專利名稱：：一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因品系特異性時(shí)品系特異性序列的擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域，更具體地說(shuō)涉及一種在轉(zhuǎn)基因品系特異性檢測(cè)過(guò)程中擴(kuò)增基因組品系特異序列的方法。
背景技術(shù)：
：目前，基于DNA分子為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法經(jīng)歷了四個(gè)發(fā)展階段，即(1)針對(duì)啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因的篩選檢測(cè)；(2)目的基因特異性檢測(cè)；(3)基因構(gòu)建特異性檢測(cè)；(4)品系特異性(轉(zhuǎn)化事件)檢測(cè)。由于品系特異性檢測(cè)方法的高度特異性，目前國(guó)際上對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法已逐步過(guò)渡到品系特異性基因片段的檢測(cè)方法。品系特異性(Event-specific)檢測(cè)是通過(guò)分析外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列實(shí)現(xiàn)，由于每一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，并且連接區(qū)序列是單拷貝的，所以品系特異性檢測(cè)方法具有非常高的特異性和準(zhǔn)確性。鑒于上述品系特異性轉(zhuǎn)基因事物檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，品系特異性檢測(cè)已經(jīng)成為目前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)研究的重點(diǎn)，并將為國(guó)際檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室所采用。在轉(zhuǎn)基因品系特異性檢測(cè)中，最重要的是獲得基因組的品系特異性序列。目前獲得基因組的品系特異性序列的技術(shù)有TAIL-PCR、環(huán)狀PCR、YADE法等。TAIL-PCR:TAIL-PCR的基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物(specialprimer，簡(jiǎn)稱spl，sp2，sp3，約20bp)，用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物(Arbitrarydegenerateprime,AD，約14bp)相組合，以基因組DNA為模板.根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán)，通過(guò)分級(jí)反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增特異引物。但是TAIL-PCR仍有很多不盡如人意的地方TAIL-PCR反應(yīng)需要較多的引物組合；此外，由于隨機(jī)簡(jiǎn)并引物存在有限的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)個(gè)別側(cè)翼序列，即使使用不同的簡(jiǎn)并引物也難以擴(kuò)增到陽(yáng)性結(jié)果，整個(gè)反應(yīng)需要一系列連續(xù)反應(yīng)，條件設(shè)置要求精細(xì)；還要求引物和模板有較高的純度，如果有降解或純度不夠，也很難擴(kuò)增出特異性條帶；此外，TA1L-PCR還很有可能擴(kuò)增的是高度重復(fù)序列，因而無(wú)法步行利用接頭的PCR克隆品系特異性序列。環(huán)狀PCR:環(huán)狀PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。這兩種PCR都是根據(jù)一端已知序列設(shè)計(jì)的嵌套式引物進(jìn)行PCR。I-PCR是1988年由Triglia最早提出的一種基于PCR的改進(jìn)的染色體步行方法。I-PCR的實(shí)驗(yàn)程序包括基因組DNA經(jīng)酶切后用T4DNA連接酶進(jìn)行自連接，產(chǎn)生環(huán)狀DNA片段；以環(huán)化產(chǎn)物為底物，用根據(jù)己知片段設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到含有未知片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。P-PCR是由Jones等提出的利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀單鏈模板，有效增強(qiáng)了引物與模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)需要3個(gè)根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的引物，3個(gè)引物在已知序列內(nèi)呈線性排列，其中第3個(gè)引物可作為接頭使用，可與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成鍋柄狀單鏈模板。