專利名稱：：一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法。
背景技術(shù)：
：甘蔗是高生物量的作物之一，主要化學(xué)成分是單糖和雙糖。也是光合效率最高的C4作物。目前我國甘蔗多用于制糖，由于利用甘蔗生產(chǎn)酒精不存在淀粉質(zhì)原料液化、糖化等高耗能工藝，生產(chǎn)操作簡(jiǎn)單，優(yōu)勢(shì)明顯。發(fā)展甘蔗能源酒精是解決我國能源短缺、環(huán)境污染、三農(nóng)問題的一個(gè)重要舉措。為使甘蔗發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精過程更具競(jìng)爭(zhēng)力，尋找低成本、高效率的甘蔗直接發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精的工藝與技術(shù)非常必要。細(xì)胞固定化技術(shù)是六七十年代發(fā)展起來的。它是將微生物細(xì)胞固定在載體上，而維持其生物催化功能不變。固定化細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)有許多突出的優(yōu)點(diǎn)，由于它大大增加了細(xì)胞濃度，縮短了發(fā)酵周期，提高了發(fā)酵效率，而且由于細(xì)胞被固定，減少了細(xì)胞流失，增大了菌體對(duì)外部條件如溫度和酸堿度的抵抗能力，細(xì)胞可長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用，這為發(fā)酵的連續(xù)化和規(guī)?；峁┝朔奖?。固定化微生物細(xì)胞可以進(jìn)行高密度增殖培養(yǎng)，提高反應(yīng)器單位體積的生物轉(zhuǎn)化速率，延長(zhǎng)發(fā)酵細(xì)胞的壽命，增加穩(wěn)定性，有利于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，有利于產(chǎn)物分離等。日前固定化細(xì)胞己經(jīng)在工業(yè)、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)等方面得到廣泛的應(yīng)用。酵母細(xì)胞的固定化技術(shù)是生產(chǎn)乙醇的一種高新技術(shù)。要將固定化技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，首先要解決固定化載體在生產(chǎn)中的軟化、破裂、上浮、酵母結(jié)團(tuán)，染菌、成本和使用時(shí)間等一系列問題，目前酒精酵母細(xì)胞固定化大部分采用海藻酸鈉、聚乙烯醇(PVA)等包埋法，但存在成本較高、機(jī)械強(qiáng)度低、固定化過程較繁瑣，載體軟化現(xiàn)象等缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述現(xiàn)有固定化酵母技術(shù)生產(chǎn)酒精過程中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)酒精的方法，減少生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化操作程序。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法，包括如下步驟(1)酵母種子液的制備酵母菌種經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)成酵母懸浮液；(2)固定化載體的制備及預(yù)處理甘蔗莖經(jīng)過清洗并去皮后，切成甘庶莖塊，凍融處理后滅菌；(3)甘蔗莖塊固定化酵母的制備將步驟(2)得到的滅菌后的甘蔗莖塊浸泡于步驟(1)所得酵母懸浮液中，培養(yǎng)1624h得到甘蔗莖塊固定化酵母；(4)將甘蔗經(jīng)壓榨或浸提得到總糖分為13%18%(w/w)的甘蔗混合汁，將甘蔗混合汁調(diào)酸處理，并添加營養(yǎng)物氮源和磷源；(5)在發(fā)酵容器中加入步驟(3)得到的甘蔗莖塊固定化酵母和步驟(4)得到的甘蔗混合汁，304(TC條件下發(fā)酵。