專利名稱：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化方法背景技術(shù)苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化研究盡管已經(jīng)開展了二十多年，但是，建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系一直是制約轉(zhuǎn)基因苜蓿研究和應(yīng)用的重要因素。在苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化中，體胚發(fā)生途徑是苜蓿再生的主要途徑。目前，報道的轉(zhuǎn)基因苜蓿主要通過該途徑獲得，如Mckersied等(1996)年將Mn-SOD基因應(yīng)用體胚轉(zhuǎn)化途徑轉(zhuǎn)化了苜蓿獲得了耐旱的苜蓿。Winicov等(1999)年應(yīng)用體胚轉(zhuǎn)化途徑成功將Alfin1轉(zhuǎn)錄因子整合到苜蓿基因組中，獲得了耐鹽堿苜蓿。體胚再生途徑有很多優(yōu)點，如體胚分化數(shù)量大，可以獲得大量的轉(zhuǎn)化材料。其次，轉(zhuǎn)化材料中形成嵌合體的幾率小，減少后代的篩選純化工作量。而且，體胚對于抗生素比較敏感，發(fā)生抗生素篩選逃逸的材料少等。但是，體胚發(fā)生途徑也有其一定的弊端，比如體胚發(fā)生途徑周期長，體胚培養(yǎng)程序復(fù)雜，不易掌握，體胚生長狀態(tài)不均一，高濃度的抗生素嚴(yán)重抑制體胚的發(fā)育等?？偟膩碚f，體胚發(fā)生途徑還是適用于苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化工作的。體胚發(fā)生途徑的外植體來源主要包括子葉、真葉和下胚軸等，其中下胚軸和真葉的分化效率最好。研究表明，下胚軸不適合作為農(nóng)桿菌的直接侵染受體，而下胚軸來源的胚性愈傷組織可以做為農(nóng)桿菌侵染的優(yōu)良受體；苜蓿的真葉因其組織體較大，能夠?qū)r(nóng)桿菌有著較強的耐受能力，并且幼嫩的真葉又有較強的分化能力，所以，真葉也是一種優(yōu)良受體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要目的是克服苜蓿轉(zhuǎn)化頻率低和周期長等制約苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化效率的技術(shù)難題，提高苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化效率和縮短遺傳轉(zhuǎn)化周期。建立了兩種苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化方法，第一種是超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化苜蓿下胚軸胚性愈傷的遺傳轉(zhuǎn)化方法，即以苜蓿下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)過懸浮培養(yǎng)方式，獲得高產(chǎn)和生長狀態(tài)均一的苜蓿胚性愈傷作為轉(zhuǎn)化受體材料，再應(yīng)用超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化胚性愈傷材料，然后在含有抗生素的分化培養(yǎng)基中篩選到具有抗性的體胚，由體胚萌發(fā)、發(fā)芽、生根，最后獲得轉(zhuǎn)化植株。第二種是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化苜蓿幼嫩真葉遺傳轉(zhuǎn)化方法，即以苜蓿幼嫩的真葉作為轉(zhuǎn)化受體材料，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)直接轉(zhuǎn)化真葉，侵染過的真葉在含有抗生素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中篩選到具有抗性的愈傷組織，然后，將抗性愈傷組織接種到不含有抗生素的分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出體胚，體胚萌發(fā)、發(fā)芽、生根，最后獲得轉(zhuǎn)化植株。
本發(fā)明技術(shù)方案是1.應(yīng)用超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化苜蓿下胚軸胚性愈傷的遺傳轉(zhuǎn)化方法1)以苜蓿下胚軸為外植體，在固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出愈傷組織，然后將愈傷組織接種到液體誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，誘導(dǎo)出大量的和均一的胚性愈傷；2)以超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿的胚性愈傷，在含有抗生素的分化培養(yǎng)基中篩選到具有抗性的體胚；3)體胚在萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)出轉(zhuǎn)化植株；4)PCR和Southern blot方法檢測轉(zhuǎn)基因苜蓿植株。
2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿幼嫩真葉遺傳轉(zhuǎn)化方法1)以苜蓿幼嫩的真葉為外植體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化真葉，然后在含有抗生素的固體愈傷培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出抗性愈傷組織；2)將抗性愈傷組織接種到不含有抗生素的分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出成熟的體胚；3)體胚在萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)出轉(zhuǎn)化植株；4)PCR和Southern blot方法檢測轉(zhuǎn)基因苜蓿植株。