其過(guò)程為，首先酶切基因組DNA，產(chǎn)生5'或3'粘末端，然后連接上合適的接頭(primer3)，連接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接頭，由于連接上的接頭與己知序列是反向重復(fù)序列，變性后的DNA單鏈可退火形成鍋柄狀單鏈模板，之后分別用3個(gè)單引物進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增，能有效地?cái)U(kuò)增29kbp的大片段未知序列。然而由于直接克隆己知序列外的未知DNA區(qū)域依賴于DNA的環(huán)化性，而環(huán)化連接過(guò)程中常常產(chǎn)生多聯(lián)體，成為副產(chǎn)物甚至是主要產(chǎn)物，導(dǎo)致非特異擴(kuò)增，造成了閉環(huán)雙鏈的DNA的PCR擴(kuò)增效率差，經(jīng)常得不到滿意的結(jié)果，同時(shí)酶切片段太長(zhǎng)也會(huì)使擴(kuò)增效率下降。YADE法Prashar等在擴(kuò)增cDNA3'端時(shí)采用"Y"形接頭，以減少接頭引物的單引物擴(kuò)增。其原理是接頭引物處于"Y"接頭的2個(gè)分叉單鏈上，序列與接頭一樣，只有與特異引物引導(dǎo)合成了接頭的互補(bǔ)序列后，接頭引物才能退火參與擴(kuò)增。其缺點(diǎn)是成本較高，在應(yīng)用YADE法時(shí)，為了得到合適的內(nèi)切酶，需要從眾多的內(nèi)切酶中篩選，另外，特殊的接頭往往也增加了實(shí)驗(yàn)的成本。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種在轉(zhuǎn)基因品系特異性檢測(cè)過(guò)程中擴(kuò)增基因組品系特異序列的方法。本發(fā)明原理為首先合成人工接頭，分別在連接頭上和基因組已知區(qū)域設(shè)計(jì)引物，然后將基因組進(jìn)行酶切，將酶切片段與此連接頭連接，取連接產(chǎn)物做模板，以連接頭引物和基因特異引物做PCR，具體原理見(jiàn)圖l。由于在設(shè)計(jì)上，人工接頭的5'末端沒(méi)有磷酸基，所以耙DNA的3'末端和人工接頭的5'末端的連接部位形成缺口。在第一次PCR反應(yīng)的第一個(gè)循環(huán)時(shí)，從PrimerCl開(kāi)始的延伸反應(yīng)在連接部位終止，限制了PrimerCl和PrimerCI同一引物之間的擴(kuò)增，從而控制了非特異性PCR擴(kuò)增。只有從PrimerSl開(kāi)始延伸合成的DNA鏈，才能成為PrimerCl的模板，進(jìn)行DNA的特異性擴(kuò)增反應(yīng)。再用內(nèi)側(cè)Primer(PrimerC2，PrimerS2)進(jìn)一步進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，可以高效特異性地?cái)U(kuò)增目的DNA。進(jìn)行C2的擴(kuò)增目的即是為了PCR產(chǎn)物的特異性。本發(fā)明的技術(shù)方案如下首先設(shè)計(jì)特異性引物PrimerSI和PrimerS2;所用的接頭為PstI接頭、Sau3AI接頭、HindIII接頭、EcoRI接頭、Sall接頭、Xbal接頭。它們分別含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Pstl、Sau3A、HindIII、EcoRI、SalI、Xbal。所用的接頭引物為PrimerC1,PrimerC2，他們的序列見(jiàn)表l:表l:接頭以及接頭Primer序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>1、DNA的限制酶酶切反應(yīng)。首先配制限制酶酶切反應(yīng)液。在eppendorf管中加入DNA5iig，限制酶50U,10x限制酶Buffer5|il，滅菌蒸餾水到50pl(使DNA完全分解的必要酶量，根據(jù)制備的DNA純度而定，一般IOU分解1嗎DNA)。而后，36.537.5。C保溫35小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行乙醇沉淀回收DNA，將DNA溶解于lO)il的滅菌蒸餾水中。2、配制連接反應(yīng)液。在eppendorf管中加入上述的DNA溶液5^1，接頭2.5ul，DNA連接酶2ul，滅菌蒸餾水20.5ul，1517。C反應(yīng)112小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行乙醇沉淀回收DNA。溶解于5|il的滅菌蒸餾水中。將上述DNA溶液l)il加入到33.5^1滅菌蒸餾水中，9296'C加熱1015分鐘。3、進(jìn)行1stPCR反應(yīng)配制lstPCR反應(yīng)液在0.25mleppendorf管中加入上述的DNA溶液34.5fi1，10xLAPCRBufferII(Mg2+plus)5^1，TaKaRaLATaq0.5(il，dNTPMixture8pl，PrimerCI1jil，PrimerSI1(^1。按以下條件進(jìn)行l(wèi)stPCR反應(yīng)擴(kuò)增片段〈4kbp時(shí)，94°C30sec.，55°C2min.，72°C4min.(擴(kuò)增lkbp以下片段時(shí)，設(shè)置lmin)30循環(huán)。擴(kuò)增片段^4kbp時(shí)，98。C10sec.，68°C15min.，30循環(huán)。4、進(jìn)行2ndPCR反應(yīng)。用滅菌水將lstPCR反應(yīng)液按適當(dāng)倍數(shù)稀釋(110,000倍稀釋)，再取1jil進(jìn)行2ndPCR反應(yīng)，其它2ndPCR反應(yīng)液組份如下lOxLAPCRBufferII(Mg2+plus)5pl，TaKaRaLATaq0.5pl，dNTPMixture8(il，PrimerC21(il，PrimerS21(il，滅菌蒸餾水到50^1。按以下條件進(jìn)行2ndPCR反應(yīng)擴(kuò)增片段〈4kbp時(shí)，94。