一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，主要涉及一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 草莓是薔薇科（Rosaccae)草莓屬（Fragaria)宿根性多年生草本果樹。目前國 內(nèi)對(duì)草莓的研宄多集中在生理生化方面，而對(duì)于基因挖掘與功能分析的報(bào)道較少；其次，對(duì) 草莓的果實(shí)研宄較多如果實(shí)著色等，而對(duì)草莓的根系研宄較少。此外，森林草莓（Fragaria vesca)基因組已測序完成，且已進(jìn)行基因注釋，這對(duì)挖掘控制重要性狀的功能基因具有重 要意義。目前缺少一套穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)基因體系，已經(jīng)成為制約草莓分子生物學(xué)研宄的瓶頸。
[0003]根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes)均是革蘭氏陰性土壤細(xì)菌，分別應(yīng)用其Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒侵染植物傷口進(jìn)入 細(xì)胞，并將其上含有的一段T-DNA插入到植物基因組中（Zhou, 2010 ;Cheng，2011)，發(fā)根農(nóng) 桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA上有rolA-D基因群，T-DNA有tms基因，能誘發(fā)被感染植物的受 傷部位產(chǎn)生大量的毛狀根，且Ri質(zhì)粒T-DNA上的基因不影響植株的再生，轉(zhuǎn)化效率高， 目前已在甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.)、煙草（NicotianatabacumL.)等中獲得成 功。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的毛狀根屬于激素自養(yǎng)型，具有有效成分含量高、生理生化和遺傳性穩(wěn) 定、易于進(jìn)行操作控制等特點(diǎn)，且所誘導(dǎo)的毛狀根可從形態(tài)水平上鑒定，根多叢生、多分枝、 多根毛，且無向地性，這些都可與未轉(zhuǎn)化的根區(qū)別開。
[0004] 目前，草莓轉(zhuǎn)基因還未見報(bào)道，因此，對(duì)于草莓的遺傳改良和基因挖掘與功能分 析，建立一套農(nóng)桿菌介導(dǎo)的、高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是很必要的。本發(fā)明的目的在于利用 發(fā)根農(nóng)桿菌建立森林草莓毛狀根誘導(dǎo)體系，從而提供一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明可以提供一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，獲得森林草莓毛狀根。
[0006] 本發(fā)明所提出的技術(shù)方案包括以下步驟：
[0007] (1)制備草莓無菌苗；
[0008] (2)發(fā)根農(nóng)桿菌活化，將發(fā)根農(nóng)桿菌在LB固體培養(yǎng)基上劃線，以獲得單菌落，挑取 單菌落于LB液體培養(yǎng)基上，經(jīng)暗培養(yǎng)；
[0009] (3)侵染外植體，將草莓無菌苗下胚軸切除，在傷口處涂抹已活化的發(fā)根農(nóng)桿菌， 然后將其放在共培養(yǎng)基上，經(jīng)光照培養(yǎng)；
[0010] (4)共培養(yǎng)；
[0011] (5)發(fā)根培養(yǎng)；
[0012] (6)熒光檢測。
[0013] 進(jìn)一步地，其中所述的發(fā)根農(nóng)桿菌為MSU440,載體上具35S: :DsRed報(bào)告基因。
[0014] 進(jìn)一步地，其中步驟（2)中LB固體培養(yǎng)基或者LB液體培養(yǎng)基含50?lOOmg/L壯 觀霉素（spectinomycin) 〇
[0015] 進(jìn)一步地，其中步驟（2)中將發(fā)根農(nóng)桿菌在LB固體培養(yǎng)基上劃線，經(jīng)28±2°C暗處 倒置培養(yǎng)48-72h后獲得單菌落。
[0016] 進(jìn)一步地，其中步驟（2)中所述的暗培養(yǎng)系經(jīng)28±2°C、搖床轉(zhuǎn)速200±20rpm暗培 養(yǎng) 48h。
[0017] 進(jìn)一步地，其中步驟（3)還包括將侵染后的草莓無菌苗胚根放在鋪有1/2無菌濾 紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，Parafilm膜封口 2/3。
[0018] 進(jìn)一步地，其中步驟（4)的共培養(yǎng)系經(jīng)21±2°C光照16h、暗培養(yǎng)8h，如此反復(fù)培養(yǎng) 5d〇
[0019] 進(jìn)一步地，其中步驟（1)包括森林草莓種子，冷處理，4°C冰箱保存7天；種子消 毒：75%乙醇處理5min，1 %的NaCIO再處理5min，無菌蒸餾水沖洗2-3次；接種于MS基上， 暗培養(yǎng)10天。
[0020] 進(jìn)一步地，其中步驟（5)的繼代培養(yǎng)包括將浸染后的外植體從共培養(yǎng)培養(yǎng)基上更 換到發(fā)根培養(yǎng)基上，Parafilm膜全封口，24°C?25°C光照16h，暗培養(yǎng)8h，如此反復(fù)培養(yǎng) 25d，每周更換一次培養(yǎng)基。
[0021] 進(jìn)一步地，其中步驟（6)包括采用體視熒光顯微鏡對(duì)共轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行熒光觀察。
[0022] 本發(fā)明通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)（1個(gè)半月）得到毛狀 根，節(jié)約研宄時(shí)間，并且轉(zhuǎn)化效率較高，可達(dá)到70%左右（陽性植株總數(shù)占總侵染外植體植 株總數(shù)的百分比）。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 現(xiàn)在結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明各步驟進(jìn)行詳細(xì)描述：
[0024] 1、含35S::DsRed報(bào)告體系的表達(dá)載體MSU440發(fā)根農(nóng)桿菌：由瓦赫寧根大學(xué)Ton Bisseling課題組饋贈(zèng)。
[0025] 2、森林草莓種子，冷處理，4°C冰箱保存7天；種子消毒：75%乙醇處理5min，l%的 次氯酸鈉NaCIO再處理5min，無菌蒸餾水沖洗2-3次；接種于MS基上，暗培養(yǎng)10天。