本發(fā)明以苜蓿下胚軸為轉(zhuǎn)化受體，在固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出愈傷組織，然后將愈傷組織接種到液體培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)出大量的、均一的胚性愈傷組織，再以該組織作為轉(zhuǎn)化受體，以超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化該受體。該方法克服了固體培養(yǎng)基培養(yǎng)下胚軸時獲得的胚性愈傷不均一的弊端，也顯著的提高了苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化效率，在超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化中，瞬時轉(zhuǎn)化效率可以達到46％，穩(wěn)定表達效率可以達到15.4％。此外，該方法也顯著縮短了苜蓿體胚轉(zhuǎn)化周期，應(yīng)用常規(guī)的直接轉(zhuǎn)化下胚軸愈傷組織獲得轉(zhuǎn)化苗大約需要7-8個月的時間，而采用本發(fā)明的方法需要為5-6個月，即可以獲得大量的轉(zhuǎn)化植株。
本發(fā)明以苜蓿真葉為轉(zhuǎn)化受體，經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染后的真葉在含有較低濃度抗生素的愈傷培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出愈傷組織，然后，將愈傷組織轉(zhuǎn)到撤掉抗生素的分化培養(yǎng)基中進行分化。該方法適度的降低了愈傷培養(yǎng)基中的抗生素濃度，縮短了抗性愈傷組織的誘導(dǎo)周期，獲得的抗性愈傷組織在不含抗生素的分化培養(yǎng)基中能夠很快的分化出體胚來，這使常規(guī)的真葉遺傳轉(zhuǎn)化周期的7-8個月縮短為5-6個月，而且，真葉的遺傳轉(zhuǎn)化效率也高達13.5％。
具體實施例方式
實施例1應(yīng)用超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化方法1材料1)苜蓿種子為公主嶺1號，購于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。
2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株LBA4404和轉(zhuǎn)化載體pBI121均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；含有目的基因SsNHX1(堿蓬的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因)的轉(zhuǎn)化載體pBI121由東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存和構(gòu)建，能夠公開獲得。該目的基因和轉(zhuǎn)化載體pBI121在美國NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄號分別為AF370358和AF485783。
2方法1)苜蓿種子首先要經(jīng)過細砂紙打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡處理10分鐘，倒掉酒精后用無菌水沖洗3-4次，再用0.1％升汞處理20分鐘，倒掉升汞用無菌水沖洗5-6次，最后將無菌種子接種到發(fā)芽培養(yǎng)基(Ms鹽+3.0％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.8)中，在25℃條件下，弱光培養(yǎng)1天。
2)待下胚軸長出時用手術(shù)刀將其切下，大約長度為0.5毫米左右，然后將下胚軸接種到固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Ms鹽+UM有機+CH 2克+2.4-D 2毫克/L+KT0.25毫克/L+3.0％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.8)中培養(yǎng)20-30天左右，當(dāng)愈傷組織生長成組織密實、顏色淺綠時為宜。
3)將合適的愈傷組織接種到液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖，pH5.8)中懸浮培養(yǎng)，每間隔5-7天換一次新鮮的培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速維持在150轉(zhuǎn)為宜，需要適當(dāng)補充光照。大約20-30天左右時，大量的、均一的胚性愈傷組織生長成熟。
4)在含有目的基因的農(nóng)桿菌LBA4404平板中挑取單菌落接種到3毫升YEB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，再取1毫升轉(zhuǎn)到50毫升的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待生長到光密度值為0.6左右時，離心4000轉(zhuǎn)，10分鐘，收集菌體，待用。
5)收集菌體用共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基(Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升+3.0％蔗糖，pH5.8)50毫升重懸兩次。
