專利名稱：體外血管再生模型及其在生物材料血管化功能評(píng)價(jià)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物材料評(píng)價(jià)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，是涉及以體外血管再生模型研究和評(píng)價(jià)組織工程材料的表面性質(zhì)和降解產(chǎn)物對(duì)血管再生的作用，篩選促進(jìn)血管化的材料，控制降解速率與血管再生相匹配。
背景技術(shù)：
生物材料的生物相容性評(píng)價(jià)是生物材料研究和應(yīng)用的重要內(nèi)容和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以往的生物相容性評(píng)價(jià)主要側(cè)重于生物安全性方面。但隨著組織工程的發(fā)展和第三代生物材料概念的提出，要求材料在可生物降解的同時(shí)還必須具有生物活性，即材料在保證生物安全的同時(shí)，還應(yīng)支持細(xì)胞特定功能的發(fā)揮，有利于組織的修復(fù)和再生。因此，對(duì)組織工程用可降解生物材料生物活性(或生物功能)進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)日益重要。
組織工程是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)工程，需要解決的問(wèn)題很多。其中，如何解決支架材料的血管化問(wèn)題是組織工程取得成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。這是因?yàn)楫?dāng)再生組織的體積達(dá)到數(shù)立方毫米時(shí)，其內(nèi)部的細(xì)胞將難以通過(guò)滲透作用獲得營(yíng)養(yǎng)和氧氣的支持，而必須依靠毛細(xì)血管的長(zhǎng)入才能維持其正常的代謝。因此，要應(yīng)用組織工程技術(shù)成功地構(gòu)建生物組織，所用生物材料應(yīng)能促進(jìn)修復(fù)組織中的血管再生。由于材料無(wú)論是表面形貌、理化性質(zhì)還是降解產(chǎn)物都會(huì)對(duì)血管再生產(chǎn)生影響，因此，對(duì)材料血管化功能的評(píng)價(jià)應(yīng)從材料表面和降解產(chǎn)物兩個(gè)方面進(jìn)行。在篩選促進(jìn)血管再生的組織工程材料的研究中，篩選出合適的血管實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵匝芯坎牧蠈?duì)血管形成的影響，進(jìn)而篩選出促進(jìn)血管再生的材料十分重要。血管實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪茄芯亢Y選生物組織工程材料血管化功能的重要工具。目前已建立的研究篩選促進(jìn)血管再生的組織工程材料的相關(guān)模型有以下兩大類。
(1)體內(nèi)模型雖然該類模型與人體更接近，但仍存在很多問(wèn)題，如需要大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，操作繁瑣，周期長(zhǎng)，儀器設(shè)備昂貴，很難快速得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而且，由于動(dòng)物體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境，使研究特定因素對(duì)血管形成的影響變得困難，結(jié)果也很難重復(fù)。
(2)體外模型生物材料血管化功能體外評(píng)價(jià)方法的研究目前尚處于起步階段。德國(guó)的James Kirkpatrick實(shí)驗(yàn)室在這方面作了大量有益的探索工作。他們采用內(nèi)皮細(xì)胞和膠原凝膠，研究生物材料(如聚砜膜)表面和金屬離子(如Cr3+，Co2+)對(duì)血管形成的影響。
生物材料聚砜膜表面對(duì)血管形成影響的具體研究過(guò)程為在膜表面接種實(shí)驗(yàn)室自行培養(yǎng)出的人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMEC)，一段時(shí)間后，在內(nèi)皮細(xì)胞上加濃度為1.5mg/ml的I型膠原溶液(含有2％的NaHCO3，0.05N的NaOH以及200mM的HEPES)。培養(yǎng)箱中孵育形成凝膠，加入含2ng/ml堿性纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的培養(yǎng)液刺激血管樣結(jié)構(gòu)(TLS)的形成。TLS形成情況用Calcein-AM熒光染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果5天后觀察到有TLS形成，即5天后TLS才得以形成。
金屬離子Co2+對(duì)血管形成影響的具體研究過(guò)程為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞仍為實(shí)驗(yàn)室自行培養(yǎng)的人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMEC)。用含CoCl2溶液處理培養(yǎng)板上的單層HDMEC細(xì)胞作為研究細(xì)胞。在細(xì)胞上加3mg/ml的由I型牛皮膠原溶液和DMEM培養(yǎng)液按體積比1/1混合成的混合溶液，在培養(yǎng)箱中孵育使成凝膠。在激光共聚焦顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的刺激下形成TLS情況。TLS形成情況仍用Calcein-AM熒光染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果20小時(shí)后觀察到有TLS形成，即20小時(shí)后TLS才得以形成。
