專利名稱：：一種軍團菌培養(yǎng)基及其配制方法以及軍團菌試劑盒的使用方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及軍團菌檢測
技術領域：
，尤其是一種軍團菌培養(yǎng)基及其配制方法、利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)制成的軍團菌試劑盒的使用方法。
背景技術：
：1977年在美國首次發(fā)現(xiàn)了軍團菌及其引起的軍團病。此病主要表現(xiàn)為嚴重肺炎，并有較高的死亡率；目前在美國占細菌性肺炎發(fā)病數(shù)的第三位，因此為世界各國所高度重視；我國政府衛(wèi)生部也十分關心軍團病的防治工作。但本病難以依靠臨床表現(xiàn)和各種臨床檢査做出診斷，而幾乎完全依賴實驗室的病原檢査方法做出確診，因而很容易漏診、誤診以至于耽誤病人的治療和預防。因此準備好并能充分供應，能夠被廣大防病醫(yī)療單位接受和常規(guī)使用的軍團病檢驗產(chǎn)品極為重要。軍團菌檢驗產(chǎn)品基本可分兩類-(1)從臨床標本中培養(yǎng)檢出軍團菌；由軍團菌培養(yǎng)制備出來的抗原和抗體產(chǎn)品如血清學微量凝集試劑盒、軍團菌分型診斷血清試劑盒和軍團菌尿抗原金標層析條試劑盒、直接免疫熒光技術等，都是當前軍團病診斷的主流產(chǎn)品。(2)軍團菌分子生物學診斷產(chǎn)品如核酸探針、聚合酶鏈反應技術等。但此類試驗因為特異性、敏感性、價格等問題，目前仍僅作為輔助診斷方法，故未納入本系列產(chǎn)品的范圍。由于軍團菌的生長需要特殊的原料——半胱氨酸、可溶性鐵和多種昂貴的進口試劑等，同時影響其生長的因素也很多，所以此類軍團菌檢驗產(chǎn)品的制造要求和成本都很高，故國內至今僅有零星的產(chǎn)品供應，且不僅質量難以保證也價格不菲；而進口產(chǎn)品常常缺貨，其價格更加昂貴，故至今國內包括北京、上海等大城市的絕大多數(shù)疾控中心和醫(yī)院，都未能常規(guī)開展此類檢驗項目，從而使此問題成為阻礙我國軍團病防治和研究工作進一步開展的瓶頸。
發(fā)明內容本發(fā)明解決的技術問題之一在于提供一種有效、使用方便的軍團菌培養(yǎng)基及其配制方法。本發(fā)明解決的技術問題之二在于提供一種軍團菌檢驗試劑盒的使用方法。本發(fā)明解決的技術問題之一是通過如下技術方案實現(xiàn)的主要成分包含有酵母、ACES、瓊脂、可溶性焦磷酸鐵、酮戊二酸、阿拉伯樹膠、活性炭、碳黑、K0H、L-半胱氨酸、萬古霉素、多黏菌素B、放線菌酮。各成分的含量比為酵母10克、ACES10克、瓊脂15克、可溶性焦磷酸鐵0.25克、酮戊二酸1克、阿拉伯樹膠3克、活性炭1.5克、碳黑2克、K0H2.8克、L-半胱氨酸0.4克、萬古霉素1毫升、多黏菌素B8萬單位、放線菌酮80毫克。按如下方法進行配制先將酵母粉10克、ACES10克、瓊脂粉15克、可溶性焦磷酸鐵0.25克、酮戊二酸l克、阿拉伯樹膠3克、活性炭1.5克、碳黑2克、K0H2.8克和去離子水1000毫升充分混勻后并標定pH為6.9;然后高壓12rC，取出冷卻到約5(TC;加入經(jīng)0.22y濾膜過濾的含L-半胱氨酸0.4克、萬古霉素l毫克、多黏菌素B8萬單位、放線菌酮80毫克的5毫升液體；再次充分混勻后傾倒平板即可。本發(fā)明解決的技術問題之二是通過如下技術方案實現(xiàn)的按如下步驟進行A、準備待測血清采集被檢者的血液1-2毫升；分離血清后，取血清200微升加入1支清潔小試管中，再加入專用稀釋液600微升混勻使成為1/4稀釋的待測血清；B、進一步稀釋血清取清潔稀釋用塑條1條或清潔小試管6支，于塑條上的6個孔或6個小試管中，用加液器各加入專用稀釋液200微升；然后再以待測血清順次于前5孔或管中做對倍稀釋，棄去最后的200微升稀釋血清，使各孔或管中200微升被檢血清的稀釋度為1/8，1/16，1/32，1/64和1/128;最后l孔(或管)為無血清對照；C、用裝上1支200微升吸頭的玻璃套管，于1塊清潔的96(V形)孔板中，先加1滴(約25微升)專用稀釋液于對照排各孔，然后按低稀釋度到高稀釋度的順序，再分別加1滴于相應稀釋血清排各孔；D、分別將裝有1支200微升吸頭的染色抗原瓶(7種)搖勻并倒置，于各孔中滴加l滴染色抗原；最后在板上加一塊玻璃蓋并置于36士rC處，第二天取出觀察結果。