淀稀釋10倍，然后取lml懸浮物均勻鋪于下述準(zhǔn)備好的EIM上。26±1°C，黑暗培養(yǎng)3個(gè)月，每個(gè)月更換一次新鮮的EIM。EIM按下述方法準(zhǔn)備將體胚誘導(dǎo)和發(fā)育選擇培養(yǎng)基(EIM)倒入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，凝固后表面覆蓋一張普通定性濾紙。(7)將成熟的抗性體胚轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，于26土rC，16小時(shí)/8小時(shí)的光暗交替條件下培養(yǎng)1個(gè)月左右。(8)將體胚萌發(fā)得到的小苗轉(zhuǎn)移至生根篩選培養(yǎng)基上，于26土rC，16小時(shí)/8小時(shí)的光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)，約1個(gè)月后可獲得完整的轉(zhuǎn)化植株。實(shí)施例3一種利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟(1)采用凍融法將質(zhì)粒pCAMBIA2301(CAMBIA實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞)轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105(CAMBIA實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞)中。(2)取導(dǎo)入了pCAMBIA2301的EHA105菌種于添加30mg1"利福平和100mgl"卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，26±rC，黑暗條件下培養(yǎng)48小時(shí)。然后，挑取單菌落接種于含30mgl"利福平和100mgl"卡那霉素的10mlYEB液體培養(yǎng)基中，26±rC，250rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，用新鮮的YEB培養(yǎng)基稀釋5倍后，繼續(xù)26土rC，250rpm振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，得到菌液。(3)菌液于5000rpm離心10分鐘，去上清后用10倍體積的香蕉ECS繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基(MLM)重懸菌體，得到工程菌液。(4)取MLM中繼代培養(yǎng)4天的貢蕉ECS，4000rpm離心10分鐘，去上清后，每0.5mlPCV(密實(shí)體積)ECS加入10ml經(jīng)步驟(3)獲得的工程菌液，置于100ml錐形瓶中，26土rC，黑暗靜置2小時(shí)。(5)加入10ml新鮮的MLM共培養(yǎng)，共培養(yǎng)條件為26±1°C，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為先40rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，然后轉(zhuǎn)速提高至100rpm繼續(xù)培養(yǎng)156小時(shí)。(6)共培養(yǎng)完成后，培養(yǎng)物靜置5分鐘，去上清，用新鮮的MLM將沉淀稀釋10倍，然后取lml懸浮物均勻鋪于下述準(zhǔn)備好的EIM上。26±1°C，黑暗培養(yǎng)3個(gè)月，每個(gè)月更換一次新鮮的EIM。EIM按下述方法準(zhǔn)備將體胚誘導(dǎo)和發(fā)育選擇培養(yǎng)基(EIM)倒入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，凝固后表面覆蓋一張普通定性濾紙。(7)將成熟的抗性體胚轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，于26±1匸，16小時(shí)/8小時(shí)的光暗交替條件下培養(yǎng)1個(gè)月左右。(8)將體胚萌發(fā)得到的小苗轉(zhuǎn)移至生根篩選培養(yǎng)基上，于26士rC，16小時(shí)/8小時(shí)的光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)，約1個(gè)月后可獲得完整的轉(zhuǎn)化植株。以gwA為報(bào)告基因，"prtl作為篩選標(biāo)記基因，貢蕉ECS根據(jù)上述轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行試驗(yàn)，獲得以下結(jié)果表l共培養(yǎng)時(shí)間和轉(zhuǎn)速對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)貢蕉ECS基因轉(zhuǎn)化的影響(試驗(yàn)重復(fù)3次)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*NSE(抗性體胚個(gè)數(shù)/0.5mlPCVECS);**NP(轉(zhuǎn)化植株數(shù)/0.5mlPCVECS)。使用Duncan，snewmultiplerangetest方法進(jìn)行顯著性分析。