專利名稱：從生物學(xué)樣品富集靶細(xì)胞的方法及除去白細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從生物學(xué)樣品富集靶細(xì)胞的方法及除去白細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
包括干細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、免疫細(xì)胞等在內(nèi)的 細(xì)胞在疾病的預(yù)防、檢測(cè)、診斷和治療方面有很大應(yīng)用。
干細(xì)胞是指一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞、 骨髓干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞等。在一定條件下， 干細(xì)胞可以分化成多種功能細(xì)胞，因此干細(xì)胞具有治療許多疑難病癥、提 供器官移植，以及康復(fù)、保健，減輕老化、恢復(fù)青春活力等等廣泛應(yīng)用。
己經(jīng)證明早在妊娠五周母血循環(huán)中就可監(jiān)測(cè)出胎兒細(xì)胞。目前，獲取 胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷的方法主要有羊膜腔穿刺、絨毛活檢和臍血管穿刺。 這些手段對(duì)胎兒有一定的風(fēng)險(xiǎn)，有可能造成流產(chǎn)。從母血中分離出胎兒細(xì) 胞預(yù)示著只需通過簡(jiǎn)單的靜脈穿刺途徑即可獲得胎兒細(xì)胞。胎兒細(xì)胞的臨 床應(yīng)用將包括早期診斷胎兒染色體或基因異常。
大量報(bào)道提示甚至可在以成像分析方式檢測(cè)到原發(fā)腫瘤之前，可在患 者中發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。除了在早期診斷和預(yù)測(cè)中的潛在作用外， CTC還可在表征隨腫瘤進(jìn)程的遺傳和免疫表型變化中發(fā)揮主要作用，從而 有助于指導(dǎo)個(gè)體化治療。
由于免疫系統(tǒng)或其他系統(tǒng)的疾病，或由于免疫接種或某些臨床治療措 施及某些外界環(huán)境因素的影響，免疫細(xì)胞(例如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞， K淋巴細(xì)胞或NK淋巴細(xì)胞)的數(shù)量或功能均可發(fā)生變化。因此，進(jìn)行細(xì) 胞免疫檢測(cè)，對(duì)于某些疾病的診斷和發(fā)病機(jī)理研究、免疫治療或預(yù)防接種 的效果評(píng)估及環(huán)境因素對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，都具有重要的意義。
但是所述干細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、免疫細(xì)胞在生盡管已將各種技術(shù)用于富集、分離和表征靶細(xì)胞，但是其中許多具有 相似的原理，即基于抗體的正選擇。由于細(xì)胞表面標(biāo)記的異質(zhì)性表達(dá)，這 些用于耙細(xì)胞檢測(cè)的策略顯然受到以下因素的限制抗不同靶細(xì)胞上的生
物標(biāo)記的抗體的可獲得性、敏感性和特異性。其它策略包括紅細(xì)胞(RBC)、 白細(xì)胞(WBC)的負(fù)除去。目前主要基于大小過濾除去較小的RBC和WBC， 但因?yàn)槟承┌屑?xì)胞例如CTC可如WBC —樣小，所述基于大小過濾的方法 有丟失耙細(xì)胞的危險(xiǎn)。
對(duì)于除去白細(xì)胞的方法，現(xiàn)有技術(shù)中雖存在使用抗CD45包被的30nm 磁珠(Miltenyi產(chǎn)品，Germany)除去白細(xì)胞的方法，但該方法不僅昂貴(RMB 600-700/試驗(yàn))，費(fèi)時(shí)(超過4小時(shí)/試驗(yàn))，而且WBC去除效率不高(WBC 去除率為約2-3 logs)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明創(chuàng)造性地將基于摩爾滲透壓濃度 (osmolality)的方式與免疫親和層析法聯(lián)合起來用于分別去除RBC和 WBC，從而達(dá)到富集靶細(xì)胞，尤其是稀有細(xì)胞的目的。該方法不僅成本低， 而且高效地使耙細(xì)胞得以富集，并易于后續(xù)檢測(cè)。所述靶細(xì)胞包括干細(xì)胞、 胎兒細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、免疫細(xì)胞等。