上述血管樣結(jié)構(gòu)(TLS)體外模型均是在內(nèi)皮細(xì)胞之上加膠原凝膠建立的，將它們用于生物工程材料對(duì)血管形成的影響評(píng)價(jià)，它們還共同存在有以下不足a.沒(méi)有采用標(biāo)準(zhǔn)的建系細(xì)胞，而采用實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，存在內(nèi)皮細(xì)胞純化困難，數(shù)量有限，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，代間差異大，標(biāo)準(zhǔn)化困難等問(wèn)題；b.培養(yǎng)需要外加生長(zhǎng)因子的刺激，摻進(jìn)了生長(zhǎng)因子對(duì)結(jié)果的影響；c.需要熒光染料和激光共聚焦顯微鏡，操作繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高，成本也相應(yīng)升高；d.實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)建立的體外血管再生實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛嬖诘牟蛔?，本發(fā)明的目的旨在提供一種使用標(biāo)準(zhǔn)建系細(xì)胞株建立的，無(wú)需外加生長(zhǎng)因子，無(wú)需熒光染料和激光共聚焦顯微鏡操作，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、成本低、實(shí)驗(yàn)周期短、易于大樣本重復(fù)和標(biāo)準(zhǔn)化的用于研究評(píng)價(jià)生物組織工程材料對(duì)血管形成影響的體外血管再生實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種以本發(fā)明制備的體外血管再生模型評(píng)價(jià)生物組織工程用材料表面性質(zhì)和材料降解物對(duì)血管再生影響的方法。
為了解決上述已有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明使用標(biāo)準(zhǔn)建系的ECV304細(xì)胞(自發(fā)轉(zhuǎn)化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株)建立了一種新型的體外血管再生模型。該模型是發(fā)明人基于在生物組織工程材料血管化功能研究中發(fā)現(xiàn)的以下現(xiàn)象基礎(chǔ)之上建立的，即在低濃度膠原表面，ECV304細(xì)胞在無(wú)外加生長(zhǎng)因子刺激下，能在短時(shí)間內(nèi)自發(fā)地形成TLS。
本發(fā)明公開(kāi)的用于生物組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)研究的體外血管再生模型，由以下方法制備得到(1)用濃度為0.1～1.5mg/ml的膠原溶液與濃縮倍數(shù)為5～10倍的培養(yǎng)液和pH值為6.5～7.5的中和液按(5～7)∶(2～1)∶(3～2)的體積比混合制備膠原凝膠；(2)將ECV304細(xì)胞接種到膠原凝膠表面，在培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，使ECV304細(xì)胞在膠原凝膠表面自發(fā)形成血管樣結(jié)構(gòu)，即制備得體外血管再生模型。且制備的血管樣結(jié)構(gòu)有管腔樣間隙(見(jiàn)附圖2)。
在上述技術(shù)方案中，所述的膠原溶液可由I型膠原溶解于質(zhì)量濃度0.1～2％乙酸中配制成；所述的中和液可由HEPES、NaHCO3和NaOH配制成；膠原溶液與培養(yǎng)液和中和液最好是以快速冰浴的方式混合制備膠原凝膠；ECV304細(xì)胞最好以單個(gè)細(xì)胞懸液的方式接種于膠原凝膠上；細(xì)胞懸液可由對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ECV304細(xì)胞，經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化后加入RPMI1640培養(yǎng)液制作成；細(xì)胞接種于膠原凝膠上的培養(yǎng)環(huán)境為，培養(yǎng)板每孔50～100μl，溫度為37℃，氛圍為5％CO2，濕度為飽和濕度。
本發(fā)明揭示的體外血管再生模型可應(yīng)用于生物組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)，如生物組織工程材料表面性質(zhì)對(duì)血管再生影響，生物組織工程材料降解產(chǎn)物對(duì)血管再生影響等。運(yùn)用本發(fā)明揭示的體外血管再生模型研究生物組織工程材料表面性質(zhì)對(duì)血管再生的影響，其過(guò)程主要包括以下步驟(1)用胰蛋白酶消化ECV304細(xì)胞，加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種于所研究的生物組織工程材料表面，培養(yǎng)至細(xì)胞融合形成單層；(2)用胰蛋白酶消化材料表面生長(zhǎng)的ECV304細(xì)胞，加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種到膠原凝膠表面，培養(yǎng)至血管樣結(jié)構(gòu)形成，即制作血管再生模型；(3)在顯微鏡下觀察ECV304皮內(nèi)細(xì)胞在膠原表面形成的血管樣結(jié)構(gòu)，計(jì)算管狀結(jié)構(gòu)個(gè)數(shù)。