如圖1所示為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化貢蕉ECS研究結(jié)果，其中，A、共培養(yǎng)后，貢蕉ECS中GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)。其中a、100rpm共培養(yǎng)72小時(shí)；b、100rpm共培養(yǎng)168小時(shí)；c、40rpm培養(yǎng)12小時(shí)，然后100rpm繼續(xù)培養(yǎng)156小時(shí)(bar=6mm);B、100rpm共培養(yǎng)168小時(shí)后，貢蕉ECS于體胚誘導(dǎo)和發(fā)育培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出抗性體胚(bai=9.8mm);C、40rpm培養(yǎng)12小時(shí)，然后lOOrpm繼續(xù)培養(yǎng)156小時(shí)后，貢蕉ECS于體胚誘導(dǎo)和發(fā)育培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出抗性體胚(bar=8mm);D、非轉(zhuǎn)化體胚中的GUS表達(dá)(bar^0.4mm);E、化體胚中的GUS表達(dá)(bar=0.4mm);F、轉(zhuǎn)化不定芽中的GUS表達(dá)(bar=1.8mm);G、非轉(zhuǎn)化(左)及轉(zhuǎn)化(右)植株的葉片中的GUS表達(dá)(bar=5.4mm);H、非轉(zhuǎn)化(左)及轉(zhuǎn)化(右)植株的根中的GUS表達(dá)(bar=3.7mm);I、非轉(zhuǎn)化植株移栽網(wǎng)室8個(gè)月后，葉片中的GUS表達(dá)(bar=4.8mm);J、轉(zhuǎn)化植株移栽網(wǎng)室8個(gè)月后，母株(下)及吸芽(上)的葉片中的GUS表達(dá)(bar=4.8mm)。如圖2所示為貢蕉轉(zhuǎn)基因抗性植株中g(shù)船A的PCR檢測(cè)圖，其中，M:DNAmarker;P:質(zhì)粒pCAMBIA2301(陽(yáng)性對(duì)照)；1:蒸餾水(負(fù)對(duì)照)；2:非轉(zhuǎn)化植株的DNA(陰性對(duì)照)；314:各貢蕉轉(zhuǎn)基因抗性植株的DNA。PCR擴(kuò)增后獲得與質(zhì)粒pCAMBIA2301相同的約1200bp的帶，初步證實(shí)g^A已導(dǎo)入貢蕉轉(zhuǎn)基因抗性植株。如圖3所示為貢蕉轉(zhuǎn)基因抗性植株中"/^n的PCR檢測(cè)圖。其中，M:DNAmarker;P:質(zhì)粒pCAMBIA2301(陽(yáng)性對(duì)照)；1:蒸餾水(負(fù)對(duì)照)；2:非轉(zhuǎn)化植株的DNA(陰性對(duì)照)；314:各貢蕉轉(zhuǎn)基因抗性植株的DNA。PCR擴(kuò)增后獲得與質(zhì)粒pCAMBIA2301相同的約750bp的帶，初步證實(shí);^11己導(dǎo)入貢蕉轉(zhuǎn)基因抗性植株。如圖4所示為貢蕉轉(zhuǎn)基因抗性植株中"pffl的Southern印跡檢測(cè)(五co/I酶切)圖。其中，P:質(zhì)粒pCAMBIA2301/5coRI(陽(yáng)性對(duì)照)；C:非轉(zhuǎn)化植株的DNA/(陰性對(duì)照)；17:GUS檢測(cè)為陽(yáng)性的貢蕉轉(zhuǎn)基因植株的DNA/五coRI。Southern雜交后檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，證實(shí)wprtl已導(dǎo)入貢蕉轉(zhuǎn)基因抗性植株。實(shí)施例4一種利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟(1)采用凍融法將質(zhì)粒pCAMBIA2301(CAMBIA實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞)轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105(CAMBIA實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞)中。(2)取導(dǎo)入了pCAMBIA2301的EHA105菌種于添加30mgl'1利福平和lOOmgr'卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，26±1°C,黑暗條件下培養(yǎng)48小時(shí)。然后挑取單菌落接種于含30mg1"利福平和100mg1"卡那霉素的10mlYEB液體培養(yǎng)基中，26±1°C，250rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，用新鮮的YEB培養(yǎng)基稀釋5倍后，繼續(xù)26土rC，250rpm振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，得到菌液。(3)菌液于5000rpm離心10分鐘，去上清后用10倍體積的香蕉ECS繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基(MLM)重懸菌體，得到工程菌液。(4)取MLM中繼代培養(yǎng)5天的龍芽蕉ECS，4000rpm離心10分鐘，去上清后，每0.5mlPCV(密實(shí)體積)ECS加入10ml經(jīng)步驟(3)獲得的工程菌液，置于100ml錐形瓶中，26土rC，黑暗靜置4小時(shí)。