專利名稱：一種從土豆中快速提純酪氨酸酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物中提純酪氨酸酶的方法，特別是涉及一種從土豆中快速提純酪氨酸酶 的方法。
背景技術(shù)：
酪氨酸酶(TYR)是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于動植物和微生物細胞內(nèi)，在 哺乳動物體內(nèi)，它可作為一種雙重功能的生物催化劑，具有加氧酶和脫氫酶兩種活性，既 能催化單酚類化合物選擇性的羥基化生成鄰苯二酚，又能氧化鄰苯二酚脫氫生成鄰苯醌， 而在微生物體內(nèi)，它可微降解酚類物質(zhì)，因而在醫(yī)藥、環(huán)境、食品、精細化工等領(lǐng)域具有 較廣的應(yīng)用。
但酪氨酸酶在生物體內(nèi)含量低，價格高，并且酶活也受到溫度、pH值等條件的限制。 因此，酶來源問題成了首要解決問題，以便大幅降低酶的價格。另外，由于不同來源的酪 氨酸酶的酶學(xué)性質(zhì)和功能存在差異，因而需要不斷尋找不同來源的酪氨酸酶，并對其酶學(xué) 性質(zhì)和功能進行摸索和開創(chuàng)性的研究。
目前，提取的酪氨酸酶主要來源于蘑菇和菌類，并經(jīng)過粗提和柱層析對其進行純化。 其中，粗提是指將酪氨酸酶粉碎勻漿后進行鹽析得到TYR粗酶。將得到的TYR粗酶進行多 次柱層析，便可得到精提的TYR。但該方法成本較高、過程繁瑣、耗時較長、重復(fù)性不高， 容易導(dǎo)致TYR的失活和較大的實驗誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)快速提純土豆TYR的方 法，該方法快速、簡便、廉價，而且所提的酪氨酸酶活性較好。
本發(fā)明的一種從土豆中快速提純酪氨酸酶的方法，包括如下步驟
(1) 土豆浸泡在0.005M 0.4M乙酸鈉緩沖液(pH 5.0-6.0)中高速勻漿l 5min，過 濾，加入30% 80%硫酸銨溶液進行鹽析，再用乙酸鈉緩沖液溶解沉淀，0.005M 0.04M 的Tris-HCl緩沖溶液(pH6.5 7.5)透析得TYR粗酶液；
(2) 利用FPLC的分子篩凝膠柱層析，分子篩凝膠柱Sephodex G75，洗脫液0.005M~ 0.05M的Tris-HCl緩沖溶液(pH6.0 7.5),平衡.* 2個柱床，洗脫1 2個柱床，流速0.25 0.75ml/min，進行提純；
(3) 和/或利用FPLC的HiTrap Q FF離子交換柱層析，用洗脫液A為0.001M 0.01M 的Tris-HCl緩沖溶液(pH 6.0 7.5)，洗脫液B為0.001M 0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(pH 6.5 7.5) +1M 2M的NaCl，平衡為10 25個柱床，沖洗為2 5個柱床，洗脫梯度為洗 脫液B在5 10個柱床內(nèi)保持3% 7%,然后在5個柱床內(nèi)保持10% 15%，然后在5 10個柱床內(nèi)保持20% 25%,然后在5 10個柱床內(nèi)保持40% 50%，流速為0.75 lml/min,進行提純；
(4) 將陰離子層析和分子篩凝膠層析得到的收集峰用聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)凝膠電泳和紫外分光光度法酶活表征。
所述的步驟(1)乙酸鈉緩沖液是指0.2mol/LpH5.6的乙酸鈉緩沖液； 所述的步驟(1)高速勻漿是指高速勻漿2min; 所述的步驟(1)硫酸銨溶液是指65%硫酸銨溶液； 所述的步驟(1) Tris-HCl緩沖溶液是指0.02mol/L， pH7.0; 所述的透析是指透析24 40小時；
所述的步驟(2)分子篩凝膠柱層析是是指0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.0)，洗 脫l個柱床，流速0.5ml/min;
所述的步驟(3)中離子交換柱層析是是指洗脫液A為0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.0);洗脫液B為0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.0) +1M的NaCl，平衡為20個柱床， 沖洗為5個柱床，洗脫梯度為洗脫液B在5個柱床內(nèi)保持3%，然后在5個柱床內(nèi)保持10%， 然后在5個柱床內(nèi)保持20%，然后在5個柱床內(nèi)保持40%，流速lml/min。
本發(fā)明的有益效果
(1) 酪氨酸酶來源方便，價格低廉；
(2) 酪氨酸酶粗酶后無需經(jīng)過多次柱層析，操作快速、簡便，而且酪氨酸酶活性保 持較好。


圖l為用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)對土豆TYR粗酶凝膠分子篩層析得到的色譜圖。 圖2為用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)對凝膠分子篩層析得到的收集液陰離子交換層析所 得的色譜圖。圖3為用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)陰離子層析所得的蛋白峰進行SDS-PAGE電泳分 析所得的電泳圖。其中，MW為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，Sample為FPLC陰離子層析所得的蛋 白峰。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