本發(fā)明還提供了一種除去白細(xì)胞的方法，該方法不僅成本低，省時(shí)， 而且效率高。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種從生物學(xué)樣品富集
耙細(xì)胞的方法，該方法包括
用基于摩爾滲透壓濃度的方式除去紅細(xì)胞和用免疫親和層析法除去白 細(xì)胞。
本發(fā)明創(chuàng)造性地聯(lián)合應(yīng)用基于摩爾滲透壓濃度的方式除去紅細(xì)胞和免疫親和層析法除去白細(xì)胞來富集靶細(xì)胞。利用摩爾滲透壓濃度的方式除去 紅細(xì)胞和利用免疫親和層析法除去白細(xì)胞這兩個(gè)過程沒有特別的順序要 求。例如可以先利用親和層析法除去白細(xì)胞然后再利用基于摩爾滲透壓濃 度的方式除去紅細(xì)胞；或者用基于摩爾滲透壓濃度的方式除去紅細(xì)胞然后 再利用親和層析法除去白細(xì)胞。為了更快地、更有效地使白細(xì)胞通過親和 層析柱，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，用基于摩爾滲透壓濃度的方式 除去紅細(xì)胞然后再利用親和層析法除去白細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述的生物學(xué)樣品是體液；優(yōu)選所 述的體液是血液、骨髓、脊髓或手術(shù)液(surgical fluid)。在本發(fā)明的一個(gè) 實(shí)施方式中，以血液為例驗(yàn)證了本發(fā)明方法的有效性。同時(shí)由于血液、骨 髓、脊髓或手術(shù)液的密度類似且靶細(xì)胞在其中的存在狀態(tài)類似，所以本發(fā) 明的方法可用于骨髓、脊髓或手術(shù)液中靶細(xì)胞的富集。
為了收集血液，將人或任何其它動(dòng)物的血樣收集在抗凝血收集管中或 含有任何抗凝劑的管中，所述抗凝劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)、枸櫞酸 葡萄糖(ACD)等。為了收集骨髓，可在供者的髂骨部位穿刺采集骨髓； 也可以動(dòng)員骨髓和其他部位的造血干細(xì)胞大量釋放到外周血中去，然后從 供者的手臂靜脈中采集。脊髓可通過例如脊髓穿刺獲得。手術(shù)液可以為利 用手術(shù)方式獲得的體液，例如腹腔或胸腔積液，其中包括本發(fā)明所述的一 些耙細(xì)胞和蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所用的血液是取血當(dāng)天，優(yōu)選取血 起20小時(shí)之內(nèi)，更優(yōu)選取血起10小時(shí)之內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選取血起5小時(shí)之 內(nèi)或取血起3小時(shí)之內(nèi)或取血起1小時(shí)之內(nèi)，最優(yōu)選取血起立即獲得的新 鮮血液。上述新鮮血液中的紅細(xì)胞對(duì)RBC裂解緩沖液敏感，而耙細(xì)胞對(duì) RBC裂解緩沖液不敏感。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，其中所述免疫親和層析法中所使用 的免疫顆粒的尺寸為1 pm 20 pm，更優(yōu)選為2 pm 15 pm，進(jìn)一步優(yōu)選為 5pm 10^im。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，進(jìn)一步優(yōu)選所述的免疫顆 粒具有可再生性?？衫肨ris-Glycine等緩沖液對(duì)免疫顆粒進(jìn)行洗滌和重新 使用，從而節(jié)約成本。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，用基于摩爾滲透壓濃度的方式除去 紅細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述基于摩爾滲透壓濃度的方
式中包括沉淀和裂解紅細(xì)胞。所述沉淀優(yōu)選以500 3000 rpm，更優(yōu)選100 2000rpm離心1 6分鐘，優(yōu)選2 4分鐘以沉淀RBC，優(yōu)選同時(shí)除去血漿。 在室溫將所收集的RBC于RBC裂解緩沖液中輕柔旋轉(zhuǎn)振蕩5 20分鐘。 然后將所獲得的溶液以500 3000 rpm，更優(yōu)選100 2000 rpm，離心l IO分鐘，更優(yōu)選3 6分鐘以沉淀未裂解的細(xì)胞，所述未裂解的細(xì)胞包括白 細(xì)胞和稀有細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述用于除去白細(xì)胞的免疫顆粒位 于親和層析柱中并結(jié)合有靶向白細(xì)胞的特異性結(jié)合物。