6)將胚性愈傷組織10個為一批裝到2.0毫升的小離心管中，管中盛有600微升液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基(Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升+3.0％蔗糖，pH5.8)，將裝有胚性愈傷組織的小離心管放到超聲儀中，參數(shù)為100mHz處理8秒中，然后，快速將管中的液體培養(yǎng)基吸出，迅速加入1毫升的農(nóng)桿菌重懸液，侵染30分鐘。
7)將浸染過的胚性愈傷組織平放在半固體共培養(yǎng)基(Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升+3.0％蔗糖+0.4％瓊脂，pH5.8)中暗培養(yǎng)3-5天，溫度為25℃。
8)將共培養(yǎng)后的胚性愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基(Ms鹽+NAA0.05毫克/升+6-BA 0.5毫克/升+3.0％蔗糖+頭孢霉素300毫克/升+卡那霉素50毫克/升，0.58％瓊脂，pH5.8)培養(yǎng)50-60天，胚性愈傷組織經(jīng)過四個胚期生長成成熟的體胚。在此期間每隔20天換一次新鮮的培養(yǎng)基。
9)將成熟的體胚外植體再轉(zhuǎn)入萌發(fā)培養(yǎng)基(Ms鹽+頭孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58瓊脂，pH5.8)中萌發(fā)。培養(yǎng)條件為25℃，18:6光周期。大約20-30天左右，體胚生長出完整地轉(zhuǎn)化植株，當(dāng)植株長到10厘米左右時煉苗移栽。
3結(jié)果1)本技術(shù)使用了150個苜蓿下胚軸作為外植體，共獲得了468塊均一的胚性愈傷組織，胚性愈傷組織的得率高達312％。
2)在超聲輔助介導(dǎo)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中，其中Gus瞬時表達率為46％，遠遠高于對照的8％，外源基因的穩(wěn)定表達也高達15.4％。
3)應(yīng)用本技術(shù)也縮短了苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化周期，比傳統(tǒng)的以子葉、真葉作為外植體直接侵染的方法的7-8個月，可以縮短到5-6個月。
4)提取轉(zhuǎn)化材料嫩葉進行PCR擴增檢測，證明外源基因已經(jīng)整合到苜?；蚪M中。
實施例2農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿真葉遺傳轉(zhuǎn)化方法1材料1)苜蓿種子公主嶺1號，購于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。
2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株LBA4404和轉(zhuǎn)化載體pBI121均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；含有目的基因SsNHX1(堿蓬的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因)的轉(zhuǎn)化載體pBI121由東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存和構(gòu)建，能夠公開獲得。該目的基因和轉(zhuǎn)化載體pBI121在美國NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄號分別為AF370358和AF485783。
2方法1)苜蓿種子首先要經(jīng)過細砂紙打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡處理10分鐘，倒掉酒精后用無菌水沖洗3-4次，再用0.1％升汞處理20分鐘，倒掉升汞用無菌水沖洗5-6次，最后將無菌的種子接種到發(fā)芽培養(yǎng)基(Ms鹽+3.0％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.8)中，在25℃條件下，培養(yǎng)4-5天，真葉剛剛展開為宜。
2)在含有目的基因的農(nóng)桿菌LBA4404平板中挑取單菌落接種到3毫升YEB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，再取1毫升轉(zhuǎn)到50毫升的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待生長到光密度值為0.6左右時，離心4000轉(zhuǎn)，10分鐘，收集菌體，待用3)收集菌體用共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基(Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升+3.0％蔗糖，pH5.8)50毫升重懸兩次，然后用共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌稀釋3倍。
4)用剪刀將真葉剪下來，然后將真葉侵染到農(nóng)桿菌中，侵染30分鐘，然后，將將浸染過的真葉的遠軸面放在半固體共培養(yǎng)基(成分Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升+3.0％蔗糖，0.4％瓊脂，pH5.8)中暗培養(yǎng)3-5天，溫度為25℃。
5)將共培養(yǎng)后的真葉接種到含有抗生素的愈傷培養(yǎng)基(Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+頭孢霉素300毫克/升+卡那霉素30毫克/升，0.58％瓊脂，pH5.8)培養(yǎng)50-60天后，抗性愈傷組織誘導(dǎo)出來。在此期間每隔20天換一次新鮮的培養(yǎng)基。
6)將抗性愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基(Ms鹽+NAA0.05毫克/升+6-BA 0.5毫克/升+3.0％蔗糖+頭孢霉素300毫克/升，0.58％瓊脂，pH5.8)培養(yǎng)50-60天，胚性愈傷組織經(jīng)過四個胚期生長成成熟的體胚。在此期間每隔20天換一次新鮮的培養(yǎng)基。