C30sec.，55°C2min.，72°C4min.(擴(kuò)增lkbp以下片段時(shí)，設(shè)置lmin)，30循環(huán)。擴(kuò)增片段^4kbp時(shí)，98°C10sec.，68°C15min.，30循環(huán)。5、反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液(510(il)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。如果此PCR產(chǎn)物需用于以后實(shí)驗(yàn)，須將PCR產(chǎn)物冷凍保存。本發(fā)明的方法可以應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因番茄、轉(zhuǎn)基因棉花等所有轉(zhuǎn)基因生物的轉(zhuǎn)基因品系特異性檢測(cè)時(shí)擴(kuò)增基因組品系特異性片段。本發(fā)明的有益效果本方法利用PCR法，使用人工接頭以及人工接頭Primer,可特異性地?cái)U(kuò)增cDNA或基因組上的轉(zhuǎn)基因品系特異性區(qū)域。通過(guò)應(yīng)用LAPCR技術(shù)，使以往擴(kuò)增效率較低的長(zhǎng)鏈未知區(qū)域的擴(kuò)增變得簡(jiǎn)單，而且提高了保真性能。該方法可以制備成試劑盒。使用本試劑盒，不必經(jīng)過(guò)繁雜的文庫(kù)構(gòu)建及篩選、環(huán)化等，就能簡(jiǎn)單地得到基因組等上的長(zhǎng)鏈目的DNA，并可減少變異點(diǎn)的導(dǎo)入。在轉(zhuǎn)基因品系特異性檢測(cè)中擴(kuò)增品系特異性基因片段非常有效。圖1為本發(fā)明的品系特異性片段擴(kuò)增方法原理圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例轉(zhuǎn)基因玉米Mon863品系特異性序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例PCR產(chǎn)物序列，其中正常字體為玉米基因組序列，黑體字為載體序列。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明同樣的方法也可使用于其它轉(zhuǎn)基因生物。本發(fā)明以轉(zhuǎn)基因玉米Mon863品系特異性檢測(cè)研究為例，首先設(shè)計(jì)特異性引物PrimerSl禾nPrimerS2，其序列為PrimerSl5'AGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCAT3'PrimerS25'CCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTG3'所用接頭為PstI接頭。具體方法如下在50微升酶切液中，含有5微升(約0.5微克)MON863基因組DNA,Biolab公司的Pstl酶2微升，lxNEBbuffer3,lxBSA，37°C酶切5小時(shí)，后用無(wú)水乙醇沉淀，溶解在10微升ddH2O中。之后，在純化的10微升酶切處理過(guò)的基因組DNA中，加入人工合成的Pstl接頭5微升，再加入試劑盒(Biolab)中的LigationSoli30微升，LigationSolII(含有T4DNAligase)15微升，組成60微升的連接體系，在16t:連接l小時(shí)。連接液過(guò)柱純化，以20微升ddH20洗脫，洗脫液即可作為第一輪PCR的模板。PCR分兩輪進(jìn)行。第一輪，30微升體系中，含有l(wèi)xPCRbuffer(50mMKC1，10mMTris-HCl，pH8.3，1.5mMMgCl2)，200jiMdNTPs，0.5pM引物Cl，0.5[iM引物Sl，2.5ULATaqDNA聚合酶(TaKaRaBiotechnologyCo.，Ltd.)and50ngMON863摸板DNA。PCR程序是95。C預(yù)變性10分鐘，95。C變性30秒，57°C，59°C，61°C，63。C退火30秒，72。C延伸2分鐘，35循環(huán)。第二輪PCR，同上PCR體系，但引物分別為C2和S2;模板為0.5微升第一輪PCR產(chǎn)物。循環(huán)參數(shù)同第一輪PCR。在PTC-200Peltierthermalcycler(MJResearch,Waltham,MA)執(zhí)行PCR。第二輪PCR結(jié)束后，取5微升PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，確認(rèn)有約1.8kb的擴(kuò)增條帶(見(jiàn)圖2。其中1:分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000;2:退火溫度為57。C時(shí)的PCR產(chǎn)物；3:退火溫度為59°C時(shí)的PCR產(chǎn)物；4:退火溫度為6rC時(shí)的PCR產(chǎn)物；5:退火溫度為63。C時(shí)的PCR產(chǎn)物。箭頭所示為PCR產(chǎn)物。)從圖中看出，退火溫度最適溫度為61°C。用試劑盒(WatsonBiotechnologies,Inc.,Shanghai,China)回收純化第二輪PCR產(chǎn)物，與pMD-18T載體(TaKaRaBiotechnologyCo.,Ltd.)連接進(jìn)行克隆，得到的陽(yáng)性克隆提交invitrogen公司測(cè)序，測(cè)序儀為ABIPRISM3730GeneticAnalyzer(AppliedBiosystemsDivisionofPerkin-ElmerCorp.)采用載體通用引物雙向測(cè)序。序列經(jīng)BLASTN比對(duì)分析，表明所克隆區(qū)域?yàn)?27bp35S啟動(dòng)子載體序列，另外1476bp對(duì)應(yīng)玉米克隆AY506529的76191-77669區(qū)域(見(jiàn)圖3)。