專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化柳枝稷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物能源植物柳枝稷的基因工程利用領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及一種 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化柳枝稷的方法。
背景技術(shù)：
隨著國際石油價格大幅走高及石油產(chǎn)品大量消費(fèi)導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境的不斷 惡化，以燃料乙醇和生物柴油為特征的生物能源對于經(jīng)濟(jì)和社會可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略意義日益增大。柳枝稷(英文名Switchgrass， 拉丁名Panicum virgatumlinn)因其栽培技術(shù)簡單，適應(yīng)性廣，防風(fēng)固沙能力強(qiáng)，耐瘠薄， 生物學(xué)產(chǎn)量高，被國際上確定為生產(chǎn)燃料乙醇的首選生物能源植物，并 投入了大量的人力、物力進(jìn)行研究開發(fā)。其中，采用基因工程技術(shù)增強(qiáng) 柳枝稷的抗逆性，提高光合效率，增加生物學(xué)產(chǎn)量，降低木質(zhì)素含量和提高 乙醇產(chǎn)率等方面已成為目前的研究熱點(diǎn)之一。我國在近幾年已引入柳枝稷作為防風(fēng)固沙植物和優(yōu)質(zhì)牧草，并展示出良好的應(yīng)用前景，但在生物能源尤其 是采用基因工程技術(shù)育種研究方面尚處于起步階段。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)以其把外源基因主動導(dǎo)入、定向改造植物的優(yōu)點(diǎn)而日 益受到人們的重視，已發(fā)展成為一種新的育種手段。其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基 因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)因其具有轉(zhuǎn)化的外源DNA結(jié)構(gòu)完整、遺傳穩(wěn)定、拷貝數(shù)低、轉(zhuǎn) 化的DNA片段較大等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前大多數(shù)植物基因轉(zhuǎn)化的首選方法。在 已獲得的柳枝稷轉(zhuǎn)基因植物中，也是采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法完成的。然而，由 于柳枝稷的遺傳轉(zhuǎn)化研究起步較晚及轉(zhuǎn)化較為困難，目前國際上僅有1例轉(zhuǎn) 基因成功的報道(M.N. Somleva ， Z. Tomaszewski ， and B.V.Conger. Agrobacterium-mediated genetic transformation of switchgrass. Crop Sci. 2002，
42:2080-2087)，而且轉(zhuǎn)化效率較低(2%左右)。因此，加強(qiáng)柳枝稷的轉(zhuǎn) 基因研究就具有十分重要的現(xiàn)實意義
發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有柳枝稷轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在 于，提供一種高效的利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化柳枝稷的方法，該方法能夠使轉(zhuǎn)化 效率達(dá)到10%左右，為采用轉(zhuǎn)基因方法對柳枝稷進(jìn)行遺傳改良提供研究基 礎(chǔ)和技術(shù)支持。
為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化柳枝稷的方法，其特征在于，該方法按如下步驟進(jìn)行步驟一人工誘導(dǎo)幼穗為外植體在柳枝稷生長發(fā)育至有6個節(jié)時，人工切取最上處莖節(jié)，切取部位包含莖節(jié)上下區(qū)段長度各1 1.5cm，滅菌；以MBP培養(yǎng)基上人工誘導(dǎo)幼穗，其 中，MBP培養(yǎng)基為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、麥芽糖30g/L、 6-BA (6 —芐基氨基嘌呤)3mg/L 、瓊脂粉7.5g/L， PH=5. 8， 28。C條件下光照 培養(yǎng)至幼穗長度為1 1.5cm。 步驟二誘導(dǎo)胚性愈傷組織將人工誘導(dǎo)幼穗切成0.2mm，同一人工誘導(dǎo)幼穗的切塊置于同一器皿 中，24'C條件下以SMB培養(yǎng)基暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚性愈傷組織，其中，SMB培 養(yǎng)基的配方為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、蔗糖30g/L、2， 4-D(2, 4_ 二氯苯氧乙酸)5mg/L、 6-BA (6 —芐基氨基嘌呤)0. 15mg/L、 PVP (聚乙烯 吡咯烷酮)4.0g/L、瓊脂粉7.0g/L， PH=5.8。 步驟三農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)挑取農(nóng)桿菌的一單克隆于含有卡那霉素和利福平的50mL的LB或AB培 養(yǎng)基中，在28。C條件下，以200 rpm/分鐘 250 rpm/分鐘培養(yǎng)1 2天，