為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟(1)中，所述酵母菌種為釀酒酵母(&cc/wra附^c^ce/^v/w^),酵母接種量為12環(huán)，培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基(成份是葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨2%);培養(yǎng)條件為283(TC，80180r/min搖床培養(yǎng)12h16h。步驟(2)中，所述甘蔗莖塊截面可以是圓形或方形等；所述甘蔗莖塊長(zhǎng)度為0.52cm，當(dāng)長(zhǎng)度為0.5lcm時(shí)，直接可用作固定化載體材料；當(dāng)長(zhǎng)度在12cm時(shí)，甘蔗莖塊中心部分挖空，空心部分直徑范圍為0.5lcm。步驟(2)中，所述凍融處理是置于一2(TC低溫條件下冷凍過夜，然后解凍。步驟(2)中，所述滅菌處理可以高溫滅菌(115°C，20min)或調(diào)酸處理滅菌(pH3.63.8，浸泡過夜)。步驟(3)中，所述培養(yǎng)條件為2830°C，80180r/min搖床培養(yǎng)1224h。步驟(4)中，所述調(diào)酸處理為通過加入硫酸調(diào)節(jié)甘蔗混合汁pH3.63.8。所述氮源選自尿素或硫酸銨或液氨，所述磷源選自磷酸或磷酸二氫鉀。所述添加營養(yǎng)物氮源和磷源使發(fā)酵培養(yǎng)基即甘蔗混合汁中氮源含量為35g/L、磷源含量為13g/L。步驟(5)中，所述甘蔗莖塊固定化酵母與甘蔗混合汁的比例為3040%(w/v，g/mL)c本發(fā)明利用甘蔗莖塊中天然的細(xì)胞纖維間隙和纖維素自身對(duì)酵母的吸附作用，有利于酵母吸附并在其內(nèi)部生長(zhǎng)的特點(diǎn)制備固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精。去皮后的甘蔗主要由纖維維管束和薄壁細(xì)胞組成，薄壁細(xì)胞分布于纖維維管束之間，排列疏松，有明顯的細(xì)胞間隙，而維管束是由纖維細(xì)胞組成的維管束鞘和包圍在其中的木質(zhì)部和韌皮部組成。木質(zhì)部在分化成熟過程中有些導(dǎo)管被壓破，而與周圍的薄壁細(xì)胞分離而形成空腔，加上凍融處理時(shí)，冷凍過程中的固液界面推進(jìn)時(shí)產(chǎn)生推擠、穿刺、破碎撕裂、包陷等作用，從而使甘蔗內(nèi)部具有很大的內(nèi)表面積；甘蔗含有的蔗糖本身能為酵母的繁殖提供碳源，蔗糖被利用后也會(huì)形成空腔，有利于吸附酵母在其內(nèi)部生長(zhǎng)繁殖。故利用甘蔗莖塊制備固定化酵母，兼有包埋法和吸附法的特點(diǎn)。本發(fā)明采用以甘蔗為原料固定化酵母生產(chǎn)酒精，酒精生產(chǎn)的工藝流程不改變。且就地取材，甘蔗一材兩用，環(huán)保經(jīng)濟(jì)，發(fā)酵效率高。整個(gè)甘蔗搾季都不需要換種，節(jié)省了經(jīng)常性的酵母種子液培養(yǎng)部分的水電汽等各項(xiàng)消耗，并避免了由于換種引起的雜菌感染和周期性不正常情況。采用本發(fā)明技術(shù)后，能縮短酵母對(duì)發(fā)酵環(huán)境的適應(yīng)期，縮短發(fā)酵周期，酵母繁殖耗糖量減少，設(shè)備的利用率提高，因此在不增加人員及設(shè)備的情況下，不僅可以提高酒精產(chǎn)量，而且可以提高發(fā)酵的生產(chǎn)能力，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果1、所用甘蔗來源廣，價(jià)格低廉；2、以甘蔗莖塊固定化酵母發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)酒精，甘蔗一材兩用，環(huán)保經(jīng)濟(jì)，發(fā)酵效率高；3、固定化載體使用天然植物原料，屬于可再生、環(huán)保型固定化載體；4、固定化過程兼有包埋法和吸附法的特點(diǎn)；5、固定化載體機(jī)械強(qiáng)度高，耐浸泡；6、固定化過程十分簡(jiǎn)單，操作方便；7、發(fā)酵結(jié)束后，固定化載體以及發(fā)酵液殘?jiān)缓瑔渭?xì)胞蛋白，可經(jīng)簡(jiǎn)單處理用作動(dòng)物飼料，變廢為寶。