實施例1
1、 土豆TYR粗酶的提取
(1) 將新鮮土豆去皮切碎,放入粉碎機中與0.2mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH 5.6) —起 進行高速勻漿2min，過濾。
(2) 將上述濾液于4"C下8000轉(zhuǎn)/min離心20min，取上清液，向上清液中加入65% 飽和度的硫酸銨溶液進行沉淀，于4'C下過夜。
(3) 將上述沉淀液離心U0000r/min) 20min,留取沉淀物，用少量0.2moI/L的乙酸 鈉緩沖液溶解沉淀。
(4) 用0.02mol/L的Tris-HCl對上述溶解液進行充分透析至無NH/和SO,，離心除 去少量沉淀，可得土豆TYR粗酶液。
2、 FPLC提純土豆TYR:
(1 )分子篩凝膠層析。將上述粗酶液在FPLC系統(tǒng)中層析，條件是分子篩凝膠柱:Sephodex G75;洗脫液0.02M的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.0);平衡2個柱床；洗脫l個柱床； 流速0.5ml/min。得峰譜圖1，其中第二個峰為活力峰。
(2)離子交換層析。將上述粗酶液在FPLC系統(tǒng)中用離子交換柱進行分離，條件是離子 交換柱HiTripQFF lml;洗脫液A: 0.02M的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.0);洗脫液B: 0.02M的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.0) +lM的NaCl;平衡20個柱床；沖洗5個柱床； 洗脫梯度洗脫液B在5個柱床內(nèi)保持3y。，然后在5個柱床內(nèi)保持10%,然后在5個柱 床內(nèi)保持20%，然后在5個柱床內(nèi)保持40%;流速lml/min。陰離子交換層析得到三個 峰，圖2，其中第二個峰為活力峰。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和HPLC酶活表征
(1) SDS-PAGE凝膠電泳將陰離子層析和分子篩凝膠層析得到的收集峰進行電泳表征。 其中分子篩凝膠層析經(jīng)過電泳后得到三條條帶；陰離子交換層析得到一條條帶。條件是
分離膠15%;濃縮膠5%;電流10mA (濃縮膠)、20mA (分離膠)；電泳時間
60min;電泳槽Ready Gel Precast Gel System (Bio-Rad)。電泳結(jié)果表明陰離子交換層析得 到的峰為一種純的酶，圖3。
(2) 紫外分光光度法酶活測定以單位蛋白的TYR催化L-DOPA的氧化的量為一個酶活 單位。L-DOPA的氧化物呈紅色，可利用紫外分光光度法測定。
實施例2
1、 土豆TYR粗酶的提取
(1) 將新鮮土豆去皮切碎,放入粉碎機中與0.2mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH 5.6) —起 進行高速勻漿2min，過濾。
(2) 將上述濾液于4'C下8000轉(zhuǎn)/min離心20min，取上清液，向上清液中加入65% 飽和度的硫酸銨溶液進行沉淀，于4'C下過夜。
(3) 將上述沉淀液離心(10000r/min) 20min，留取沉淀物，用少量0.2mol/L的乙酸 鈉緩沖液溶解沉淀。
(4) 用0.02mol/L的Tris-HCl對上述溶解液進行充分透析至無NH/和SO,，離心除 去少量沉淀，可得土豆TYR粗酶液。
2、 FPLC提純土豆TYR:
分子篩凝膠層析。將上述粗酶液在FPLC系統(tǒng)中層析，條件是分子篩凝膠柱:Sephodex G75;洗脫液0.02M的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.0);平衡2個柱床；洗脫1個柱床；
流速0.5ml/min。得峰譜圖。
聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和紫外分光光度法對TYR進行酶活表征。
實施例3
1、 土豆TYR粗酶的提取
(1) 將新鮮土豆去皮切碎,放入粉碎機中與0.2mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH 5.6) —起 進行高速勻漿2min，過濾。
(2) 將上述濾液于(C下8000轉(zhuǎn)/min離心20min，取上清液，向上清液中加入65%飽和度的硫酸銨溶液進行沉淀，于4'C下過夜。
(3) 將上述沉淀液離心(10000r/min) 20min，留取沉淀物，用少量0.2mol/L的乙酸
鈉緩沖液溶解沉淀。
(4) 用0.02mol/L的Tris-HCl對上述溶解液進行充分透析至無NH/和S042、離心除 去少量沉淀，可得土豆TYR粗酶液。
2、 FPLC提純土豆TYR:
離子交換層析將上述粗酶液在FPLC系統(tǒng)中用離子交換柱進行分離，條件是離子 交換柱HiTripQFFlml;洗脫液A: 0.02M的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.0);洗脫液B: 0.02M的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.0) +1M的NaCl;平衡20個柱床；沖洗5個柱床； 洗脫梯度洗脫液B在5個柱床內(nèi)保持3W，然后在5個柱床內(nèi)保持10%,然后在5個柱 床內(nèi)保持20%，然后在5個柱床內(nèi)保持40%;流速lml/min。陰離子交換層析得到三個 峰。
聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和紫外分光光度法對TYR進行酶活表征。
權(quán)利要求
1. 一種的從土豆中快速提純酪氨酸酶的方法，包括下列步驟(1)土豆浸泡在0. 005M～0.4M乙酸鈉緩沖液(pH5.0-6.0)中高速勻漿1～5min，過濾，加入30％～80％硫酸銨溶液進行鹽析，再用乙酸鈉緩沖液溶解沉淀，0.005M～0.04M的Tris-HCl緩沖溶液(pH6.5～7.5)透析得TYR粗酶液；(2)利用FPLC的分子篩凝膠柱層析，用Sephodex G75分子篩凝膠柱，洗脫液0.005M～0.05M的Tris-HCl緩沖溶液(pH6.0～7.5)，平衡2個柱床，洗脫1～2個柱床，流速0.25～0.75ml/min，進行提純；(3)和/或利用FPLC的HiTrap Q FF離子交換柱層析，用洗脫液A為0.001M～0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(pH6.0～7.5)，洗脫液B為0.001M～0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(pH6.5～7.5)+1M～2M的NaCl，平衡為10～25個柱床，沖洗為2～5個柱床，洗脫梯度為洗脫液B在5～10個柱床內(nèi)保持3％～7％，然后在5個柱床內(nèi)保持10％～15％，然后在5～10個柱床內(nèi)保持20％～25％，然后在5～10個柱床內(nèi)保持40％～50％，流速為0.75～1ml/min，進行提純；(4)將陰離子層析和分子篩凝膠層析得到的收集峰用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳和紫外分光光度法酶活表征。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種的從土豆中快速提純酪氨酸酶的方法，其特征在于步驟(1)乙酸鈉緩沖液是0. 2mol/L pH 5.6的乙酸鈉緩沖液。
3. 如權(quán)利要求l所述的一種從土豆中快速提純酪氨酸酶的方法，其特征在于步驟(1) 高速勻漿是高速勻漿2min。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種從土豆中快速提純酪氨酸酶的方法，其特征在于步驟(1) 硫酸銨溶液是指65%硫酸銨溶液。
5. 如權(quán)利要求l所述的一種從土豆中快速提純酪氨酸酶的方法，其特征在于步驟(1) Tris-HC1緩沖溶液是0. 02mol/L， pH7. 0, Tris-HC1緩沖溶液。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種從土豆中快速提純酪氨酸酶的方法，其特征在于步驟U) 透析是指透析24 40小時。
7. 如權(quán)利要求l所述的一種從土豆中快速提純酪氨酸酶的方法，其特征在于步驟(2) 分子篩凝膠柱層析是指用0. 01M的Tris-HC1緩沖溶液(pH7.0)，洗脫1個柱床，流 速0. 5ml/min。
8.如權(quán)利要求1所述的一種從土豆中快速提純酪氨酸酶的方法，其特征在于步驟(3)中離子交換柱層析是指洗脫液A為0. 01M的Tris-HC1緩沖溶液(pH 7. 0);洗脫液B 為0. 01M的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7. 0) +1M的NaCl,平衡為20個柱床，沖洗為5 個柱床，洗脫梯度為洗脫液B在5個柱床內(nèi)保持3呢，然后在5個柱床內(nèi)保持10%，然 后在5個柱床內(nèi)保持20%，然后在5個柱床內(nèi)保持40%，流速lml/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從土豆中快速提純酪氨酸酶(TYR)的方法，步驟包括(1)對土豆進行粉碎勻漿、鹽析、沉淀溶解和透析提取TYR粗酶；(2)利用FPLC的凝膠分子篩和/或陰離子交換層析提純TYR；(3)用聚丙烯酰胺凝膠電泳和紫外分光光度計酶活測定對TYR進行表征。該方法快速、簡便、廉價，而且純化的TYR活性較高。
文檔編號C12N9/04GK101434939SQ200710041289
公開日2009年5月20日 申請日期2007年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月25日
發(fā)明者周立明, 張玉高, 朱利民, 李樹白, 柴艷倩, 董唯靜 申請人:東華大學(xué);廣東溢達紡織有限公司