優(yōu)選所述的特異性 結(jié)合物為識(shí)別在白細(xì)胞上表達(dá)的抗原的抗體。由于CD45 (又稱"白細(xì)胞表 面共同抗原")是最認(rèn)可和接受的白細(xì)胞表面抗原，所以更優(yōu)選所述的抗 體為抗CD45抗體。最優(yōu)選將抗CD45 mAb(CD45單抗)偶聯(lián)到Affi-Gel 10 基質(zhì)上。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的親和層析柱進(jìn)行層析。在本發(fā)明的 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，為了除去白細(xì)胞，將含有白細(xì)胞的溶液以約0.5 8.5 ml/min的流速，優(yōu)選以約0.75 3.5 ml/min的流速，進(jìn)一步優(yōu)選以約1 2.5 ml/min的流速流過親和層析柱。
利用本發(fā)明的方法所獲得的靶細(xì)胞適于后續(xù)分析、操作或應(yīng)用，當(dāng)然 也可在獲得了本發(fā)明的靶細(xì)胞后，對(duì)靶細(xì)胞內(nèi)的蛋白和/或基因進(jìn)行后續(xù)分 析、操作或應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述后續(xù)分析、操作 或應(yīng)用為以下之一流式細(xì)胞術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、免疫熒光、免 疫細(xì)胞化學(xué)、圖像分析、酶學(xué)測(cè)定、炎癥研究、基因表達(dá)譜分析、治療效 力測(cè)驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞治療、質(zhì)譜和其它與細(xì)胞和/或蛋白相關(guān)的研究等。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，用本發(fā)明的方法富集的靶細(xì)胞包括 干細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、免疫細(xì)胞中的至少一種。在 利用本發(fā)明的方法富集了上述靶細(xì)胞的基礎(chǔ)上，可以利用進(jìn)一步的分離純 化方法獲得循環(huán)腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞(包括胚胎干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、成體 干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞等)、胎兒細(xì)胞、免疫細(xì)胞(包括T淋 巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞，K淋巴細(xì)胞和NK淋巴細(xì)胞)等，并可進(jìn)一步利用這些純化的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、免疫細(xì)胞進(jìn)行預(yù)測(cè)、檢測(cè)、 診斷和治療。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的方法還包括除去血漿蛋白。 為了更有利于節(jié)省時(shí)間和減少操作步驟，除去血漿蛋白的步驟可與沉淀紅
細(xì)胞的步驟同時(shí)進(jìn)行。例如在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，將全血以1500離 心3分鐘，以沉淀紅細(xì)胞和去除包括血槳蛋白在內(nèi)的血漿。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，優(yōu)選回收本發(fā)明的方法所除去的白 細(xì)胞和/或所除去的血漿蛋白，并將其進(jìn)一步用于后續(xù)分析、操作或應(yīng)用， 例如，流式細(xì)胞術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)、 圖像分析、酶學(xué)測(cè)定、炎癥研究、基因表達(dá)譜分析、治療效力測(cè)驗(yàn)、細(xì)胞 培養(yǎng)、細(xì)胞治療、質(zhì)譜和其它與細(xì)胞和/或蛋白相關(guān)的研究等。例如可利用 進(jìn)一步的分離純化方法獲得白細(xì)胞或血漿蛋白等，并可進(jìn)一步利用這些純 化的白細(xì)胞或血漿蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)、檢測(cè)、診斷和治療。