圖1為圓形截面固定化載體外觀圖。圖2為中空狀固定化載體外形圖。圖3為正方形固定化載體外形圖。圖4為長(zhǎng)方形固定化載體外觀圖。圖5為甘蔗莖塊橫截面電子顯微鏡照片。圖6為甘蔗莖塊固定化酵母后縱截面電子顯微鏡照片。圖7為甘蔗莖塊固定化酵母后橫截面電子顯微鏡照片。圖8為本發(fā)明的工藝流程圖。圖9為甘蔗汁固定化分批發(fā)酵過程固定化酵母細(xì)胞數(shù)和游離酵母細(xì)胞數(shù)的變化。圖IO為甘蔗汁固定化分批發(fā)酵過程中C02產(chǎn)生速率的變化。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1采用的菌種釀酒酵母(Sacc/wramycMcereWw'ae)，間歇發(fā)酵過程如圖8所示，以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法-(1)酵母種子液的制備用接種環(huán)試管轉(zhuǎn)接2環(huán)斜面保存的酵母菌種(釀酒酵母(&cc/^ra/^cescerev/^w))到裝有150mLYPD液體培養(yǎng)基(按重量百分比計(jì)，葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨2%)的三角瓶中，擴(kuò)大培養(yǎng)成酵母懸浮液；培養(yǎng)條件為283(TC，100r/min搖床培養(yǎng)12h。(2)固定化載體甘蔗莖塊的制備及預(yù)處理新鮮的成熟的甘蔗莖經(jīng)過清洗并去皮后，切成長(zhǎng)度為0.5cm的甘蔗莖塊，甘蔗莖塊截面是圓形的(如圖l)，凍融處理(置于一20'C低溫條件下冷凍過夜，然后解凍)后滅菌(高溫滅菌(U5。C，20min))。(3)甘蔗莖塊固定化酵母的制備將步驟(2)得到的甘蔗莖塊浸泡于步驟(1)所得酵母懸浮液中，在酵母種子罐中2830°C，100r/min搖床培養(yǎng)20h，培養(yǎng)得到甘蔗莖塊固定化酵母。圖5為甘蔗莖塊橫截面電子顯微鏡照片，表明甘蔗內(nèi)部具有很大的空腔結(jié)構(gòu)和內(nèi)表面積，有利于吸附酵母在其內(nèi)部生長(zhǎng)繁殖，故利用甘蔗莖塊制備固定化酵母，兼有包埋法和吸附法的特點(diǎn)。圖6為甘蔗莖塊固定化酵母后縱截面電子顯微鏡照片，表明甘蔗的纖維維管束和導(dǎo)管內(nèi)部成功吸附并固定大量的酵母細(xì)胞。圖7為甘蔗莖塊固定化酵母后橫截面電子顯微鏡照片，表明甘蔗的薄壁細(xì)胞中也成功的吸附并固定大量的酵母細(xì)胞。(4)甘蔗經(jīng)壓搾后得到總糖分17.6%(w/w)的甘蔗混合汁，取150ml甘蔗混合汁置于300ml三角瓶中，用硫酸調(diào)酸處理甘蔗混合汁至pH值為3.6，加入0.5g尿素和0.3g磷酸二氫鉀，使氮源含量為3.3g/L、磷源含量為2g/L。(5)然后在上述300ml三角瓶中加入甘蔗莖塊固定化酵母60g，30°C條件下發(fā)酵42h。發(fā)酵結(jié)束后，倒去成熟發(fā)酵醪，用上述pH值為3.6的甘蔗混合汁洗滌兩次后，再加入pH值為3.6的150ml甘蔗混合汁，進(jìn)行發(fā)酵。按此方法，反復(fù)發(fā)酵6批次(表l)。如圖9為甘蔗莖塊內(nèi)部的增殖酵母數(shù)逐步上升，到第3批以后基木保持一穩(wěn)定數(shù)目，約為12xl()H個(gè)/g，當(dāng)酵母在蔗塊內(nèi)部增殖時(shí)，發(fā)酵液中漏出菌數(shù)隨著整個(gè)裝置運(yùn)行穩(wěn)定，漏出菌數(shù)也隨之減少，最終達(dá)到24xl(f個(gè)/mL。在整個(gè)發(fā)酵過程中，固定化酵母的代謝能力沒有明顯損失，發(fā)酵速率穩(wěn)定，如圖10。