至農(nóng)桿菌菌株濃度為OD6oo二0.8 1.0。其中，LB培養(yǎng)基為10g胰化蛋白 胨、5g酵母提取物、10g氯化鈉，PH = 7.0; AB培養(yǎng)基為AB無機(jī)鹽和磷 酸鹽溶液、葡萄糖5g/L， PH = 7.0;在LB或AB培養(yǎng)基中加入50^11 100mM乙酰丁香酮繼續(xù)培養(yǎng)l 2小時；將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌的50mL離心管中，常溫下，3500 rpm/分鐘，離心 15分鐘收集農(nóng)桿菌，以液體Ml培養(yǎng)基重新懸浮農(nóng)桿菌，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌菌株 濃度為OD柳=0.5;其中，液體M1培養(yǎng)基為MS無機(jī)鹽和維生素混合物 4.43g/L、蔗糖30g/L、 2， 4-D (2,4-二氯苯氧乙酸)1. 5mg/L， PH = 5. 8;用鑷子將愈傷組織夾成直徑為lmm 2皿的塊狀，加入懸浮好的農(nóng)桿菌 菌液，同時加入40pl 100mM乙酰丁香酮，在真空臺上抽真空10 15分鐘后， 常溫下，以50rpm /分鐘 60rpm /分鐘培養(yǎng)20 30分鐘；棄去全部農(nóng)桿菌菌液，用無菌濾紙吸去愈傷組織表面殘留的菌液，然后 將愈傷組織轉(zhuǎn)入用篩選培養(yǎng)基SM1充分浸透過的無菌濾紙上，在20°C 24°C 條件，暗培養(yǎng)2 3天。 步驟四抗性愈傷組織的篩選將愈傷組織轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基SM1， 24°C，暗培養(yǎng)2星期，然后轉(zhuǎn)入篩選 培養(yǎng)基SM2， 24°C，暗培養(yǎng)4星期；其中，篩選培養(yǎng)基SM1為MS無機(jī)鹽和 維生素混合物4. 43g/L、蔗糖30g/L、 2， 4_D (2， 4-二氯苯氧乙酸)1. 5mg/L、 Hpt (潮霉素)75 mg/L、 Cefo (頭孢霉素)250mg/L、 瓊脂粉7. 5 g/L ， PH = 5.8;篩選培養(yǎng)基SM2為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、蔗糖 30g/L、 2， 4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)1. 5mg/L、 Hpt (潮霉素)50 mg/L、 Cefo (頭孢霉素)250mg/L、瓊脂粉7. 5g/L， ffl二5. 8。在此培養(yǎng)期間，若 發(fā)現(xiàn)有農(nóng)桿菌污染的愈傷組織，及時將同皿的其他正常愈傷組織轉(zhuǎn)入新的篩 選培養(yǎng)基篩選。步驟五抗性愈傷組織的分化
將經(jīng)過篩選獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SMK1， 28°C，光照條件 下培養(yǎng)2 3星期，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SMK2， 28°C，光照條件下培養(yǎng)3 4 星期，其中，分化培養(yǎng)基SMK1為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、蔗 糖30g/L、 KT (激動素)0.2mg/L、 Hpt (潮霉素)25 mg/L、 Cefo (頭孢霉 素)250mg/L、瓊脂粉7.5g/L， pH=5. 8;分化培養(yǎng)基SMK2為MS無機(jī)鹽和 維生素混合物4. 43g/L、蔗糖30g/L、 KT (激動素)0. 2mg/L、 Cefo (頭孢 霉素)250mg/L、瓊脂粉7. 5 g/L， pH = 5.8。步驟六再生轉(zhuǎn)化苗的生根培養(yǎng)當(dāng)再生苗生長lcm 2cm高時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基SMO中，28°C，光照條 件下培養(yǎng)3 4星期至幼苗高度為5cm以上，其中，生根培養(yǎng)基SMO為MS 無機(jī)鹽和維生素混合物2. 22g/L、蔗糖8g/L、瓊脂粉7.0 g/L， pH = 5.8。 步驟七移栽至溫室進(jìn)行分子生物學(xué)方法檢測再生植株移栽至溫室中，在幼苗4 6葉期，取葉片進(jìn)行PCR和GUS檢 測，根據(jù)前期檢測結(jié)果，在植株生長至6 8葉期時，對PCR檢測陽性植株 進(jìn)行Southern雜交，獲得含有目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化植株。 步驟八目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的獲得根據(jù)目的基因表達(dá)時期不同，對Southern雜交檢測陽性植株在相關(guān)時 期進(jìn)行RT-PCR 、 Nouthern雜交和Western雜交檢測，同時根據(jù)目標(biāo)性狀， 篩選獲得目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的方法與國際上報道的柳枝稷轉(zhuǎn)基因的研究結(jié)果相比，本發(fā)明在 胚性愈傷的誘導(dǎo)，抗性愈傷組織的篩選，抗性愈傷組織的分化和轉(zhuǎn)化效率等 方面都取得了較大的提高，效果顯著。具體表現(xiàn)在 (1)提高了胚性愈傷的獲得率研究表明，胚性愈傷組織是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的前 提和基礎(chǔ)。在柳枝稷的遺傳轉(zhuǎn)化中，借鑒其他植物的轉(zhuǎn)化經(jīng)驗，主要采用成