在本發(fā)明中，術(shù)語"富集"以其最廣泛的含義使用，是使一物質(zhì)比其 原存在環(huán)境條件下更加濃縮，其包括"積累"、"濃縮"、"提取"、"分 離"等含義在內(nèi)。
本發(fā)明還提供了一種除去白細(xì)胞的方法，該方法包括采用抗CD45抗 體偶聯(lián)的Affi-Gd IO除去白細(xì)胞?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的親和層析 柱進(jìn)行層析。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，為了除去白細(xì)胞，將含有 白細(xì)胞的溶液以約0.5 8.5 ml/min的流速，優(yōu)選以約0.75 3.5 ml/min的流 速，進(jìn)一步優(yōu)選以約1 2.5 ml/min的流速流過親和層析柱?？衫?Tris-Glycine等緩沖液對(duì)免疫顆粒進(jìn)行洗滌和重新使用，從而節(jié)約成本。該 方法不僅成本低，省時(shí)，而且效率高。
以下以實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，所述實(shí)施例并不用于限定本 發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
實(shí)施例l、從生物學(xué)樣品除去白細(xì)胞的方法
將人血稀釋在含有5 mM EDTA的PBS中，加入3倍體積的RBC裂解緩沖液(具體成分見下)，于室溫輕柔旋轉(zhuǎn)振蕩12分鐘。將樣品于1500 rpm 旋轉(zhuǎn)離心5分鐘以收集細(xì)胞沉淀。棄去上清液中的裂解RBC，并將細(xì)胞沉 淀重懸浮在含有5 mM EDTA的3 ml 5 ml的PBS中，并使其通過抗CD45 抗體偶聯(lián)的Affi-Gel 10 (Pierce, IL， US)親和層析柱以除去WBC，其中將 細(xì)胞以2ml/min的流速于PBS中流過所述親和層析柱，并收集流過液。與 現(xiàn)有技術(shù)中利用Miltenyi，s試劑盒去除白細(xì)胞相比，本發(fā)明除去白細(xì)胞的 方法顯著降低了成本(本發(fā)明分離方法的成本為RMB 80-150/試驗(yàn)；而 Multiny，s試劑盒的成本為RMB 600-700/試驗(yàn))、縮短了時(shí)間(本發(fā)明分離 方法每個(gè)試驗(yàn)需不到40分鐘即可完成去除白細(xì)胞；而Multiny's試劑盒去 除白細(xì)胞需超過4小時(shí)/試驗(yàn))、而且效率高(本發(fā)明方法的WBC去除率 可達(dá)約3-4 logs;而Multiny，s試劑盒的WBC去除率僅為約2-3 logs)。
抗CD45抗體偶聯(lián)的Affi-Gel 10的制備由于購自Pierce (IL， US)的 Affi-Gel IO含有可供激活的化學(xué)基團(tuán)，所以將抗CD45抗體與Affi-Gel 10 混合約15分鐘，即可完成抗CD45抗體與Affi-Gel 10的偶聯(lián)。
RBC裂解緩沖液(pH7.2):
NH4C1 82.9 g
KHC03 10 g
EDTA 二鈉 0.37 g
H20 1 L
實(shí)施例2、從生物學(xué)樣品富集靶細(xì)胞的方法
將5ml 10ml的人血收集在含有EDTA的試管中，以1500 rpm旋 轉(zhuǎn)離心3分鐘以沉淀RBC和除去包括血漿蛋白在內(nèi)的血漿。在室溫將所收 集的RBC于10 ml基于NH4C1的RBC裂解緩沖液(具體成分如上)輕柔 旋轉(zhuǎn)振蕩15分鐘。然后將所獲得的溶液以1500 rpm旋轉(zhuǎn)離心5分鐘以沉 淀未裂解的細(xì)胞，所述未裂解的細(xì)胞包括WBC和稀有細(xì)胞。將所得未裂 解細(xì)胞沉淀重懸浮在5 ml PBS中，并使其通過0.5 ml抗CD45抗體偶聯(lián) 的Affi-Gel 10 (Pierce, IL, US)親和層析柱以除去WBC，其中將細(xì)胞以 2ml/min的流速于PBS中流過所述親和層析柱，并收集流過液。將所收集的含有稀有細(xì)胞的流過液在900 g離心5分鐘以上。將細(xì)胞沉淀重懸浮，以 進(jìn)行后續(xù)分析。富集后，可以用10mlTris-Glycine (pH2.5)洗滌親和柱 以除去所有的結(jié)合分子，然后用PBS (pH7.4)進(jìn)行中和以備重新使用。