7)將成熟的體胚外植體再轉(zhuǎn)入萌發(fā)培養(yǎng)基(Ms鹽+頭孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58瓊脂，pH5.8)中萌發(fā)。培養(yǎng)條件為25℃，18:6光周期。大約20-30天左右，體胚生長出完整地轉(zhuǎn)化植株，當(dāng)植株長到10厘米左右時煉苗移栽。
3結(jié)果1)本技術(shù)使用了650個苜蓿真葉作為受體，共獲得了72塊抗性愈傷組織，抗性愈傷組織的得率高達11.1％。
2)在72塊抗性愈傷組織中，其中來自68塊愈傷中的植株為PCR陽性植株。
3)應(yīng)用本技術(shù)也縮短了苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化周期，比傳統(tǒng)的以子葉、真葉作為外植體直接侵染的方法的7-8個月，可以縮短到5-6個月。
4)提取轉(zhuǎn)化材料嫩葉進行PCR擴增檢測，證明外源基因已經(jīng)整合到苜?；蚪M中。
權(quán)利要求
1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是應(yīng)用超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化方法應(yīng)用材料1)苜蓿種子為公主嶺1號；2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株LBA4404和轉(zhuǎn)化載體pBI121；含有目的基因SsNHX1-蓬的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的轉(zhuǎn)化載體pBI121；方法步驟1)苜蓿種子首先要經(jīng)過細砂紙打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡處理10分鐘，倒掉酒精后用無菌水沖洗3-4次，再用0.1％升汞處理20分鐘，倒掉升汞用無菌水沖洗5-6次，最后將無菌種子接種到成份為Ms鹽+3.0％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.8的發(fā)芽培養(yǎng)基中，在25℃條件下，弱光培養(yǎng)1天；2)待下胚軸長出時用手術(shù)刀將其切下，大約長度為0.5毫米左右，然后將下胚軸接種到成份為Ms鹽+UM有機+CH 2克+2.4-D 2毫克/L+KT0.25毫克/L+3.0％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.8的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30天左右，當(dāng)愈傷組織生長成組織密實、顏色淺綠時為宜；3)將合適的愈傷組織接種到成份為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖，pH5.8的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，每間隔5-7天換一次新鮮的培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速維持在150轉(zhuǎn)為宜，需要適當(dāng)補充光照。大約20-30天左右時，大量的、均一的胚性愈傷組織生長成熟；4)在含有目的基因的農(nóng)桿菌LBA4404平板中挑取單菌落接種到3毫升YEB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，再取1毫升轉(zhuǎn)到50毫升的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待生長到光密度值為0.6左右時，離心4000轉(zhuǎn)，10分鐘，收集菌體，待用；5)收集菌體用成份為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升+3.0％蔗糖，pH5.8共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基50毫升重懸兩次；6)將胚性愈傷組織10個為一批裝到2.0毫升的小離心管中，管中盛有成份為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升+3.0％蔗糖，pH5.8600的微升液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基，將裝有胚性愈傷組織的小離心管放到超聲儀中，參數(shù)為100mHz處理8秒中，然后，快速將管中的液體培養(yǎng)基吸出，迅速加入1毫升的農(nóng)桿菌重懸液，侵染30分鐘；7)將浸染過的胚性愈傷組織平放在成份為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升+3.0％蔗糖+0.4％瓊脂，pH5.8的半固體共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3-5天，溫度為25℃。8)將共培養(yǎng)后的胚性愈傷組織接種到成份為Ms鹽+NAA0.05毫克/升+6-BA 0.5毫克/升+3.0％蔗糖+頭孢霉素300毫克/升+卡那霉素50毫克/升，0.58％瓊脂，pH5.8的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)50-60天，胚性愈傷組織經(jīng)過四個胚期生長成成熟的體胚，在此期間每隔20天換一次新鮮的培養(yǎng)基；9)將成熟的體胚外植體再轉(zhuǎn)入成份為Ms鹽+頭孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58瓊脂，pH5.8的萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)，培養(yǎng)條件為25℃，18:6光周期，大約20-30天左右，體胚生長出完整地轉(zhuǎn)化植株，當(dāng)植株長到10厘米左右時煉苗移栽。