如準備待測血清步驟中使用3倍稀釋液時，可取1份稀釋液加2份滅菌蒸餾水或去離子水并混勻。本發(fā)明改進的培養(yǎng)基效果如下表軍團菌A在改進配方GVPC瓊脂(36°C4日)中的生長情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*LP1Knoxville(ATCC33153)，LP6Chicago2(ATCC33215)**三次實驗的均數(shù)；LP1X2=4.24，LP6X2=3.94P《0.05在本發(fā)明以上工作的基礎上，為填補國內空白，首次研制和初步建立了除分子生物學以外的幾乎完整并可長期穩(wěn)定供應的軍團菌軍團病檢驗產(chǎn)品；如各種規(guī)格的軍團菌培養(yǎng)基、微量凝集試劑盒、分型診斷血清試劑盒和軍團菌尿抗原金標條等；并首次根據(jù)市場用戶的不同需要，創(chuàng)新性地設計和制備了《軍團菌成套鑒定試驗試劑盒》《軍團菌環(huán)境水標本培養(yǎng)試劑盒》《軍團菌病人標本培養(yǎng)試劑盒》等。如此可以不僅進一步方便了用戶，也提高了工作質量。另外，在保證原有效果的前提下，也首次在《軍團菌血清學微量凝集試劑盒》等多種試劑盒的操作方法中，創(chuàng)新性地少用或不用定量吸管或加液槍而大幅簡化了方法，從而顯著提高效率，有利于方法的進一步推廣。特別是《軍團菌尿抗原金標層析條試劑盒》是當前最簡便、有效、快速因而最有市場前景的軍團病診斷產(chǎn)品具體實施例方式本發(fā)明的軍團菌培養(yǎng)基是在GVPC瓊脂的原配方中加入阿拉伯樹膠和碳黑，以及用自制的ACES取代進口ACES，形成新的質優(yōu)價廉的軍團菌培養(yǎng)基。新配方和配制方法為酵母粉10克、ACES10克、瓊脂粉15克、可溶性焦磷酸鐵0.25克、酮戊二酸l克、阿拉伯樹膠3克、活性炭1.5克、碳黑2克、K0H2.8克和去離子水1000毫升充分混勻后并標定pH為6.9;然后高壓12rC、取出冷卻到約50°C;再加入經(jīng)0.22y濾膜過濾的含L-半胱氨酸0.4克、萬古霉素1毫克、多黏菌素B8萬單位、放線菌酮80毫克的5毫升液體；再次充分混勻后傾倒平板。新的培養(yǎng)基上軍團菌在漆黑的背景下發(fā)育良好，呈微藍灰色飽滿閃光的菌落，在菌落特色、菌落大小和菌落數(shù)等方面，均明顯優(yōu)于原有配方配制的培養(yǎng)基；這樣就能夠為建立我國自己的質優(yōu)價廉的軍團菌系列檢驗產(chǎn)品打下基礎。此外，本發(fā)明參照軍團菌檢驗的國家標準，重點研制了更適合我國國情的簡化微量凝集試驗試劑盒；其使用結果穩(wěn)定，操作方便。該整套的試劑盒主要包括1、軍團菌血清學微量凝集染色抗原A、中套I(嗜肺I-IO，米克戴德，博杰曼)12瓶(每瓶4毫升)B、中套II(嗜肺l-6，米克戴德)7瓶(每瓶4毫升)C、小套(嗜肺1和嗜肺6)2瓶(每瓶4毫升)2、軍團菌陽性對照血清(抗嗜肺l)3、專用稀釋液1-2種，單倍(IX)和3倍(3X)濃度。4、96孔板(V形孔)附玻板蓋。以中套II為例，在使用本發(fā)明的試劑進行臨床菌和環(huán)境菌檢測時；1、先準備測血清采集被檢者的血液l-2毫升。分離血清后，取血清200微升加入l支清潔小試管(自備)中，再加入專用稀釋液600微升混勻(如使用3倍稀釋液時，可取1份稀釋液加2份滅菌蒸餾水或去離子水并混勻，下同)，使成為1/4稀釋的待測血清。2、進一步稀釋血清取清潔稀釋用塑條1條或清潔小試管6支(自備)，于塑條上的6個孔或6個小試管中，用加液器各加入專用稀釋液200微升(根據(jù)實際需要可增減，下同)；然后再以待測血清順次于前5孔(或管)中做對倍稀釋(反復抽吸4次)，棄去最后的200微升稀釋血清，使各孔(或管)中200微升被檢血清的稀釋度為1/8，1/16，1/32，1/64和1/128。最后1孔(或管)為無血清對照。