專利名稱：一種增強(qiáng)靶細(xì)胞攝取治療劑的方法和藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種已有藥物的新用途，具體而言，本發(fā)明涉及一種通過(guò)促進(jìn)靶細(xì)胞對(duì)治療劑的攝取而提高其療效的方法和組合物，并具體涉及脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路調(diào)節(jié)劑與某些藥物(如抗腫瘤藥物)組成的藥物組合物。特別地，本發(fā)明還涉及篩選對(duì)抗腫瘤藥物具有增效作用的脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路調(diào)節(jié)劑的方法。
背景技術(shù)：
腫瘤的生長(zhǎng)和遷移依賴于新生血管/淋巴管的生成。因此，腫瘤新生血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞為癌癥治療提供了新的靶標(biāo)(Folkman, J. N Engl JMed 1971 ；285 =1182-1186,Witte MH et al. Lymphology. 1987 ；20(4) =257-66) 同時(shí)，肥胖癥、糖尿病型視網(wǎng)膜病、持續(xù)性玻璃體增生、牛皮癬、過(guò)敏性皮炎、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈硬化、子宮內(nèi)膜異位、哮喘、腹水、腹膜粘連等疾病也被證明與新生血管異常生成密切相關(guān)(Carmeliet P. , Nature Medicine2003 ；9(6) :653-660)。血管內(nèi)皮抑制素(endostatin，以下簡(jiǎn)稱ES)是膠原X VDI羧基端的一段分子量為20kDa的酶切產(chǎn)物，是一種內(nèi)源性血管/淋巴管生成抑制劑，具有抑制血管/淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，和抑制新生血管/淋巴管生成的活性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組血管內(nèi)皮抑制素在動(dòng)物模型中可以抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，而且不產(chǎn)生耐藥性(Folkman J. etal. Cell 1997 ；88 :277-285,Folkman J. et al. Nature 1997 ；390 :404-407,Zhuo W. et al,Journal of Pathology ;222 :249-260)。目前，有一種通過(guò)基因工程手段制備的重組人血管內(nèi)皮抑制素(商品名恩度，Endu)，與天然血管內(nèi)皮抑制素相比具有9個(gè)額外的N-末端氨基酸((M)GGSHHHHH)，已作為血管抑制劑類抗腫瘤藥物，在以非小細(xì)胞肺癌為主要適應(yīng)癥的臨床應(yīng)用中得到了廣泛的驗(yàn)證。研究顯示，ES會(huì)被腫瘤部位高度活躍的血管/淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞，但是具體機(jī)制尚不清楚。表皮生長(zhǎng)因子受體(EpithelialGrowth Factor Receptor,以下簡(jiǎn)稱 EGFR)在腫瘤細(xì)胞表面異常過(guò)量表達(dá)，并與癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，已有多個(gè)靶向EGFR的單克隆抗體成為抗腫瘤藥物?？笶GFR單克隆抗體西妥昔單抗是一個(gè)抗體類抗腫瘤藥物，能夠特異性地結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的EGFR。制霉菌素(nystatin，以下簡(jiǎn)稱NT)是一種多烯類抗生素，具有廣譜抗真菌作用，可以安全用于口腔含服或外用，且不與其他藥物發(fā)生相互作用。NT對(duì)念珠菌屬的抗菌活性高，新型隱球菌、曲菌、毛霉菌、小孢子菌、莢膜組織漿胞菌、皮炎芽生菌及皮膚癬菌通常對(duì)NT也敏感。NT也常用于易患真菌感染病人的預(yù)防，如AIDS患者或接受化療的患者。NT這一類藥物抗真菌的作用原理是能夠結(jié)合真菌細(xì)胞膜上的主要成分麥角固醇(ergosterol)，并最終造成真菌細(xì)胞膜的穿孔以及鉀離子泄露直至真菌死亡。由于麥角固醇是真菌細(xì)胞膜特有的脂類物質(zhì)，因此應(yīng)用于人體或動(dòng)物體時(shí)NT和AMB不會(huì)對(duì)真核細(xì)胞膜造成誤殺傷。