(5)加入10ml新鮮的MLM共培養(yǎng)，共培養(yǎng)條件為26±1°C，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為先30rpm振蕩培養(yǎng)14小時(shí)，然后轉(zhuǎn)速提高至90rpm繼續(xù)培養(yǎng)100小時(shí)。(6)共培養(yǎng)完成后，培養(yǎng)物靜置5分鐘，去上清，用新鮮的MLM將沉淀稀釋10倍，然后取lml懸浮物均勻鋪于下述準(zhǔn)備好的EIM上。26±1°C，黑暗培養(yǎng)3個(gè)月，每個(gè)月更換一次新鮮的EIM。EIM按下述方法準(zhǔn)備將體胚誘導(dǎo)和發(fā)育選擇培養(yǎng)基(EIM)倒入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，凝固后表面覆蓋一張普通定性濾紙。(7)將成熟的抗性體胚轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，于26士rC，16小時(shí)/8小時(shí)的光暗交替條件下培養(yǎng)1個(gè)月左右。(8)將體胚萌發(fā)得到的小苗轉(zhuǎn)移至生根篩選培養(yǎng)基上，于26土rC,16小時(shí)/8小時(shí)的光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)，約1個(gè)月后可獲得完整的轉(zhuǎn)化植株。實(shí)施例5一種利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟(1)采用凍融法將質(zhì)粒pCAMBIA2301(CAMBIA實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞)轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105(CAMBIA實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞)中。(2)取導(dǎo)入了pCAMBIA2301的EHA105菌種于添加30mgl"利福平和100mgl"卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，26土rC，黑暗條件下培養(yǎng)48小時(shí)。然后挑取單菌落接種于含30mg1"利福平和100mgI—1卡那霉素的10mlYEB液體培養(yǎng)基中，26±rC，250rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，用新鮮的YEB培養(yǎng)基稀釋5倍后，繼續(xù)26土rC，250rpm振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，得到菌液。(3)菌液于5000rpm離心10分鐘，去上清后用10倍體積的香蕉ECS繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基(MLM)重懸菌體，得到工程菌液。(4)取MLM中繼代培養(yǎng)3天的巴西香蕉ECS，4000rpm離心10分鐘，去上清后，每0.5mlPCV(密實(shí)體積)ECS加入10ml經(jīng)步驟(3)獲得的工程菌液，置于100ml錐形瓶中，26土rC，黑暗靜置6小時(shí)。(5)加入10ml新鮮的MLM共培養(yǎng)，共培養(yǎng)條件為26±1°C，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為先50rpm振蕩培養(yǎng)10小時(shí)，然后轉(zhuǎn)速提高至120rpm繼續(xù)培養(yǎng)60小時(shí)。(6)共培養(yǎng)完成后，培養(yǎng)物靜置5分鐘，去上清，用新鮮的MLM將沉淀稀釋10倍，然后取lml懸浮物均勻鋪于下述準(zhǔn)備好的EIM上。26±1°C，黑暗培養(yǎng)3個(gè)月，每個(gè)月更換一次新鮮的EIM。EIM按下述方法準(zhǔn)備將體胚誘導(dǎo)和發(fā)育選擇培養(yǎng)基(EIM)倒入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，凝固后表面覆蓋一張普通定性濾紙。(7)將成熟的抗性體胚轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，于26土rC，16小時(shí)/8小時(shí)的光暗交替條件下培養(yǎng)1個(gè)月左右。(8)將體胚萌發(fā)得到的小苗轉(zhuǎn)移至生根篩選培養(yǎng)基上，于26土rC，16小時(shí)/8小時(shí)的光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)，約1個(gè)月后可獲得完整的轉(zhuǎn)化植株。