甘蔗莖塊的外觀和強(qiáng)度也沒有明顯變化。發(fā)酵成熟醪酒精濃度為11.5611.8%(20°C，V/V)，相當(dāng)于88.0591.8g/L，殘?zhí)堑暮?.3。/。1.4g/L，發(fā)酵周期3240h，比游離細(xì)胞明顯縮短，與以海藻酸鈉或聚乙烯醇(PVA)做固定化材料的發(fā)酵效果相差不多。表1甘蔗汁固定化分批發(fā)酵結(jié)果(30°C)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例2采用的菌種釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，間歇發(fā)酵過程(1)酵母種子液的制備用接種環(huán)試管轉(zhuǎn)接2環(huán)斜面保存的酵母種到裝有10mLYPD液體培養(yǎng)基(按重量百分比計(jì)，葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨2%)的三角瓶中，擴(kuò)大培養(yǎng)成酵母懸浮液，培養(yǎng)條件為2830°C，80r/min搖床培養(yǎng)12h。(2)固定化載體甘蔗莖塊的制備及預(yù)處理甘蔗莖經(jīng)過清洗并去皮后，切成長(zhǎng)度為2cm的甘蔗莖塊，甘蔗莖塊截面是圓形的，甘蔗莖塊中心部分挖空,空心部分直徑范圍為0.5cm(如圖2)。凍融處理(置于一20'C低溫條件下冷凍過夜，然后解凍)后滅菌(高溫滅菌(115°C，20min))。(3)甘蔗莖塊固定化酵母的制備將步驟(2)得到的甘蔗莖塊浸泡于步驟(1)所得酵母懸浮液中，在2830'C，80r/min搖床培養(yǎng)24h，培養(yǎng)得到固定化酵母甘蔗莖塊，載體酵母數(shù)6.3xl(^個(gè)/g。(4)甘蔗經(jīng)壓榨后得到總糖分17.6%(w/w)的甘蔗混合汁，取150ml甘蔗混合汁置于300ml三角瓶中，用硫酸調(diào)酸處理甘蔗混合汁至pH值為3.6，加入0.4g硫酸銨和0.2g磷酸，使氮源含量為2.6g/L、磷源含量為1.3g/L。(5)然后在上述300ml三角瓶中加入甘蔗莖塊固定化酵母60g，30。C條件下發(fā)酵34h。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液酒精濃度為11.6%(20°C，V/V)，殘?zhí)莑.2g/L。實(shí)施例3采用的菌種釀酒酵母(&cc/^ram;;cMc^v^/e)，間歇發(fā)酵過程(1)酵母種子液的制備用接種環(huán)試管轉(zhuǎn)接2環(huán)斜面保存的酵母種到裝有150mLYPD液體培養(yǎng)基(按重量百分比計(jì)，葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨2%)的三角瓶中，擴(kuò)大培養(yǎng)成酵母懸浮液。培養(yǎng)條件為2830°C，180r/min搖床培養(yǎng)12h。(2)固定化載體甘蔗莖塊的制備及預(yù)處理甘蔗莖經(jīng)過清洗并去皮后，切成長(zhǎng)度為lcm的正方形甘蔗莖塊(如圖3)，凍融處理(置于一20。C低溫條件下冷凍過夜，然后解凍)后滅菌(高溫滅菌(U5'C，20min))。(3)甘蔗莖塊固定化酵母的制備將步驟(2)得到的甘蔗莖塊浸泡于步驟(1)所得酵母懸浮液中，在283(TC，180r/min搖床培養(yǎng)16h，培養(yǎng)得到固定化酵母甘蔗莖塊，載體酵母數(shù)4.6xl(T個(gè)/g。(4)甘蔗經(jīng)浸提后得到總糖分17.4%(w/w)的甘蔗混合汁，取150ml甘蔗混合汁置于300ml三角瓶中，用硫酸酸化處理甘蔗混合汁至pH值為3.6，加入0.3g尿素和0.3g磷酸二氫鉀，氮源含量為2g/L、磷源含量為2g/L。(5)然后在上述300ml三角瓶中加入甘蔗莖塊固定化酵母60g，30°。條件下發(fā)酵32h。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液酒精濃度為11.3。/。(2(TC，V/V)，殘?zhí)?.4g/L。