NT可在細(xì)胞水平上影響膽固醇相關(guān)的內(nèi)吞作用。在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是哺乳類細(xì)胞內(nèi)吞活動(dòng)的研究中，NT被廣泛用來(lái)作為脂後(lipid raft)-膜穴(caveolae)依賴型內(nèi)吞通路的抑制劑。其作用原理是脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞需要依靠細(xì)胞膜上的膽固醇(cholesterol)這一重要物質(zhì)，NT可以通過(guò)與膜上的膽固醇結(jié)合從而抑制這條內(nèi)吞通路。與NT作用原理相似的試劑還有兩性霉素B(amphotericin B),甲基化￠-環(huán)糊精(methyl-0-cyclodextrin)和菲律賓菌素(filipin)等,都會(huì)與細(xì)胞膜上的膽固醇結(jié)合抑制脂筏-膜穴內(nèi)吞通路。兩性霉素B (amphotericin B，以下簡(jiǎn)稱AMB)與NT作用機(jī)理相同，是目前臨床上治療隱球菌、曲霉菌等真菌感染的一種有效的多烯類廣譜抗真菌藥物。Wickstrom et al (2002, 2003)報(bào)道了在內(nèi)皮細(xì)胞膜上 ES 與 alpha5betal 型整合素(integrin alpha5betal)以及小窩蛋白(caveolin,是膜穴的組成蛋白)有相互作用，而且ES會(huì)與脂筏發(fā)生相互作用，揭示出在細(xì)胞膜上ES與脂筏-膜穴的相互關(guān)聯(lián)(Wickstromet al, Cancer Res. 2002 ；62 :5580-9, Wickstrom et al, J. Biol. Chem. 2003 ；278 (39)37895-37901)。另外，Dixelius et al (2000)，Shi et al (2007) Zhuo et al (2010)分別報(bào)道了 ES特異性的被血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞的過(guò)程(Dixelius et al, Blood 2000，95,3403-3411 ；Shi et al, Blood 2007,110,2899-2906, Zhuo ff. et al, Journal ofPathology ；222 :249-260)。 2002年，Pike et al和Roepstorff et al分別發(fā)現(xiàn)抑制膽固醇和脂後，可以增加EGFR的配體(表皮生長(zhǎng)因子，以下簡(jiǎn)稱“EGF”)在細(xì)胞表面的結(jié)合(Pike etal, Biochemistry 2002 ；41 10315-22, Roepstorff et al, J Biol Chem 2002 ；277 18954-60)。Kojic et al (2008)報(bào)道了腫瘤細(xì)胞通過(guò)脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞來(lái)攝取自分泌運(yùn)動(dòng)因子/磷酸葡糖異構(gòu)酶(AMF/PGI)，且這一內(nèi)吞過(guò)程具有細(xì)胞種屬特異性，脂筏-膜穴內(nèi)吞可能成為針對(duì)特定腫瘤細(xì)胞靶向藥物的給藥途徑(Kojic et al, PLoS ONE 2008 ；3 e3597) 0Migalovich et al (2009)報(bào)道了 NT通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞脂筏-膜穴內(nèi)吞從而增加了卵巢癌細(xì)胞對(duì)黃豆苷原-牛血清白蛋白(daidzein-BSA)的內(nèi)吞。黃豆苷原-牛血清白蛋白是一種潛在的腫瘤顯影劑，NT增加黃豆苷原-牛血清白蛋白在腫瘤細(xì)胞的內(nèi)吞可能會(huì)使這種腫瘤顯影劑發(fā)揮出更好的實(shí)用效果(Migalovich et al, Cancer Res. 2009 ;69 :5610-5617)。由此可見(jiàn)，脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞可能參與許多重要物質(zhì)如細(xì)胞因子、外源蛋白甚至藥物分子的內(nèi)吞，通過(guò)調(diào)節(jié)和控制此類內(nèi)吞可能在細(xì)胞水平上影響機(jī)體對(duì)這些物質(zhì)的攝取，具有應(yīng)用潛力。發(fā)明概述本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)ES可以借助脂後-膜穴(caveola/lipid raft pathway)和籠形蛋白包被小泡(clathrin-coated pits pathway)這兩條途徑被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞,如果用抑制劑NT干擾脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路，可以獲得提高藥物在血管/淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)吞攝取水平的意想不到的效果，并進(jìn)一步促進(jìn)ES對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活性、腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果。無(wú)意于受任何理論的限制，推測(cè)這一發(fā)現(xiàn)的原因可能為在脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路受到抑制的情況下，籠形蛋白包被小泡高效內(nèi)吞途徑代償性的活躍導(dǎo)致了總體內(nèi)吞攝取的增強(qiáng)。