熟種子，幼嫩葉片，幼莖，田間幼穗等來誘導(dǎo)愈傷組織。然而，采用這些外 植體誘導(dǎo)愈傷組織，普遍存在胚性愈傷組織得率偏低的問題，大多低于10 %或更少，成為柳枝稷農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的一個瓶頸。本發(fā)明以人工誘導(dǎo)幼穗為外植體，胚性愈傷得率接近60%,為利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對柳枝稷進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化奠定了良好的基礎(chǔ)。(2) 建立了較為有效的抗性愈傷組織篩選體系 在抗性愈傷組織篩選階段，必須建立一個非轉(zhuǎn)化愈傷組織的抑制和轉(zhuǎn)化愈傷組織的生長的平衡關(guān)系。篩選壓力太小，勢必造成非轉(zhuǎn)化愈傷組織的大量逃逸；而篩選壓力過大，又會影響轉(zhuǎn)化愈傷組織的生長，甚至不能獲得抗性愈傷組織。本發(fā)明中在抗性愈傷篩選階段，采用2種培養(yǎng)基，2次篩選，篩選壓力先高后低，根據(jù)統(tǒng)計抗性愈傷組織獲得情況和后期檢測結(jié)果，既獲 得了抗性愈傷組織，也避免了非轉(zhuǎn)化愈傷組織的大量逃逸，建立了較為高效 的篩選體系。(3) 確立了有效的抗性愈傷組織分化體系 在抗性愈傷組織分化階段，也存在對非轉(zhuǎn)化愈傷組織的抑制問題，因為較高的非轉(zhuǎn)化愈傷組織既增加了后期分子生物學(xué)鑒定的工作量，也存在與轉(zhuǎn) 化愈傷組織的彼此消長問題。因此，在抗性愈傷組織分化階段，借鑒其他植 物的轉(zhuǎn)化經(jīng)驗，也需加入一定的篩選壓力。然而，篩選壓力的加入會對轉(zhuǎn)化 愈傷組織的生長造成一定地不利影響，如分化時間延長，幼苗生長緩慢甚至 死亡等。建立一個非轉(zhuǎn)化愈傷組織的抑制和轉(zhuǎn)化愈傷組織的正常分化的平衡 關(guān)系，也是柳枝稷抗性愈傷組織分化階段必須考慮的問題。在本發(fā)明中，采 用2種分化培養(yǎng)基，2次篩選，篩選壓力先低后無，體現(xiàn)了對非轉(zhuǎn)化愈傷組 織的一定抑制，也保證了轉(zhuǎn)化愈傷組織能正常分化和生長發(fā)育。(4) 獲得了較為高效的轉(zhuǎn)化效率在現(xiàn)有柳枝稷轉(zhuǎn)化成功的報道中，如果以原始轉(zhuǎn)化的愈傷組織為基準(zhǔn)，
轉(zhuǎn)化效率僅為2%左右。本發(fā)明在獲得較高的胚性愈傷組織得率，合理的農(nóng) 桿菌轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)，有效的抗性愈傷組織篩選和分化等基礎(chǔ)上，獲得10% 的轉(zhuǎn)化效率，建立了較為高效的柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化體系，為采用轉(zhuǎn)基因方法對 生物能源植物柳枝稷的遺傳改良奠定了一個強(qiáng)有力的基礎(chǔ)。
具體實施方式
本發(fā)明選擇人工誘導(dǎo)的幼穗為外植體，在SMB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷 組織，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株，包括人工誘導(dǎo)適宜的外植體， 在適宜的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織，采用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)，在適 宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，抗性愈傷組織在適宜的培養(yǎng)基再生，轉(zhuǎn)化苗的生根 培養(yǎng)，移栽至溫室進(jìn)行分子生物學(xué)方法檢測，根據(jù)目標(biāo)性狀獲得目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。具體按如下步驟進(jìn)行(1) 人工誘導(dǎo)幼穗為外植體a. 在柳枝稷生長發(fā)育至有e個節(jié)時，人工切取最上處莖節(jié)，切取部位包 含莖節(jié)上下區(qū)段長度各1 1. 5cm;b. 采用70%的酒精表面消毒1分鐘；c. 采用20%的商業(yè)用次氯酸鈉(加入0. 1%的吐溫100)滅菌10 12 分鐘；d. 以MBP培養(yǎng)基人工誘導(dǎo)幼穗，MBP培養(yǎng)基為MS無機(jī)鹽和維生素混合 物4. 43g/L，麥芽糖30g/L， 6-BA (6 —芐基氨基嘌呤)3mg/L，瓊脂粉7. 5g/L， PH=5.8;e. 28°C ，光照培養(yǎng)15 20天至幼穗長度為1 1. 5cm。(2) 誘導(dǎo)胚性愈傷組織將人工誘導(dǎo)幼穗切成0. 2mm左右長度，24°C ，在SMB培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)30 60天誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織，SMB培養(yǎng)基為MS無機(jī)鹽和維生素混合物 4.43g/L，蔗糖30g/L， 2， 4_D (2, 4-二氯苯氧乙酸)5mg/L， 6-BA (6 —芐 基氨基嘌呤)0. 15mg/L， PVP (聚乙烯吡咯烷酮)4.0g/L，瓊脂粉7. 0g/L， PH= 5.8。(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)a. 