(4)用ScionImage圖象分析軟件計(jì)算血管樣結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度或所覆蓋的面積；(5)與對(duì)照組比較，評(píng)價(jià)材料表面性質(zhì)對(duì)血管再生的作用，篩選出促進(jìn)血管再生的材料。
運(yùn)用本發(fā)明揭示的體外血管再生模型研究生物組織工程材料降解產(chǎn)物對(duì)血管再生的影響，其過(guò)程步驟與研究材料降解產(chǎn)物對(duì)血管再生影響的過(guò)程步驟所不同的地方在于(1)、(2)步驟，其他步驟基本相同。研究生物組織工程材料降解產(chǎn)物對(duì)血管再生影響的(1)、(2)步驟為(1)將ECV304細(xì)胞接種于膠原凝膠表面制作出體外血管再生模型；(2)將RPMI1640培養(yǎng)液與所研究材料降解產(chǎn)物的混合溶液施加于體外血管再生模型進(jìn)行培養(yǎng)，使ECV304細(xì)胞在膠原凝膠表面自發(fā)形成血管樣結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明選用ECV304內(nèi)皮細(xì)胞株，克服了培養(yǎng)細(xì)胞純化困難，數(shù)量有限，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，代間差異大，以及不同實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果難以比較等諸多問(wèn)題，可用于大量樣本的同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果重現(xiàn)性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化。而且本發(fā)明的體外血管再生模型，沒(méi)有外加生長(zhǎng)因子，排除了生長(zhǎng)因子對(duì)結(jié)果分析的干擾，也降低了實(shí)驗(yàn)成本。ECV304細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi)形成TLS，實(shí)驗(yàn)周期短，能快速獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。ECV304細(xì)胞在凝膠表面形成的TLS，在普通的光學(xué)顯微鏡下即可觀察，對(duì)儀器設(shè)備無(wú)特殊要求，易于在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室推廣普及。本發(fā)明的公開(kāi)，為研究評(píng)價(jià)生物組織工程材料對(duì)血管再生形成的影響，篩選能促進(jìn)血管再生的生物組織工程材料提供了一個(gè)有效工具。


附圖1是ECV304細(xì)胞在聚苯乙烯培養(yǎng)板表面培養(yǎng)形成的形態(tài)。
附圖2是ECV304細(xì)胞在膠原凝膠表面培養(yǎng)形成的血管樣結(jié)構(gòu)。箭頭所指為管腔樣間隙
具體實(shí)施例方式膠原凝膠的制備實(shí)施例I型牛皮膠原(或其他I型膠原)溶解于質(zhì)量濃度0.1％乙酸中(乙酸濃度在0.1-2％都可)，配成濃度為0.8mg/ml(濃度在0.1～1.5mg/ml都可)的膠原溶液。取5倍濃縮的RPMI1640培養(yǎng)液(濃縮倍數(shù)在5-10倍都可)與膠原溶液按5/2的體積比(體積比為5/2或7/1都可)在冰浴中迅速混勻，再加體積份數(shù)3份的中和液混合至溶液呈均勻的橙紅色。中和液由4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)(200mmol/L)，NaHCO3(0.2619mol/L)，NaOH(50mmol/L)配制成，pH＝7.4(pH＝6.5-7.5都可)。將混合物小心加入96孔板中，50μl/孔，在37℃的條件下培養(yǎng)不少于30分鐘制成膠原凝膠備用。
ECV304/膠原凝膠血管再生模型制作實(shí)施例取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ECV304細(xì)胞，質(zhì)量濃度0.25％胰蛋白酶消化，RPMI1640培養(yǎng)液(含10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素)制成密度為0.5×105～1.5×105個(gè)/ml的單個(gè)細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)的膠原凝膠上，在每孔100～50μl，37℃，5％CO2，飽和濕度下培養(yǎng)8小時(shí)，倒置相差顯微鏡下，可觀察到ECV304內(nèi)皮細(xì)胞在膠原表面形成的血管樣結(jié)構(gòu)(TLS)。
組織工程用材料表面性質(zhì)對(duì)血管再生影響的檢測(cè)實(shí)施例以外消旋聚乳酸(D，L-PLA)為例膜的制備D，L-PLA用三氯甲烷溶解配成1％質(zhì)量濃度的溶液(濃度在0.5-2％都可)，在蓋玻片(2.6×2.2cm2)表面成膜，每張蓋玻片表面涂覆D，L-PLA溶液100～500ul?？諝庵蟹胖眠^(guò)夜后，真空干燥至衡重。紫外消毒2h以上備用。