[0026] 3、發(fā)根農(nóng)桿菌的活化：將發(fā)根農(nóng)桿菌在含50mg/L壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上 劃線，28°C暗處倒置培養(yǎng)48-72h后獲得單菌落，挑取單菌落于新鮮含50mg/L壯觀霉素 (spectinomycin)LB液體培養(yǎng)基上，28°C220rpm暗培養(yǎng)48h。吸取菌液再次涂布于含50mg/ L壯觀霉素（spectinomycin)的LB固體培養(yǎng)基上，48-72h后用于侵染外植體。
[0027] 4、侵染外植體：先將森林草莓無菌苗下胚軸切除，在傷口處涂抹已活化的發(fā)根農(nóng) 桿菌MSU440,然后將其放在有鋪有1/2無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，Parafilm膜封口 2/3。
[0028] 5、共培養(yǎng)：21±1°C光照16小時(shí)、暗培養(yǎng)8h，如此反復(fù)培養(yǎng)5d。
[0029] 6、發(fā)根培養(yǎng)：更換到發(fā)根培養(yǎng)基上，方法同步驟（4)，Parafilm膜全封口，24°C? 25°C光照16小時(shí)、暗培養(yǎng)8h，如此反復(fù)，培養(yǎng)25d，每周更換一次培養(yǎng)基。
[0030] 7、熒光檢測：利用體視熒光顯微鏡對(duì)共轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行熒光觀察，結(jié)果表明：轉(zhuǎn) 35S: :DsRed植株根系可見整條根均有較強(qiáng)紅色熒光。
[0031] 本發(fā)明中主要培養(yǎng)基及試劑如下，其中LB培養(yǎng)基溶解后不調(diào)pH值：
[0032] 木本植物基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基）：MS+1 %蔗糖+0. 9 %瓊脂
[0033] 共培養(yǎng)培養(yǎng)基：g/L(參見表1)
[0034]表1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 制備草莓無菌苗； (2) 發(fā)根農(nóng)桿菌活化，將發(fā)根農(nóng)桿菌在LB固體培養(yǎng)基上劃線，以獲得單菌落，挑取單菌 落于LB液體培養(yǎng)基上，經(jīng)暗培養(yǎng)； (3) 侵染外植體，將板栗無菌苗下胚軸切除，在傷口處涂抹已活化的發(fā)根農(nóng)桿菌，然后 將其放在共培養(yǎng)基上，經(jīng)光照培養(yǎng)； (4) 共培養(yǎng)； (5 )發(fā)根培養(yǎng)； (6)熒光檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法，其中所述的發(fā)根農(nóng)桿菌 為MSU440,載體上具35S :艮告基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法，其中所述的LB固體培養(yǎng) 基或者LB液體培養(yǎng)基含50?100mg/L壯觀霉素（spectinomycin)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3中所述的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法，其中將發(fā)根農(nóng)桿 菌在LB固體培養(yǎng)基上劃線，經(jīng)28±2°C暗處倒置培養(yǎng)48 - 72h后獲得單菌落。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或3中所述的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法，其中所述的暗培 養(yǎng)系經(jīng)28±2°C、搖床轉(zhuǎn)速200±20rpm暗培養(yǎng)48h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法，其中步驟（3)將侵染后 的草莓無菌苗胚根放在鋪有1/2無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，Parafilm膜封口 2/3。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法，其中步驟（4)的共培養(yǎng) 系經(jīng)21±2°C光照16h、暗培養(yǎng)8h，如此反復(fù)培養(yǎng)5d。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法，其中步驟（1)包括森 林草莓種子，冷處理，4°C冰箱保存7天；種子消毒：75%乙醇處理5min，1%的NaCIO再處理 5min,無菌蒸餾水沖洗2-3次；接種于MS基上，暗培養(yǎng)10天。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法，其中步驟（5)的發(fā)根 培養(yǎng)包括將浸染后的外植體從共培養(yǎng)培養(yǎng)基上更換到發(fā)根培養(yǎng)基上，Parafilm膜全封口， 24°C?25°C光照16h，暗培養(yǎng)8h,如此反復(fù)培養(yǎng)25d，每周更換一次培養(yǎng)基。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法，其中步驟（6)包括采用 體視熒光顯微鏡對(duì)共轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行熒光觀察。
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓轉(zhuǎn)基因方法，利用含35S：：DsRed報(bào)告基因的發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440侵染森林草莓無菌苗下胚軸，獲得共轉(zhuǎn)化植株，進(jìn)而得到轉(zhuǎn)化毛狀根。采用本發(fā)明提出的草莓下胚軸轉(zhuǎn)化方法不僅可以大大縮短轉(zhuǎn)化周期（1個(gè)半月），實(shí)驗(yàn)結(jié)果也很直觀。草莓離體毛狀根體系為草莓基因功能驗(yàn)證提供了一種快速可靠的方法。
【IPC分類】C12N15-84, A01H5-06
【公開號(hào)】CN104593410
【申請?zhí)枴緾N201510003996
【發(fā)明人】邢宇, 曹慶芹, 趙晨晨, 秦嶺, 張卿, 楊柳
【申請人】北京農(nóng)學(xué)院
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月5日