實(shí)施例4采用的菌種釀酒酵母(5^cc/wraw^^cerev/wae),連續(xù)發(fā)酵過禾呈(1)酵母種子液的制備用接種環(huán)試管轉(zhuǎn)接1環(huán)斜面保存的酵母種到裝有150mLYPD液體培養(yǎng)基(按重量百分比計(jì)，葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨2%)的三角瓶中，擴(kuò)大培養(yǎng)成酵母懸浮液。培養(yǎng)條件為283(TC，80180r/min搖床培養(yǎng)12h。(2)稀蔗汁液的準(zhǔn)備，甘蔗經(jīng)壓榨后得到含糖17.6%(w/w)的甘蔗混合汁，用硫酸酸化處理甘蔗混合汁至pH值為3.6，加入單獨(dú)加熱滅菌的尿素和磷酸，使培養(yǎng)基氮源和磷源含量分別為5g/L和3g/L。加入水使其稀釋到糖含量4%(w/w)。(3)固定化載體甘蔗莖塊的制備及預(yù)處理甘蔗莖經(jīng)過清洗并去皮后，切成長(zhǎng)度為1cm的長(zhǎng)方形甘蔗莖塊(如圖4)，凍融處理(置于一2(TC低溫條件下冷凍過夜，然后解凍)后滅菌(酸化處理滅菌(pH3.63.8，浸泡過夜))；(4)甘蔗莖塊固定化酵母的制備將步驟(3)得到的甘蔗莖塊1500g與步驟(2)所得稀蔗汁液3000mL—起倒入5L發(fā)酵容器，將步驟(1)的酵母懸浮液按10%的接種量接種至上述混合液中，在283(TC，100r/min，培養(yǎng)24h得到甘蔗莖塊固定化酵母。(5)移去培養(yǎng)液后，再加入pH值為3,6的新鮮甘蔗混合汁(總糖分17.6%(w/w))2500mL，發(fā)酵12h后，以0.6L/小時(shí)的流加速率流加pH值為3.6的新鮮甘蔗混合汁(總糖分17.6%(w/w))。按此方法，連續(xù)發(fā)酵l0天，整個(gè)裝置運(yùn)行穩(wěn)定，發(fā)酵成熟醪平均酒精濃度為11.2%(20°C，V/V)，殘?zhí)堑暮?.8g/L。發(fā)酵醪液中酵母數(shù)約8xi07個(gè)/m1。對(duì)比實(shí)施例1固定化載體甘蔗莖塊大小對(duì)酒精產(chǎn)率的影響(表2)分別選擇長(zhǎng)度為1cm和2cm的甘蔗莖塊，按照本發(fā)明方法制備甘蔗莖塊固定化酵母，取30g固定化酵母加入100ml葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，其中葡萄糖100g/L，酵母抽提物20g/L，蛋白胨10g/L，進(jìn)行間歇發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果如表l所示在填充率一樣的情況下，甘蔗莖塊體積小，其總表面積就大，相同發(fā)酵時(shí)間所產(chǎn)生的酒精也多，特別是發(fā)酵時(shí)間短時(shí)，差別更加明顯。但是如果發(fā)酵時(shí)間超過20h以上，甘蔗莖塊的大小對(duì)酒精產(chǎn)率的影響變小?？傊?，較小的甘蔗莖塊的酒精產(chǎn)率增加10%左右，因?yàn)樵诟收崆o塊內(nèi)部，酵母集中在靠外表面的一側(cè)，那里容易吸收基質(zhì)的營養(yǎng)，也有利于酒精等代謝產(chǎn)物的迅速擴(kuò)散，小甘蔗莖塊的總表面積比大甘蔗莖塊增加40%以上，而且在大的甘蔗莖塊中心部分酵母的密度很低，形成所謂死亡區(qū)域，這是小蔗塊發(fā)酵酒精產(chǎn)率較高的原因。如果將長(zhǎng)度為2cm的甘蔗莖塊中心部分挖去一直徑為lcm的圓形部分，則可以大大增加甘蔗塊的表面積，進(jìn)而改善固定化效果。發(fā)酵結(jié)果顯示，該方法有利于提高發(fā)酵的速率。表2固定化酵母蔗塊大小對(duì)酒精產(chǎn)率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>對(duì)比實(shí)施例2甘蔗塊凍融預(yù)處理對(duì)固定化效果及發(fā)酵結(jié)果的影響(表3)甘蔗莖經(jīng)過清洗并去皮后，切成長(zhǎng)度為1cm的方形，分成相等的兩份，其中一份置于一2(TC低溫條件下冷凍過夜，然后解凍，凍融處理后滅菌；另一份直接進(jìn)行滅菌處理。