3、用裝上1支200微升吸頭的玻璃套管，于1塊清潔的96(V形)孔板中，先加l滴(約25微升)專用稀釋液于對照排孔，然后按低稀釋度到高稀釋度的順序，再分別加1滴于相應稀釋血清排孔。4、分別將裝有1支200微升吸頭的染色抗原瓶(7種)搖勻并倒置，滴加1滴染色抗原。最后在板上加一塊玻璃蓋并置于36士rC處，第二天(16-24小時)取出觀察結果。判斷結果的標準是(++以上為陽性)++++:藍色菌細胞凝集塊鋪于孔底，邊緣清晰；+++:藍色菌細胞凝集塊鋪于孔底，邊緣不清晰；++:部分菌細胞凝集，邊緣不清晰；+:少數(shù)細菌凝集，中心未凝集的細菌堆聚形成藍色較深的小點-全部未凝集，中心呈藍色小點。以上是對本發(fā)明較佳實施例的描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制；凡依前述說明，本領域技術人員可得之等效技術方案，皆屬于本發(fā)明的保護范圍。權利要求1、一種軍團菌培養(yǎng)基，其特征在于主要成分包含有酵母、ACES、瓊脂、可溶性焦磷酸鐵、酮戊二酸、阿拉伯樹膠、活性炭、碳黑、KOH、L-半胱氨酸、萬古霉素、多黏菌素B、放線菌酮。2、根據(jù)權利要求1所述的軍團菌培養(yǎng)基，其特征在于各成分的含量比為:酵母10克、ACES10克、瓊脂15克、可溶性焦磷酸鐵0.25克、酮戊二酸1克、阿拉伯樹膠3克、活性炭1.5克、碳黑2克、K0H2.8克、L-半胱氨酸0.4克、萬古霉素l毫升、多黏菌素B8萬單位、放線菌酮80毫克。3、一種權利要求1所述的軍團菌培養(yǎng)基的配制方法，其特征在于按如下方法進行配制先將酵母粉10克、ACES10克、瓊脂粉15克、可溶性焦磷酸鐵0.25克、酮戊二酸l克、阿拉伯樹膠3克、活性炭1.5克、碳黑2克、K0H2.8克和去離子水1000毫升充分混勻后并標定pH為6.9;然后高壓121'C，取出冷卻到約5(TC;加入經(jīng)0.22u濾膜過濾的含L-半胱氨酸0.4克、萬古霉素1毫克、多黏菌素B8萬單位、放線菌酮80毫克的5毫升液體；再次充分混勻后傾倒平板即可。4、一種利用權利要求1所述的軍團菌培養(yǎng)基培養(yǎng)制成的軍團菌試劑盒的使用方法，其特征在于按如下步驟進行A、準備待測血清采集被檢者的血液1-2毫升；分離血清后，取血清200微升加入1支清潔小試管中，再加入專用稀釋液600微升混勻使成為1/4稀釋的待測血清；B、進一步稀釋血清取清潔稀釋用塑條1條或清潔小試管6支，于塑條上的6個孔或6個小試管中，用加液器各加入專用稀釋液200微升；然后再以待測血清順次于前5孔或管中做對倍稀釋，棄去最后的200微升稀釋血清，使各孔或管中200微升被檢血清的稀釋度為1/8，1/16，1/32，1/64和1/128;最后l孔(或管)為無血清對照；C、用裝上1支200微升吸頭的玻璃套管，于1塊清潔的96(V形)孔板中，先加l滴(約25微升)專用稀釋液于對照排各孔，然后按低稀釋度到高稀釋度的順序，再分別加1滴于相應稀釋血清排各孔；D、分別將裝有1支200微升吸頭的染色抗原瓶(7種)搖勻并倒置，于各孔中滴加l滴染色抗原；最后在板上加一塊玻璃蓋并置于36士rC處，第二天取出觀察結果。5、根據(jù)權利要求4所述的使用方法，其特征在于如準備待測血清步驟中使用3倍稀釋液時，可取1份稀釋液加2份滅菌蒸餾水或去離子水并混勻。全文摘要本發(fā)明涉及軍團菌檢測
技術領域：
，尤其是一種軍團菌培養(yǎng)基及其配制方法、利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)制成的軍團菌試劑盒的使用方法。本發(fā)明的軍團菌培養(yǎng)基是在GVPC瓊脂的原配方中加入阿拉伯樹膠和碳黑，形成新的質優(yōu)價廉的軍團菌培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法簡單、使用方便、產(chǎn)品成本低廉；可以廣泛使用于軍團菌的檢驗等方面。文檔編號C12Q1/04GK101100650SQ20071002858公開日2008年1月9日申請日期2007年6月15日優(yōu)先權日2007年6月15日發(fā)明者陳長怡申請人:上?？片敿挝⑸锛夹g有限公司