上述方法同樣可用于轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因番莉、轉(zhuǎn)基因棉花等所有轉(zhuǎn)基因生物的品系特異性檢測(cè)時(shí)擴(kuò)增基因組品系特異性片段。權(quán)利要求1.一種在轉(zhuǎn)基因生物品系特異性檢測(cè)中擴(kuò)增基因組品系特異序列方法，首先合成人工接頭，分別在連接頭上和基因組己知區(qū)域設(shè)計(jì)引物PrimerSI、PrimerS2，然后將基因組進(jìn)行酶切，將酶切片段與此連接頭連接，取連接產(chǎn)物做模板，以連接頭引物和基因特異引物做PCR，步驟如下1)DNA的限制酶酶切反應(yīng)配制限制酶酶切反應(yīng)液，反應(yīng)35小時(shí)，回收DNA，并溶解于蒸餾水；2)配制連接反應(yīng)液將步驟l)所得DNA溶液、接頭、DNA連接酶、蒸餾水混合進(jìn)行反應(yīng)，回收DNA，并溶解于蒸餾水，加熱；3)進(jìn)行l(wèi)stPCR反應(yīng)；4)進(jìn)行2ndPCR反應(yīng)；5)確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增基因組品系特異序列方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因生物為轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因番茄或轉(zhuǎn)基因棉花。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的擴(kuò)增基因組品系特異序列方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因生物為轉(zhuǎn)基因玉米。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的擴(kuò)增基因組品系特異序列方法，其特征在于引物PrimerSl禾卩PrimerS2的序列為PrimerSl5'AGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCAT3'PrimerS25'CCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTG3'5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增基因組品系特異序列方法，其特征在于步驟2)中所述的接頭為PstI接頭、Sau3AI接頭、HindIII接頭、EcoRI接頭、SalI接頭或XbaI接頭。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的擴(kuò)增基因組品系特異序列方法，其特征在于所述的接頭和接頭引物的序列為S肌3AI接頭<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>Pstl接頭5'H0:GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGCA3'3':CATGTATAACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTGOH5'Sall接頭5'HO;GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAG3';CATGTATAACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTCAGCTOH5'Xbal接頭5'HO:GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAT3'3':CATGTATAACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTAGATCOH5'接頭PrimerCl:5'HO:GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA3'接頭PrimerC2:5'HO:CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA3'全文摘要本發(fā)明公開(kāi)一種在轉(zhuǎn)基因品系特異性檢測(cè)中擴(kuò)增基因組品系特異序列方法。該方法將基因組DNA限制酶切，將人工合成的連接頭與其相連，分別在連接頭上和基因組已知區(qū)域設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增基因組品系特異序列。本發(fā)明通過(guò)應(yīng)用LAPCR技術(shù)，使以往擴(kuò)增效率較低的長(zhǎng)鏈未知區(qū)域的擴(kuò)增變得簡(jiǎn)單，而且提高了保真性能。該方法還可制備成試劑盒，該試劑盒不必經(jīng)過(guò)繁雜的文庫(kù)構(gòu)建及篩選、環(huán)化等，就能簡(jiǎn)單地得到基因組等上的長(zhǎng)鏈目的DNA，并可減少變異點(diǎn)的導(dǎo)入，在轉(zhuǎn)基因品系特異性檢測(cè)中擴(kuò)增品系特異性基因片段非常有效。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101311275SQ20071004126公開(kāi)日2008年11月26日申請(qǐng)日期2007年5月25日優(yōu)先權(quán)日2007年5月25日發(fā)明者孫建萍,宏朱,潘愛(ài)虎,賈軍偉,凱趙申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院