基于農(nóng)桿菌注射法的番茄果實(shí)基因轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種番茄果實(shí)基因轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]番前(FragariaXananassa)是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的作物，在全世界廣泛種植，在我國(guó)也是一種常見(jiàn)的蔬菜，是人們生活不可缺少的。近年來(lái)隨著番茄基因工程的發(fā)展，對(duì)番茄的一些基因功能研究逐漸成為熱點(diǎn)，而基因的功能驗(yàn)證的一個(gè)重要途徑就是通過(guò)轉(zhuǎn)基因操作來(lái)進(jìn)行。番茄轉(zhuǎn)基因研究在園藝作物中開(kāi)展較早，早在60年代就已經(jīng)成功獲得了番茄轉(zhuǎn)基因的植株。而采用常規(guī)葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因來(lái)研究基因的功能就需得到轉(zhuǎn)基因植株，并在其開(kāi)花結(jié)果后才能觀察分析，而番茄轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)周期長(zhǎng)，一般從開(kāi)始轉(zhuǎn)基因到獲得轉(zhuǎn)基因植株，到植株開(kāi)花結(jié)果需要I年的時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)于研究一些功能尚未明確的基因來(lái)說(shuō)時(shí)間周期過(guò)長(zhǎng)，所需人力也很大。此外穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化也不適于研究一個(gè)家族大批量的基因功能，一般研究的基因數(shù)量比較小，因此需要尋求一種新的，快速的方法來(lái)研究與果實(shí)的形成發(fā)育以及成熟生理代謝等相關(guān)的重要基因的功能。
[0003]目前比較快速的方法多采用果實(shí)涂抹法來(lái)研究果實(shí)生理代謝，但是果實(shí)涂抹不能從根本上改變或者影響果實(shí)基因表達(dá)，近年來(lái)在許多作物上采用的果實(shí)注射法是一種新方法，該方法相對(duì)穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)化操作簡(jiǎn)便，周期短。一般注射后一周左右便可以可直接觀察轉(zhuǎn)化后果實(shí)的形態(tài)以及生理等方面的變化，也可以對(duì)果實(shí)進(jìn)行分子生物學(xué)相關(guān)的檢測(cè)研究來(lái)確定基因功能，從而研究導(dǎo)入基因的功能與作用。最初的果實(shí)注射法以注射某些藥物來(lái)觀察果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育狀況，但是這些注射法多采用的是離體果實(shí)注射，這樣就不能完全反應(yīng)果實(shí)的生長(zhǎng)以及發(fā)育過(guò)程的變化狀況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于農(nóng)桿菌注射法的番茄果實(shí)基因轉(zhuǎn)化方法，注射時(shí)期按照番茄發(fā)育的不同時(shí)期進(jìn)行細(xì)分，將農(nóng)桿菌注射方法應(yīng)用于番茄果實(shí)基因表達(dá)的研究方面，建立高效、快速、穩(wěn)定的番茄果實(shí)注射方法體系O
[0005]技術(shù)方案:本發(fā)明所述的一種基于農(nóng)桿菌注射法的番茄果實(shí)基因轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟:
[0006](I)農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)
[0007]將農(nóng)桿菌菌液在YEB固體培養(yǎng)基上劃線后挑取單菌落在YEB液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)，YEB液體培養(yǎng)基中添加卡那霉素25?50mg/L和利福平50?100mg/L，用以避免雜菌污染，在280C的條件下，180?200rmp振蕩培養(yǎng)約12?16小時(shí)至0D600為0.4?0.8，將50mL菌液在離心機(jī)中5000rmp離心后倒去上清液，收集菌體沉淀，將收集的沉淀用MS液體培養(yǎng)基懸浮液重懸，重懸后測(cè)定0D600在0.4，將重懸后的菌液放于O?4°C的冷藏環(huán)境下備用;
[0008](2)農(nóng)桿菌注射
[0009]選取不同成熟期的果實(shí)進(jìn)行注射，注射農(nóng)桿菌懸浮液至果實(shí)中，從果柄處注入菌液，每次注射20微升，每天注射一次，一共連續(xù)注射三天；
[0010](3) gus組織染色檢測(cè)
[0011]分別在注射后第三天、第五天、第七天將注射后的果實(shí)摘下，用刀片切成I?2毫米的薄片，放入gus染色液中，進(jìn)行染色鑒定，染色過(guò)夜后用70%酒精去除葉綠素后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率以gus染色率來(lái)表示，在染色后的果實(shí)薄片中，以藍(lán)色占果面50 %以上為準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)出具有g(shù)us基因瞬時(shí)表達(dá)的數(shù)量也就是gus染色率:
[0012]gus染色率=(染色的果實(shí)數(shù)量/總注射果實(shí)數(shù))X 100% ；
[0013](4) gus基因表達(dá)量檢測(cè)
[0014]為了進(jìn)一步檢測(cè)農(nóng)桿菌菌液的轉(zhuǎn)化效率，取注射后第五天果實(shí)，提取果實(shí)RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)gus基因表達(dá)量。
[0015]進(jìn)一步，所述農(nóng)桿菌菌液選用根癌農(nóng)桿菌C58、AGLO和EHA105。
[0016]進(jìn)一步，所述YEB液體培養(yǎng)基的配方中包括:酵母提取物lg/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，鹿糖5g/L，硫酸鎂0.5g/L。
[0017]進(jìn)一步，步驟(2)將番茄果實(shí)按照不同的發(fā)育時(shí)期分為五個(gè)不同的時(shí)期，其中前兩個(gè)時(shí)期為番茄果實(shí)綠果期，第一個(gè)時(shí)期為果實(shí)剛剛形成，果實(shí)直徑大約3?5毫米，為小綠果；第二個(gè)時(shí)期為果實(shí)發(fā)育一段時(shí)間后果實(shí)直徑大約5?8毫米，為大綠果；第三個(gè)時(shí)期為番茄果實(shí)開(kāi)始從綠果向白果轉(zhuǎn)化，果實(shí)變白，為白果期；第四個(gè)時(shí)期是番茄果實(shí)由白變黃，為黃果期，直至果實(shí)完全變?yōu)辄S色；第五個(gè)時(shí)期為紅果期，果實(shí)完全為紅色。
[0018]有益效果:本發(fā)明建立了高效快速的農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化番茄果實(shí)細(xì)胞體系，提供一種新的番茄轉(zhuǎn)基因方法，本方法能夠使基因在番茄果實(shí)中短時(shí)間內(nèi)得到表達(dá)，比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法更快速，更便捷；因?yàn)楸痉椒ú捎玫氖腔铙w注射的方法，而非以往常用的離體注射，或者是離體涂抹，以往常規(guī)方法均不能夠從根本上改變基因的表達(dá)量，也不能夠在果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中通過(guò)對(duì)某些基因的干擾或者超標(biāo)達(dá)觀察果實(shí)發(fā)育狀況，本發(fā)明方法不僅僅簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，而且能夠通過(guò)對(duì)果實(shí)發(fā)育中一些基因表達(dá)量的改變來(lái)觀察到番茄果實(shí)成熟發(fā)育中的變化，能夠更加清楚的了解番茄果實(shí)成熟發(fā)育收那些基因的控制。
[0019]說(shuō)明書(shū)附圖
[0020]圖1為不同菌株和不同發(fā)育時(shí)期對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響的柱狀對(duì)比圖；
[0021 ] 圖2為不同菌液OD值對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響的柱狀圖；
[0022]圖3為不同取樣時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響的柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于所述實(shí)施例。
[0024]實(shí)施例:
[0025]本實(shí)施例的試驗(yàn)對(duì)象選用番茄品種‘Micro-Tom’的果實(shí)作為農(nóng)桿菌注射的植物受體，種植于日光溫室中。Micro-Tom是一種番茄突變體，它保留了普通番茄作為模式植物的基本特征，但植株矮小、生命周更短，具有節(jié)省研究空間、縮短研究時(shí)間的巨大優(yōu)勢(shì)，能夠在短時(shí)間內(nèi)使目的基因在番茄果實(shí)中得到表達(dá)，并且研究分析相關(guān)的基因功能。試驗(yàn)過(guò)程中同樣的試驗(yàn)至少重復(fù)5次以上，以保證試驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
[0026]本實(shí)施例選用的三種根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)為C58、AGLO和EHA105。這三種菌株都是番茄轉(zhuǎn)基因中常用的農(nóng)桿菌菌株，通過(guò)注射后相關(guān)基因的表達(dá)量可以確定在番茄果實(shí)的農(nóng)桿菌注射中使用哪一個(gè)菌株效果最好，三個(gè)菌株中都攜帶包含gus基因的pBI121質(zhì)粒。
[0027]具體試驗(yàn)方法包括以下步驟:
[0028](I)將上述三種菌株的菌液分別在YEB固體培養(yǎng)基上劃線后挑取單菌落在YEB液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)，YEB液體培養(yǎng)基中添加卡那霉素50mg/L和利福平100mg/L，具體的，YEB液體培養(yǎng)基的配方中含有酵母提取物lg/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，蔗糖5g/L，硫酸鎂0.5g/L。在28°C的條件下，180?200rmp振蕩培養(yǎng)約12?16小時(shí)至0D600約為0.4?
0.8，將50mL菌液在離心機(jī)中5000rmp離心后倒去上清液，收集菌體沉淀。將收集的沉淀用MS液體培養(yǎng)基懸浮液重懸，重懸后測(cè)定0D600在