挑取農(nóng)桿菌一單克隆于含有卡那霉素和利福平的50mL的LB或AB培 養(yǎng)基中，LB或AB + Kan (卡那霉素)50mg/L + Rif (利福平)25mg/L， 28。C， 200 rpm/分鐘 250 rpm/分鐘，培養(yǎng)1 2天至農(nóng)桿菌菌株濃度為0DB =0.8 1.0; LB培養(yǎng)基為lOg胰化蛋白胨，5g酵母提取物，lOg氯化鈉， PH=7.0; AB培養(yǎng)基為AB無機(jī)鹽和磷酸鹽溶液，葡萄糖5g/L， PH=7.0;b. 在培養(yǎng)基中加入50fi1 lOOmM乙酰丁香酮，28°C， 200rpm /分鐘 250 rpm/分鐘，繼續(xù)培養(yǎng)l-2小時；c. 將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌的50mL離心管中，常溫下，3500 rpni/分鐘，離 心15分鐘收集農(nóng)桿菌；d. 加入40 50mL液體Ml培養(yǎng)基重新懸浮農(nóng)桿菌，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌菌株濃 度為0D,二0.5。液體M1培養(yǎng)基為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L ， 蔗糖30g/L， 2， 4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)1. 5mg/L， PH=5. 8;e. 用鑷子將愈傷組織夾成較小的塊狀(直徑l一2mm左右)，加入懸浮好 的農(nóng)桿菌菌液，同時加入40pl lOOmM乙酰丁香酮，在真空臺上抽真空10 15分鐘后，常溫下，50 60rpm/分鐘，培養(yǎng)20 30分鐘。抽真空和培養(yǎng) 時間長短與篩選階段農(nóng)桿菌能否得到較好抑制具有較大的相關(guān)性；f. 棄去全部農(nóng)桿菌菌液，用無菌濾紙吸去愈傷組織表面殘留的菌液， 然后將愈傷組織轉(zhuǎn)入用篩選培養(yǎng)基SM1充分浸透過的無菌濾紙上，20°C 24 °C ，暗培養(yǎng)2 3天。篩選培養(yǎng)基SM1為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L ， 蔗糖30g/L，2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)1. 5mg/L， Hpt (潮霉素)75mg/L ， Cefo (頭孢霉素)250mg/L，瓊脂粉7. 5 g/L， PH=5. 8。根據(jù)農(nóng)桿菌生長情 況和愈傷組織的狀態(tài)，可適當(dāng)調(diào)整共培養(yǎng)時間。 一般原則，農(nóng)桿菌生長較多，
愈傷組織顏色較深，共培養(yǎng)時間短，反之，則可適當(dāng)延長共培養(yǎng)時間。(4) 抗性愈傷組織的篩選將愈傷組織轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基SM1， 24°C，暗培養(yǎng)2 3星期，然后轉(zhuǎn)入篩 選培養(yǎng)基SM2， 24°C，暗培養(yǎng)2 4星期。篩選培養(yǎng)基SM2為MS無機(jī)鹽和 維生素混合物4.43g/L，蔗糖30g/L，2， 4-D (2， 4-二氯苯氧乙酸)1. 5mg/L， Hpt (潮霉素)50 mg/L， Cefo (頭孢霉素)250mg/L ，瓊脂粉7.5 g/L， PH=5.8。在此培養(yǎng)期間，若發(fā)現(xiàn)有農(nóng)桿菌污染的愈傷組織，及時將同皿的 其他正常愈傷組織轉(zhuǎn)入新的篩選培養(yǎng)基篩選。(5) 抗性愈傷組織的分化 將經(jīng)過篩選獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SMK1， 28°C，光照條件下培養(yǎng)2 3星期，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SMK2， 28°C，光照條件下培養(yǎng)3 4 星期。分化培養(yǎng)基SMK1為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、蔗糖30g/L、 KT (激動素)0.2mg/L、 25mg/L Hpt (潮霉素)、250mg/L Cefo (頭孢霉 素)、瓊脂粉7. 5 g/L， pH = 5. 8; SMK2為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、 蔗糖30g/L、 KT (激動素)0.2mg/L、 Cefo (頭孢霉素)250mg/L、瓊脂粉 7. 5g/L， pH=5. 8。(6) 再生轉(zhuǎn)化苗的生根培養(yǎng)在再生苗l 2cm高時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基SMO中，28°C，光照條件下培 養(yǎng)3 4星期至幼苗高度約為5cm以上。生根培養(yǎng)基SMO為MS無機(jī)鹽和 維生素混合物2. 22g/L、蔗糖8g/L、瓊脂粉7.0 g/L， pH=5.8。(7) 移栽至溫室或大田進(jìn)行分子生物學(xué)方法檢測 再生植株移栽至溫室中，在幼苗期(4 6葉期)取葉片進(jìn)行PCR和GUS檢測。根據(jù)前期檢測結(jié)果，在植株生長至6 — 8葉期時對PCR檢測陽性植株 進(jìn)行Southern雜交，獲得含有目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化植株。