然后按酵母固定化培養(yǎng)步驟進(jìn)行酵母菌的固定。甘蔗經(jīng)壓榨后得到含糖16.8n/。(w/w)的甘蔗混合汁，取150ml甘蔗混合汁置于300ml三角瓶中，用硫酸酸化處理甘蔗混合汁至pH值為3.6，加入0.5m1液氨和0.3g磷酸二氫鉀，接入30%(w/w)的甘蔗莖塊固定化酵母，30"條件下進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，倒去成熟發(fā)酵醪，用下批次發(fā)酵原液洗滌兩次后，再加入lOOml經(jīng)過滅菌的甘蔗汁進(jìn)行發(fā)酵。經(jīng)過凍融處理后，固定化效果更好，甘蔗塊內(nèi)部酵母數(shù)目提高10%左右，發(fā)酵速率明顯加快，發(fā)酵周期縮短46h。發(fā)酵液酒精含量11.12。/。(20。C，V/V)。表3甘蔗塊凍融預(yù)處理對(duì)固定化效果及發(fā)酵結(jié)果的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>對(duì)比實(shí)施例3海藻酸鈉固定化酵母制備過程及其間歇發(fā)酵蔗汁生產(chǎn)酒精甘蔗經(jīng)壓榨后得到總糖分17.2%(w/w)的甘蔗混合汁，取100ml分別置于300ml錐角瓶中。115。C滅菌20分鐘，冷卻到35。C，加入單獨(dú)加熱滅菌的氮源(尿素、硫酸銨或液氨)和磷源(磷酸或磷酸二氫鉀)，其中液氨不經(jīng)加熱，使培養(yǎng)基氮源和磷源含量分別為5g/L和3g/L。然后稱取1.6g海藻酸鈉于無菌的小燒杯中，加無菌去離子水少許，調(diào)成糊狀，再加入其余的水(總量為40ml)。火上加溫至熔化，冷卻至45。C左右，加入10ml酵母培養(yǎng)液，混合均勻，倒入一個(gè)無菌的小塑料瓶中或注射器外套并與針頭相連，通過1.52.0mm的小孔，以恒定的速度滴到盛有10%CaCl2(w/w)溶液的平皿中制成凝膠珠。浸泡30min后，將凝膠珠轉(zhuǎn)入300ml形瓶中，用無菌去離子水洗滌三次，固定化細(xì)胞數(shù)約為1.5,9個(gè)/1111。后轉(zhuǎn)入100ml甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30'C培養(yǎng)。發(fā)酵周期為36h。發(fā)酵結(jié)束酒精含量為11.34%(20°C，V/V)。殘?zhí)堑暮?g/L。對(duì)比實(shí)施例4游離酵母細(xì)胞蔗汁間歇發(fā)酵生產(chǎn)乙醇采用的菌種酉良酒酵母(Sacc/wrawyc^cwev/w'ae),間歇發(fā)酵過程甘蔗經(jīng)壓榨后得到總糖分17.6%(w/w)的甘蔗混合汁，取IOOml分別置于300ml三角瓶中。115。C滅菌20分鐘，冷卻到35。C，加入單獨(dú)加熱滅菌的氮源(尿素、硫酸銨、液氨)和磷源(磷酸和磷酸二氫鉀)，其中液氨不經(jīng)加熱，使培養(yǎng)基氮源和磷源含量分別為5g/L和3g/L,接入IO%(V/V)酵母懸浮液，3(KC條件下進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵周期64h，發(fā)酵醪液酵母?jìng)€(gè)數(shù)12xl08個(gè)/mL,發(fā)酵成熟醪酒精產(chǎn)量11.6。/。(2(TC，V/V)。殘?zhí)堑暮縐g/L。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法，其特征在于包括如下步驟(1)酵母菌種經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)成酵母懸浮液；(2)甘蔗莖經(jīng)過清洗并去皮后，切成甘蔗莖塊，凍融處理后滅菌；(3)將步驟(2)得到的滅菌后的甘蔗莖塊浸泡于步驟(1)所得酵母懸浮液中，培養(yǎng)16～24h得到甘蔗莖塊固定化酵母；(4)將甘蔗經(jīng)壓榨或浸提得到總糖分為13％～18％的甘蔗混合汁，將甘蔗混合汁調(diào)酸處理，并添加營養(yǎng)物氮源和磷源；(5)在發(fā)酵容器中加入步驟(3)得到的甘蔗莖塊固定化酵母和步驟(4)得到的甘蔗混合汁，30～40℃條件下發(fā)酵。