2.按權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿真葉遺傳轉(zhuǎn)化方法應(yīng)用材料1)苜蓿種子為公主嶺1號；2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株LBA4404和轉(zhuǎn)化載體pBI121；含有目的基因SsNHX1-蓬的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的轉(zhuǎn)化載體pBI121；方法步驟1)苜蓿種子首先要經(jīng)過細砂紙打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡處理10分鐘，倒掉酒精后用無菌水沖洗3-4次，再用0.1％升汞處理20分鐘，倒掉升汞用無菌水沖洗5-6次，最后將無菌的種子接種到成份為Ms鹽+3.0％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.8的發(fā)芽培養(yǎng)基中，在25℃條件下，培養(yǎng)4-5天，真葉剛剛展開為宜；2)在含有目的基因的農(nóng)桿菌LBA4404平板中挑取單菌落接種到3毫升YEB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，再取1毫升轉(zhuǎn)到50毫升的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待生長到光密度值為0.6左右時，離心4000轉(zhuǎn)，10分鐘，收集菌體，待用；3)收集菌體用成份為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升+3.0％蔗糖，pH5.8的共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基50毫升重懸兩次，然后用共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌稀釋3倍；4)用剪刀將真葉剪下來，然后將真葉侵染到農(nóng)桿菌中，侵染30分鐘，然后，將將浸染過的真葉的遠軸面放在成分為的Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升+3.0％蔗糖，0.4％瓊脂，pH5.8的半固體共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3-5天，溫度為25℃；5)將共培養(yǎng)后的真葉接種到含有抗生素的成分為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋2克+2.4-D2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+頭孢霉素300毫克/升+卡那霉素30毫克/升，0.58％瓊脂，pH5.8的愈傷培養(yǎng)基培養(yǎng)50-60天后，抗性愈傷組織誘導(dǎo)出來，在此期間每隔20天換一次新鮮的培養(yǎng)基；6)將抗性愈傷組織接種到成分為Ms鹽+NAA0.05毫克/升+6-BA 0.5毫克/升+3.0％蔗糖+頭孢霉素300毫克/升，0.58％瓊脂，pH5.8的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)50-60天，胚性愈傷組織經(jīng)過四個胚期生長成成熟的體胚，在此期間每隔20天換一次新鮮的培養(yǎng)基；7)將成熟的體胚外植體再轉(zhuǎn)入成分為Ms鹽+頭孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58瓊脂，pH5.8的萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)，培養(yǎng)條件為25℃，18:6光周期，大約20-30天左右，體胚生長出完整地轉(zhuǎn)化植株，當(dāng)植株長到10厘米左右時煉苗移栽。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化方法。建立了兩種苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化方式，一是超聲輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化苜蓿下胚軸胚性愈傷的遺傳轉(zhuǎn)化方法，即以苜蓿下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)過懸浮培養(yǎng)方式，超聲輔助，在培養(yǎng)基中篩選體胚，由體胚萌發(fā)、發(fā)芽、生根，最后獲得轉(zhuǎn)化植株。二是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化苜蓿幼嫩真葉遺傳轉(zhuǎn)化方式，以苜蓿幼嫩的真葉作為轉(zhuǎn)化受體材料，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中篩選，將抗性愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出體胚，體胚萌發(fā)、發(fā)芽、生根，獲得轉(zhuǎn)化植株。本發(fā)明克服了固體培養(yǎng)基培養(yǎng)下胚軸時獲得的胚性愈傷不均一的弊端，也顯著的提高了苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化效率，縮短了遺傳轉(zhuǎn)化周期。
文檔編號C12N15/87GK101063149SQ200710055569
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月25日
發(fā)明者劉立俠, 李望豐, 王德利, 賈廣和, 金太成, 申玉華, 常青, 馬強, 殷東旭, 許守民 申請人:東北師范大學(xué)