TLS檢測(cè)用0.25％胰蛋白酶消化培養(yǎng)板表面對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ECV304細(xì)胞，加入RPMI1640培養(yǎng)液(另加10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素)制成密度為1×104～5×104個(gè)/ml的單個(gè)細(xì)胞懸液，接種于D，L-PLA膜表面，37℃，5％CO2，飽和濕度下培養(yǎng)至細(xì)胞融合形成單層。用0.25％胰蛋白酶消化膜表面的ECV304細(xì)胞，加低血清的RPMI1640培養(yǎng)液(另加5％胎牛血清)制成密度為0.5×105～1.5×105個(gè)/ml的單個(gè)細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)的膠原凝膠上，每孔100μl，37℃，5％CO2，飽和濕度下培養(yǎng)8小時(shí)。倒置相差顯微鏡下觀察ECV304皮內(nèi)細(xì)胞在膠原表面形成的TLS，計(jì)算管狀結(jié)構(gòu)個(gè)數(shù)。用ScionImage圖象分析軟件計(jì)算TLS的長(zhǎng)度或所覆蓋的面積。以培養(yǎng)板(聚苯乙烯)為對(duì)照。將檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較，進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在D，L-PLA表面細(xì)胞形成TLS的個(gè)數(shù)和長(zhǎng)度均大于對(duì)照組表面的細(xì)胞，與對(duì)照組比較差異顯著(p＜0.05)(D，L-PLA表面分別為22±2個(gè)、7963±438.23um，而對(duì)照組表面分別為18±4.1個(gè)、6897.92±344.90um)。即表明D，L-PLA表面較聚苯乙烯表面的血管化能促進(jìn)TLS的形成。
組織工程用材料降解產(chǎn)物對(duì)血管再生影響的檢測(cè)實(shí)施例以外消旋聚乳酸(D，L-PLA)為例降解產(chǎn)物制備以溶劑揮發(fā)法澆鑄成膜。溶劑為三氯甲烷，濃度為5％，模具為聚四氟乙烯模具。室溫干燥后，真空干燥至衡重。Co60輻照后備用。參照ISO 1099313降解D，L-PLA膜。降解介質(zhì)為無(wú)菌生理鹽水。降解一段時(shí)間(1、7、14、30、60、90、120天)后，取出D，L-PLA膜，得到降解液。
TLS檢測(cè)按前述方法制作ECV304/膠原凝膠血管再生模型。用RPMI1640培養(yǎng)液與降解產(chǎn)物的混合溶液作為培養(yǎng)液(體積比為1/1)。8小時(shí)后倒置相差顯微鏡下觀察ECV304內(nèi)皮細(xì)胞在膠原表面形成的TLS，計(jì)算管狀結(jié)構(gòu)個(gè)數(shù)。用圖象分析軟件計(jì)算TLS的長(zhǎng)度或所覆蓋的面積。以生理鹽水為對(duì)照組。將測(cè)量結(jié)果與對(duì)照組比較，進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)量結(jié)果見(jiàn)附表1。附表1中的測(cè)量結(jié)果說(shuō)明，D，L-PLA前1周的降解產(chǎn)物對(duì)TLS的形成略有促進(jìn)，14天時(shí)略有抑制，但無(wú)顯著性差異(p＜0.05)。30天抑制作用顯著(p＜0.05)，之后抑制作用逐漸增強(qiáng)，至120天略有好轉(zhuǎn)，但仍有輕微抑制(p＜0.05)。
表1

注*與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(p＜0.05)；**與對(duì)照組比較差異顯著(p＜0.05)
權(quán)利要求
1.一種用于生物組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)的體外血管再生模型，其特征在于該模型由以下方法制備(1)用濃度為0.1～1.5mg/ml的膠原溶液與濃縮倍數(shù)為5～10倍的培養(yǎng)液和pH值為6.5～7.5的中和液按(5～7)∶(2～1)∶(3～2)的體積比混合制備膠原凝膠；(2)將ECV304細(xì)胞接種到膠原凝膠表面，在培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，使ECV304細(xì)胞在膠原凝膠表面自發(fā)形成血管樣結(jié)構(gòu)，即制備得體外血管再生模型。
2.如權(quán)利要求1所述的用于生物組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)的體外血管再生模型，其特征在于所述的膠原溶液由I型膠原溶解于質(zhì)量濃度0.1～2％乙酸中配制成。
3.如權(quán)利要求1所述的用于生物組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)的體外血管再生模型，其特征在于所述的中和液為由HEPES、NaHCO3和NaOH配制成。
4.如權(quán)利要求1所述的用于生物組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)的體外血管再生模型，其特征在于膠原溶液與培養(yǎng)液和中和液以快速冰浴的方式混合制備膠原凝膠。
5.如權(quán)利要求1所述的用于生物組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)的體外血管再生模型，其特征在于所述ECV304細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ECV304細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的用于生物組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)的體外血管再生模型，其特征在于ECV304細(xì)胞由胰蛋白酶進(jìn)行消化，加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液后接種于膠原凝膠上。