(8) 目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的獲得 根據(jù)目的基因表達(dá)時期不同，對Southern雜交檢測陽性植株在相關(guān)時 期進(jìn)行RT-PCR、 Nouthern雜交和Western雜交檢測，同時根據(jù)目標(biāo)性狀， 篩選獲得目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的總體操作流程為人工誘導(dǎo)幼穗為外植體一誘導(dǎo)胚性愈傷組織—農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)一抗性愈傷組織的篩選一抗性愈傷組織的分化一再 生轉(zhuǎn)化苗的生根培養(yǎng)一移栽至溫室或大田進(jìn)行分子生物學(xué)方法檢測一目的 基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的獲得。 以下是發(fā)明人給出的具體實施例。實施例l:以含有潮霉素和卡那霉素篩選標(biāo)記的pCAMBIA1301質(zhì)粒的EHA105農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化Alamo和Blackwell 2個柳枝稷品種。具體轉(zhuǎn)化過程為(1) 人工誘導(dǎo)幼穗a. 在Alamo和Blackwell長發(fā)育至有6個節(jié)時，人工切取最上莖節(jié)處，切 取部位包含上下區(qū)段長度各l. 5cm。分別切取來源不同植株的莖節(jié)2000個；b. 用70%體積濃度的酒精表面消毒1分鐘；c. 用20X體積濃度的商業(yè)用次氯酸鈉(加入O. 1%的吐溫100)滅菌12 分鐘；d. 在MBP培養(yǎng)基上每皿放入2個莖節(jié)人工誘導(dǎo)幼穗，MBP培養(yǎng)基的配方 為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L ，麥芽糖30g/L， 6-BA (6 —芐基 氨基嘌呤)3mg/L，瓊脂粉7.5g/L， PH二5.8;e. 28。C，光照培養(yǎng)20天至幼穗長度為1 1.5cm。(2) 誘導(dǎo)胚性愈傷組織將人工誘導(dǎo)幼穗切成0. 2mm左右長度，同一人工誘導(dǎo)幼穗的切塊置于同 一器皿中，24°C，以SMB培養(yǎng)基暗培養(yǎng)60天誘導(dǎo)愈傷組織，SMB培養(yǎng)基的 配方為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、蔗糖30g/L、 2， 4-D (2，4_二
氯苯氧乙酸)5mg/L、 6-BA (6 —芐基氨基嘌呤)0. 15mg/L、 PVP (聚乙烯吡 咯烷酮)4.0g/L、瓊脂粉7.0g/L， PH=5.8;經(jīng)統(tǒng)計，Alamo的出愈率達(dá)到 95. 5%，其中胚性愈傷組織獲得率為58. 1%， Blackwell的出愈率達(dá)到90. 2 %，其中胚性愈傷組織獲得率為52.6%。 (3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)a. 挑取pCAMBIA1301- EHA105農(nóng)桿菌一單克隆于含有卡那霉素和利福 平的50mL的LB培養(yǎng)基中，LB培養(yǎng)基配方為LB+ Kan (卡那霉素)50mg/L + Rif (利福平)25mg/L， 28°C， 220 rpm/分鐘，培養(yǎng)1天，至農(nóng)桿菌菌株 濃度為0^。=0.8。 LB培養(yǎng)基為10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯 化鈉，PH二7.0;b. 在LB培養(yǎng)基中加入50^1 lOOmM乙酰丁香酮，28°C， 220 rpm /分 鐘，培養(yǎng)1.5小時；c. 將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌的50mL離心管中，常溫下，以3500 rpm/分鐘離 心15分鐘，收集農(nóng)桿菌；d. 加入40mL液體Ml培養(yǎng)基重新懸浮農(nóng)桿菌，液體Ml培養(yǎng)基的配方為 MS無機(jī)鹽和維生素混合物4.43g/L，蔗糖30g/L， 2， 4-D (2,4-二氯苯氧 乙酸)1.5mg/L， PH=5.8;調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌菌株濃度為0D6。。=0. 5;e. 用鑷子將愈傷組織夾成較小的塊狀(直徑l一2mm左右)，加入懸浮好 的農(nóng)桿菌菌液，同時加入40|al lOOmM乙酰丁香酮，在真空臺上抽真空12 分鐘后，常溫下，60rpm/分鐘，培養(yǎng)20分鐘；f. 棄去全部農(nóng)桿菌菌液，用無菌濾紙吸去愈傷組織表面殘留的菌液， 然后將愈傷組織轉(zhuǎn)入用篩選培養(yǎng)基SMl充分浸透過的無菌濾紙上，24°C，暗 培養(yǎng)3天。篩選培養(yǎng)基SMl為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L ，蔗糖 30g/L， 2， 4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)1.5mg/L， Hpt (潮霉素)75mg/L， Cefo (頭孢霉素)250mg/L，瓊脂粉7, 5g/L， PH=5. 8。