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括如下步驟(1)將導(dǎo)入了質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌于YEB固體培養(yǎng)基上劃線，26±1℃，黑暗條件下培養(yǎng)，然后挑取單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基中，26±1℃，振蕩培養(yǎng)得到菌液；菌液離心去上清后，用10倍體積的香蕉ECS液體培養(yǎng)基即繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基重懸菌體，得到工程菌液；(2)取在香蕉ECS液體培養(yǎng)基即繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3～5天的香蕉ECS，離心去上清后，每0.5mlPCVECS加入10ml經(jīng)步驟(1)獲得的工程菌液，26±1℃，黑暗靜置2～6小時(shí)；(3)然后加入香蕉ECS液體培養(yǎng)基即繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基共培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)條件為26±1℃，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，所述振蕩培養(yǎng)條件如下將培養(yǎng)物于90～120rpm轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)168～240小時(shí)；或者將培養(yǎng)物先在30～50rpm轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)10～14小時(shí)，然后再提高轉(zhuǎn)速至90～120rpm，繼續(xù)培養(yǎng)60～156小時(shí)；(4)共培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)物靜置去上清，用香蕉ECS液體培養(yǎng)基即繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基將沉淀稀釋10倍，然后將懸浮物均勻鋪于體胚誘導(dǎo)和發(fā)育選擇培養(yǎng)基上，26±1℃，黑暗培養(yǎng)3個(gè)月，每個(gè)月更換一次體胚誘導(dǎo)和發(fā)育選擇培養(yǎng)基；(5)將成熟的抗性體胚轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，光暗交替條件下培養(yǎng)至體胚萌發(fā)得到小苗，然后將小苗轉(zhuǎn)移至生根篩選培養(yǎng)基上，光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)即獲得完整的轉(zhuǎn)化植株；所述液體培養(yǎng)基組成為以MS為基本培養(yǎng)基，添加1mgl-1生物素、100mgl-1谷氨酰胺、100mgl-1麥芽提取物、1mgl-12，4-二氯苯氧乙酸和45gl-1蔗糖，高壓滅菌前pH為5.3；所述體胚誘導(dǎo)和發(fā)育培養(yǎng)基組成為SH大量元素，SH微量元素，MS維生素，添加1mgl-1生物素，100mgl-1谷氨酰胺，100mgl-1麥芽提取物，230mgl-1脯氨酸，0.2mgl-1萘乙酸，0.1mgl-1激動(dòng)素，45gl-1蔗糖，10gl-1乳糖，3gl-1gelrite，500mgl-1先鋒霉素和50～100mgl-1的相應(yīng)的篩選抗生素，高壓滅菌前pH為5.3；所述篩選抗生素根據(jù)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒上所用的篩選標(biāo)記基因而定。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述香蕉包括貢蕉、龍芽蕉或巴西香蕉。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述質(zhì)粒為pCAMBIA2301。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用液體共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香蕉基因轉(zhuǎn)化方法，該方法是將香蕉ECS在根癌農(nóng)桿菌菌液中黑暗靜置一段時(shí)間后，于香蕉ECS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)結(jié)束后，把香蕉ECS直接轉(zhuǎn)移到體胚誘導(dǎo)和發(fā)育選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，將成熟的抗性體胚轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，光暗交替條件下培養(yǎng)至體胚萌發(fā)得到的小苗，最后將小苗轉(zhuǎn)移至生根篩選培養(yǎng)基上，光暗交替條件下進(jìn)行培養(yǎng)即獲得完整的轉(zhuǎn)化植株。本發(fā)明改變共培養(yǎng)條件，解決共培養(yǎng)過程中香蕉ECS的褐化問題；同時(shí)縮短了獲得香蕉轉(zhuǎn)化植株的周期，由于共培養(yǎng)后的香蕉ECS直接轉(zhuǎn)移到體胚誘導(dǎo)和發(fā)育培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化植株的周期縮短了2～3個(gè)月。文檔編號(hào)C12N15/82GK101096673SQ20071002842公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年6月1日優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日發(fā)明者戴雪梅,望肖,趙杰堂,魏岳榮,霞黃,黃學(xué)林申請(qǐng)人:中山大學(xué)