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法，其特征在于步驟(1)中，所述酵母菌種為釀酒酵母，酵母接種量為12環(huán)，培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為283(TC，80180r/min搖床培養(yǎng)12h16h。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法，其特征在于步驟(2)中，所述甘蔗莖塊截面是圓形或方形。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法，其特征在于.*步驟(2)中，所述甘蔗莖塊長(zhǎng)度為0.52cm，當(dāng)長(zhǎng)度在12cm時(shí)，甘蔗莖塊中心部分挖空，空心部分直徑范圍為0.5lcm。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法，其特征在于步驟(2)中，所述凍融處理是置于一2(TC低溫條件下冷凍過夜，然后解凍。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法，其特征在于步驟(2)中，所述滅菌處理為高溫滅菌或調(diào)酸處理滅菌。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法，其特征在于步驟(3)中，所述培養(yǎng)條件為2830'C，80180r/min搖床培養(yǎng)1224h。8.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法，其特征在于步驟(4)中，所述調(diào)酸處理為加入硫酸調(diào)節(jié)甘蔗混合汁pH3.63.8。9、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法，其特征在于步驟(4)中，所述氮源選自尿素或硫酸銨或液氨，所述磷源選自磷酸或磷酸二氫鉀；所述添加營養(yǎng)物氮源和磷源使甘蔗混合汁中氮源含量為35g/L、磷源含量為13g/L。10、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法，其特征在于步驟(5)中，所述甘蔗莖塊固定化酵母與甘蔗混合汁的比例為3040%。全文摘要本發(fā)明公開了一種以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法。該方法包括如下步驟酵母種子液的制備；固定化載體的制備及預(yù)處理；固定化酵母的制備；固定化酵母加入甘蔗混合汁中進(jìn)行發(fā)酵。采用本發(fā)明的以甘蔗為原料固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的方法，發(fā)酵效率高、環(huán)保經(jīng)濟(jì)；固定化載體兼有包埋法和吸附法的特點(diǎn)，具有成本低廉，細(xì)胞吸附量大，機(jī)械強(qiáng)度高，耐浸泡，固定化過程十分簡(jiǎn)單，操作方便、廢棄后可綜合利用等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明應(yīng)用于工廠大規(guī)模生產(chǎn)將具有重大的社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。文檔編號(hào)C12P7/06GK101225407SQ200710032548公開日2008年7月23日申請(qǐng)日期2007年12月14日優(yōu)先權(quán)日2007年12月14日發(fā)明者麗張,張遠(yuǎn)平,朱明軍,磊梁,梁世中,梁達(dá)奉,亭郭,黃玉南申請(qǐng)人:華南理工大學(xué);廣州甘蔗糖業(yè)研究所