(4) 抗性愈傷組織的篩選將愈傷組織按每皿50塊數(shù)量轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基SM1，24'C，暗培養(yǎng)2星期， 然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基SM2， 24°C，暗培養(yǎng)4星期。篩選培養(yǎng)基SM2為MS無 機(jī)鹽和維生素混合物4.43g/L，蔗糖30g/L， 2， 4-D (2，4-二氯苯氧乙酸 1.5mg/L， Hpt (潮霉素)50mg/L， Cefo (頭孢霉素)250mg/L，瓊脂粉7. 5 g/L， ^=5.8。每次轉(zhuǎn)化的胚性愈傷組織數(shù)量約為500小塊，共轉(zhuǎn)化10次。(5) 抗性愈傷組織的分化 將經(jīng)過篩選獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SMKl， 28°C，光照條件下培養(yǎng)2星期，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SMK2， 28°C，光照條件下培養(yǎng)3星期。 分化培養(yǎng)基SMKl為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、蔗糖30g/L、 KT(激動素)0.2mg/L、 Hpt (潮霉素)25mg/L、 Cefo (頭孢霉素)250mg/L、 瓊脂粉7. 5g/L， pH=5.8; SMK2為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、蔗 糖30g/L、 KT(激動素)O. 2mg/L、 Cefo (頭孢霉素)250mg/L、瓊脂粉7. 5g/L， pH=5. 8。(6) 再生轉(zhuǎn)化苗的生根培養(yǎng)在再生苗1 2cm高時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基SM0中，28°C，光照條件下培 養(yǎng)4星期至幼苗高度約為5cm以上。生根培養(yǎng)基SMO為MS無機(jī)鹽和維生 素混合物2.22g/L、蔗糖8g/L、瓊脂粉7.0g/L， pH=5. 8。 10次轉(zhuǎn)化共獲 得再生植株1241株。(7) 移栽至溫室進(jìn)行分子生物學(xué)方法檢測 再生植株移栽至溫室中共成活1183株，在幼苗期(5 6葉期)取葉片進(jìn)行PCR檢領(lǐng)lj，共獲得陽性植株469株。在植株生長至6 — 7葉期時對PCR 檢測陽性植株進(jìn)行Southern雜交檢測，共獲得含有目標(biāo)基因的452株，轉(zhuǎn) 化效率約為9%。若將移栽未成活的植株計算在內(nèi)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到10%左右。(8) 目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的獲得
在7—8葉期，對Southern雜交檢測陽性植株進(jìn)行RT-PCR和Nouthern 雜交檢測，其中452株中有307株RT-PCR和Nouthern雜交均檢測出目的條 帶，表明目的基因已在這些植株中得以表達(dá)。 實施例2:以含有葉片衰老抑制基因PsAcm-IPT的EHA105農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化GA-001A和 NFSG0S-1 2個柳枝稷品種。具體轉(zhuǎn)化過程為(1) 人工誘導(dǎo)幼穗a. 在GA-001A和NFSG0S-l發(fā)育至有6個節(jié)時，人工切取最上莖節(jié)處，切取 部位包含上下區(qū)段長度各l. 5cm。分別切取來源不同植株的莖節(jié)2000個；b. 用70%體積濃度的酒精對植株莖節(jié)表面滅菌1分鐘；c. 用20%體積濃度的商業(yè)用次氯酸鈉(加入0. 1%的吐溫100)滅菌15 分鐘。GA-001A和NFSG0S-1莖稈較為粗壯，滅菌時間延長至15分鐘；d. 在MBP培養(yǎng)基上每皿放入2個莖節(jié)人工誘導(dǎo)幼穗；e. 28。C，光照培養(yǎng)20天，至幼穗長度為1 1.5cm。(2) 誘導(dǎo)胚性愈傷組織 將人工誘導(dǎo)幼穗切成0.2mm左右長度，同一幼穗的切塊置于同一皿中，24°C，在SMB培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)60天誘導(dǎo)愈傷組織。經(jīng)統(tǒng)計，GA-001A的出 愈率達(dá)到92.3%，其中胚性愈傷組織獲得率為54.0%， NFSG0S-1的出愈率 達(dá)到93. 7%，其中胚性愈傷組織獲得率為51. 9%。(3) 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)a. 挑取含有葉片衰老抑制基因PSAG12-IPT的EHA105農(nóng)桿菌一單克隆于 含有卡那霉素和利福平的50mL的LB培養(yǎng)基中，LB+ Kan (卡那霉素)50mg/L + Rif (利福平)25mg/L， 28°C， 220 rpm/分鐘，培養(yǎng)2天至農(nóng)桿菌菌株濃 度為0D咖=0.8。 C0MT- EHA105農(nóng)桿菌活性較差，培養(yǎng)時間延長至2天；b. 在50mL培養(yǎng)基中加入50fil lOOmM乙酰丁香酮，28°C， 220rpm /分 鐘，培養(yǎng)1.5小時；c. 將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌的50mL離心管中，常溫下，3500 rpm/分鐘，離 心15分鐘收集農(nóng)桿菌；d. 加入40mL液體Ml培養(yǎng)基重新懸浮農(nóng)桿菌，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌菌株濃度為 OD, =0.5;e. 用鑷子將愈傷組織夾成較小的塊狀，加入懸浮好的農(nóng)桿菌菌液，同時 加入40^1 lOOmM乙酰丁香酮，在真空臺上抽真空15分鐘后，常溫下，60 rpm /分鐘，培養(yǎng)30分鐘；f. 