實(shí)施例3、利用摻加研究驗(yàn)證本發(fā)明的富集方法的收率 用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)預(yù)先標(biāo)記靶細(xì)胞(例如可從ATCC 獲得的HeLa細(xì)胞或MCF-7細(xì)胞)然后摻入人血中，使用實(shí)施例1所述的 方法富集摻加的細(xì)胞。平均回收率為約70% 80%。與現(xiàn)有技術(shù)中利用 Miltenyi's試劑盒去除白細(xì)胞的富集方法相比，本發(fā)明的富集方法顯著降低 了成本(本發(fā)明富集方法的成本為RMB 100-200/試驗(yàn)；而利用Multiny's試 劑盒的僅去除白細(xì)胞的成本就為RMB 600-700/試驗(yàn))、縮短了時(shí)間(本發(fā) 明的富集方法每個(gè)試驗(yàn)需不到1小時(shí)即可完成去除紅細(xì)胞和白細(xì)胞；而 Multiny's試劑盒僅去除白細(xì)胞就需超過4小時(shí)/試驗(yàn))、而且效率高(本發(fā) 明方法的WBC去除率可達(dá)約3-4 logs;而Multiny's試劑盒的WBC去除 率僅為約2-3 logs)。
權(quán)利要求
1、一種從生物學(xué)樣品富集靶細(xì)胞的方法，該方法包括用基于摩爾滲透壓濃度的方式除去紅細(xì)胞和用免疫親和層析法除去白細(xì)胞。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的生物學(xué)樣品是體液；優(yōu)選所 述的體液是血液、骨髓、脊髓或手術(shù)液。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的血液是取血當(dāng)天的新鮮血液。
4、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述免疫親和層析法中所使用的免 疫顆粒的尺寸為1 pm 20 pm，進(jìn)一步優(yōu)選為5 pm 10 更進(jìn)一步優(yōu)選 所述的免疫顆粒具有可再生性。
5、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基于摩爾滲透壓濃度的方式包 括沉淀和裂解紅細(xì)胞。
6、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述免疫親和層析法中所使用的抗 體為識(shí)別在白細(xì)胞上表達(dá)的抗原的抗體；優(yōu)選所述抗體為抗CD45抗體；更 優(yōu)選所述抗CD45抗體偶聯(lián)到Affi-Gd 10基質(zhì)上；進(jìn)一步優(yōu)選所述CD45 抗體為抗CD45單抗。
7、 如權(quán)利要求1所述的方法，該方法所獲得的靶細(xì)胞適于后續(xù)分析、 操作或應(yīng)用，所述后續(xù)分析、操作或應(yīng)用為以下之一流式細(xì)胞術(shù)、聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)、圖像分析、酶學(xué)測(cè)定、炎癥研究、 基因表達(dá)譜分析、治療效力測(cè)驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞治療。
8、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的靶細(xì)胞包括干細(xì)胞、胎兒細(xì) 胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞中的至少一種。
9、 如權(quán)利要求l所述的方法，該方法還包括除去血漿蛋白；優(yōu)選回收 所除去的白細(xì)胞和/或所除去的血漿蛋白。
10、 一種從生物學(xué)樣品除去白細(xì)胞的方法，該方法包括采用抗CD45 抗體偶聯(lián)的Affi-Gd 10除去白細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及從生物學(xué)樣品富集靶細(xì)胞的方法及除去白細(xì)胞的方法。具體地說，本發(fā)明提供一種從生物學(xué)樣品富集靶細(xì)胞的方法，該方法包括用基于摩爾滲透壓濃度的方式除去紅細(xì)胞和用免疫親和層析法除去白細(xì)胞。該方法不僅成本低，而且高效地去除白細(xì)胞和紅細(xì)胞，從而使靶細(xì)胞得以富集，并易于后續(xù)檢測(cè)。本發(fā)明還提供一種從生物學(xué)樣品除去白細(xì)胞的方法，該方法包括采用抗CD45抗體偶聯(lián)的Affi-Gel 10除去白細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12M1/12GK101469310SQ20071030741
公開日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者趙海峰 申請(qǐng)人:北京百奧科生物技術(shù)有限公司