7.如權(quán)利要求6所述的用于生物組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)的體外血管再生模型，其特征在于所述的細(xì)胞懸液由對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ECV304細(xì)胞，經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化后加入RPMI1640培養(yǎng)液。
8.如權(quán)利要求6所述的用于生物組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)的體外血管再生模型，其特征在于細(xì)胞接種于膠原凝膠上的培養(yǎng)環(huán)境為，培養(yǎng)板每孔50～100μl，溫度為37℃，氛圍為5％CO2，濕度為飽和濕度。
9.關(guān)于權(quán)利要求1至8中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的體外血管再生模型在生物組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)中的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用過(guò)程主要包括以下步驟(1)用胰蛋白酶消化ECV304細(xì)胞，加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種于所研究的生物組織工程材料表面，培養(yǎng)至細(xì)胞融合形成單層；(2)用胰蛋白酶消化材料表面生長(zhǎng)的ECV304細(xì)胞，加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種到膠原凝膠表面，培養(yǎng)至血管樣結(jié)構(gòu)形成，即制作血管再生模型；(3)在顯微鏡下觀察ECV304皮內(nèi)細(xì)胞在膠原表面形成的血管樣結(jié)構(gòu)，計(jì)算管狀結(jié)構(gòu)個(gè)數(shù)。(4)用ScionImage圖象分析軟件計(jì)算血管樣結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度或所覆蓋的面積；(5)與對(duì)照組比較，評(píng)價(jià)材料表面性質(zhì)對(duì)血管再生的作用，篩選出促進(jìn)血管再生的材料。
10.以權(quán)利要求1至8中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的體外血管再生模型對(duì)組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)的方法，其特征在于主要包括以下步驟(1)將ECV304細(xì)胞接種于膠原凝膠表面制作出體外血管再生模型；(2)將RPMI1640培養(yǎng)液與所研究材料降解產(chǎn)物的混合溶液施加于體外血管再生模型進(jìn)行培養(yǎng)，使ECV304細(xì)胞在膠原凝膠表面自發(fā)形成血管樣結(jié)構(gòu)；(3)在顯微鏡下觀察ECV304皮內(nèi)細(xì)胞在膠原表面形成的血管樣結(jié)構(gòu)，計(jì)算管狀結(jié)構(gòu)個(gè)數(shù)。(4)用ScionImage圖象分析軟件計(jì)算血管樣結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度或所覆蓋的面積；(5)與對(duì)照組比較，評(píng)價(jià)材料表面性質(zhì)對(duì)血管再生的作用，篩選出促進(jìn)血管再生的材料。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于生物組織工程材料血管化功能評(píng)價(jià)的體外血管再生模型及其在材料血管化功能評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。體外血管再生模型由ECV304細(xì)胞接種到膠原凝膠表面，在培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至使ECV304細(xì)胞在膠原凝膠表面自發(fā)形成血管樣結(jié)構(gòu)制作成，膠原凝膠由膠原溶液與培養(yǎng)液和中和液混配成。本發(fā)明提供的血管再生模型可用于大量樣本的同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果重現(xiàn)性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化，制作過(guò)程沒(méi)有外加生長(zhǎng)因子，排除了生長(zhǎng)因子對(duì)結(jié)果分析的干擾，也降低了實(shí)驗(yàn)成本。ECV304細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi)形成TLS，實(shí)驗(yàn)周期短，能快速獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。ECV304細(xì)胞在凝膠表面形成的TLS可在普通的光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)儀器設(shè)備無(wú)特殊要求，易于在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室推廣普及。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101045913SQ200710048530
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2007年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月27日
發(fā)明者萬(wàn)昌秀, 陳元維, 余喜訊, 丁玉龍, 史國(guó)齊, 張小華 申請(qǐng)人:四川大學(xué)