棄去全部農(nóng)桿菌菌液，用無菌濾紙吸去愈傷組織表面殘留的菌液， 然后將愈傷組織轉(zhuǎn)入用篩選培養(yǎng)基SM1充分浸透過的無菌濾紙上，24°C，暗 培養(yǎng)2天。(4) 抗性愈傷組織的篩選將愈傷組織按每皿50塊數(shù)量轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基SM1， 24°C ，暗培養(yǎng)3星期， 然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基SM2， 24°C，暗培養(yǎng)3星期。每次轉(zhuǎn)化的胚性愈傷組織 數(shù)量約為500小塊，共轉(zhuǎn)化5次。(5) 抗性愈傷組織的分化 將經(jīng)過篩選獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SMK1， 28°C，光照條件下培養(yǎng)3星期，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SMK2， 28°C，光照條件下培養(yǎng)3星期。(6) 再生轉(zhuǎn)化苗的生根培養(yǎng)在再生苗l 2cm高時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基SMO中，28°C，光照條件下培 養(yǎng)3星期至幼苗高度約為5cm以上。5次轉(zhuǎn)化共獲得再生植株360株。(7) 移栽至溫室進(jìn)行分子生物學(xué)方法檢測 再生植株移栽至溫室中共成活335株，在幼苗期(5 6葉期)取葉片進(jìn)行PCR檢測，共獲得陽性植株214株。在植株生長至6 — 7葉期時對PCR檢 測陽性植株進(jìn)行Southern雜交檢測，共獲得含有目標(biāo)基因的203株，轉(zhuǎn)化
效率約為8. 1%。若將移栽未成活的植株計算在內(nèi)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到9%左右。 (8)目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的獲得 在7 —8葉期，對Southern雜交檢測陽性植株進(jìn)行RT-PCR和Nouthern 雜交檢測，其中203株中有173株RT-PCR和Nouthern雜交均檢測出目的條 帶，表明目的基因己在這些植株中得以表達(dá)。測定轉(zhuǎn)基因植株葉片的細(xì)胞分 裂素含量，其中有19株的細(xì)胞分裂素含量顯著高于對照，個別植株表現(xiàn)株 型矮小，分蘗減少；而大多數(shù)植株的細(xì)胞分裂素稍高于對照或與對照基本一 致，甚至有個別植株的細(xì)胞分裂素含量較對照有所降低。
權(quán)利要求
1. 一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化柳枝稷的方法，其特征在于，該方法按如下步 驟進(jìn)行步驟一人工誘導(dǎo)幼穗為外植體在柳枝稷生長發(fā)育至有6個節(jié)時，人工切取最上處莖節(jié)，切取部位包含 莖節(jié)上下區(qū)段長度各1 1.5cm，滅菌；以MBP培養(yǎng)基上人工誘導(dǎo)幼穗，其 中MBP培養(yǎng)基為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、麥芽糖30g/L、 6 — 芐基氨基嘌呤3mg/L、瓊脂粉7.5g/L， PH=5.8， 28。C條件下光照培養(yǎng)至幼 穗長度為1 1.5cm;步驟二誘導(dǎo)胚性愈傷組織將人工誘導(dǎo)幼穗切成0.2mm，同一人工誘導(dǎo)幼穗的切塊置于同一器皿 中，24X:條件下以SMB培養(yǎng)基暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚性愈傷組織，其中，SMB培 養(yǎng)基的配方為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、蔗糖30g/L、 2， 4_二氯 苯氧乙酸5mg/L、 6 —芐基氨基嘌呤0. 15mg/L、聚乙烯吡咯垸酮4. Og/U瓊 脂粉7.0g/L， PH=5.8; 步驟三農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)挑取農(nóng)桿菌一單克隆于含有卡那霉素和利福平的50mL的LB或AB培養(yǎng) 基中，在28'C條件下，以200 rpm/分鐘 250 rpm/分鐘培養(yǎng)l 2天，至 農(nóng)桿菌菌株濃度為OD6。。=0. 8 1. 0;其中，LB培養(yǎng)基為10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，PH =7.0;AB培養(yǎng)基為AB無機(jī)鹽和磷酸鹽溶液，葡萄糖5g/L， PH二7.0; 在LB或AB培養(yǎng)基中加入50|il 100mM乙酰丁香酮繼續(xù)培養(yǎng)1 2小時； 將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌的50mL離心管中，常溫下，3500rpm/分鐘，離心15 分鐘收集農(nóng)桿菌，以液體M1培養(yǎng)基重新懸浮農(nóng)桿菌，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌菌株濃度為OD600 =0.5;其中，液體Ml培養(yǎng)基為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、 蔗糖30g/L、 2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L PH=5. 8;用鑷子將愈傷組織夾成直徑為lmm 2mm的塊狀，加入懸浮好的農(nóng)桿菌 菌液，同時加入40μl 100 mM 乙酰丁香酮，在真空臺上抽真空10 15分鐘后， 常溫下，以50rpm /分鐘 60 rpm /分鐘培養(yǎng)20分鐘 30分鐘；棄去全部農(nóng)桿菌菌液，用無菌濾紙吸去愈傷組織表面殘留的菌液，然后 將愈傷組織轉(zhuǎn)入用篩選培養(yǎng)基SM1充分浸透過的無菌濾紙上，在20°C 24 °。條件，暗培養(yǎng)2 3天； 步驟四抗性愈傷組織的篩選將愈傷組織轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基SM1， 24℃，暗培養(yǎng)2星期，然后轉(zhuǎn)入篩選 培養(yǎng)基SM2， 24℃，暗培養(yǎng)4星期；其中，篩選培養(yǎng)基SM1為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4.43g/L、蔗糖 30g/L、 2，4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L、潮霉素75 mg/L、頭孢霉素250mg/L、 瓊脂粉7.5g/L， PH=5.8;篩選培養(yǎng)基SM2為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、蔗糖30g/L、 2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L、潮霉素50mg/L、頭孢霉素250mg/L、瓊脂粉 7.5g/L， PH=5.8;在此培養(yǎng)期間，若發(fā)現(xiàn)有農(nóng)桿菌污染的愈傷組織，及時 將同皿的其他正常愈傷組織轉(zhuǎn)入新的篩選培養(yǎng)基篩選； 步驟五抗性愈傷組織的分化將經(jīng)過篩選獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SMKl， 28℃，光照條件 下培養(yǎng)2 3星期，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SMK2， 28℃，光照條件下培養(yǎng)3 4 星期；其中，分化培養(yǎng)基SMK1為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4.43g/L、蔗糖 30g/L、激動素0. 2mg/L、潮霉素25 mg/L、頭孢霉素250mg/L、瓊脂粉7. 5 g/L， pH=5. 8;分化培養(yǎng)基SMK2為MS無機(jī)鹽和維生素混合物4. 43g/L、蔗糖30g/L、 激動素0.2mg/L、頭孢霉素250mg/L、瓊脂粉7. 5g/L， pH = 5.8; 步驟六再生轉(zhuǎn)化苗的生根培養(yǎng)當(dāng)再生苗生長lcm 2cm高時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基SMO中，28°C，光照條 件下培養(yǎng)3 4星期至幼苗高度為5cm以上，其中，生根培養(yǎng)基SMO為MS 無機(jī)鹽和維生素混合物2. 22g/L、蔗糖8g/L、瓊脂粉7.0 g/L ， pH=5.8; 步驟七移栽至溫室進(jìn)行分子生物學(xué)方法檢測再生植株移栽至溫室中，在幼苗4 6葉期，取葉片進(jìn)行PCR和GUS檢 測，根據(jù)前期檢測結(jié)果，在植株生長至6 8葉期時，對PCR檢測陽性植株 進(jìn)行Southern雜交，獲得含有目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化植株； 步驟八目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的獲得根據(jù)目的基因表達(dá)時期不同，對Southern雜交檢測陽性植株在相關(guān)時 期進(jìn)行RT-PCR、 Nouthern雜交和Western雜交檢測，同時根據(jù)目標(biāo)性狀， 篩選獲得目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化柳枝稷的方法。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化柳枝稷時，選擇人工誘導(dǎo)的幼穗為外植體，在SMB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織，采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)，在篩選培養(yǎng)基SM1和SM2上依次進(jìn)行篩選獲得抗性愈傷組織，將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SMK1和SMK2上依次分化獲得再生植株，再生植株在生根培養(yǎng)基SMO中培養(yǎng)成苗，移栽至溫室或大田進(jìn)行分子生物學(xué)方法檢測，根據(jù)分子生物學(xué)方法和目標(biāo)性狀篩選獲得外源目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明建立的柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到10％左右，為采用轉(zhuǎn)基因方法對生物能源植物柳枝稷的遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/87GK101121940SQ200710018260
公開日2008年2月13日 申請日期2007年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日
發(fā)明者劉曙東, 奚亞軍 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)