相似地，EGFR配體被報(bào)道具有與ES相似的內(nèi)吞機(jī)制。其中，EGFR單抗是一類有效的抗腫瘤藥物，通過(guò)結(jié)合到腫瘤細(xì)胞特有的EGFR起到抑制相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤增殖的療效。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，NT還可以通過(guò)影響脂筏依賴型內(nèi)吞，顯著增強(qiáng)抗腫瘤藥物EGFR單克隆抗體在癌細(xì)胞中的內(nèi)吞和積累，促進(jìn)EGFR單抗的療效，具有進(jìn)一步應(yīng)用于腫瘤治療和腫瘤顯像等領(lǐng)域的潛力。此外，與ES具有相似內(nèi)吞機(jī)制的還有endothelin receptor type A,cholera toxin, transforming growth factor-3 receptors, B cell antigen receptor,bone morphogenetic protein receptor, HM I. 24 以及 integrins 等，都具備與 NT 聯(lián)用產(chǎn)生增效作用的條件。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的調(diào)節(jié)劑在制備用于提高對(duì)象中靶細(xì)胞對(duì)治療劑的攝取的藥物組合物中的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供提高對(duì)象中靶細(xì)胞對(duì)治療劑的攝取的方法，其包括給所述個(gè)體施用脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的調(diào)節(jié)劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的調(diào)節(jié)劑，其用于提高對(duì)象中靶細(xì)胞對(duì)治療劑的攝取。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路調(diào)節(jié)劑與某些藥物(如抗 腫瘤藥物)組成的藥物組合物。在本發(fā)明的以上各方面的具體實(shí)施方式
中，所述脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的調(diào)節(jié)劑是脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的抑制劑，例如所述抑制劑是多烯類抗真菌藥(如制霉菌素或兩性霉素B)，或者所述抑制劑例如是甲基化3 -環(huán)糊精或菲律賓菌素。根據(jù)本發(fā)明，所述治療劑可以通過(guò)脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路和籠形蛋白包被小泡內(nèi)吞通路這兩條通路被靶細(xì)胞攝取。根據(jù)本發(fā)明，所述對(duì)象患有血管發(fā)生相關(guān)性疾病或淋巴管發(fā)生相關(guān)性疾病。根據(jù)本發(fā)明，所述對(duì)象患有腫瘤，例如肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、食道癌、鼻咽癌、惡性黑色素腫瘤、骨癌、淋巴癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、血管瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、口腔癌、肉瘤、腎癌或膽癌。 根據(jù)本發(fā)明，所述治療劑是血管或淋巴管生成抑制劑，例如血管內(nèi)皮抑制素或其衍生物，其中所述血管內(nèi)皮抑制素例如是天然血管內(nèi)皮抑制素或重組血管內(nèi)皮抑制素，例如重組人血管內(nèi)皮抑制素。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
，所述血管內(nèi)皮抑制素具有SEQID NO. USEQ IDN0. 2,SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
，所述血管內(nèi)皮抑制素衍生物是聚乙二醇(PEG)修飾的血管內(nèi)皮抑制素。優(yōu)選地，所述聚乙二醇(PEG)是平均分子量為5-40kD的單甲氧基聚乙二醇，例如是單甲氧基聚乙二醇丙醛。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述單甲氧基聚乙二醇丙醛的平均分子量是20kD，且聚乙二醇(PEG)修飾的位點(diǎn)是血管內(nèi)皮抑制素的N-末端的a -氨基。根據(jù)本發(fā)明，所述治療劑是能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
，所述抗體是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的抗體，例如EGFR單克隆抗體，EGFR單克隆抗體的實(shí)例是西妥昔單抗。在本發(fā)明的以上各方面的具體實(shí)施方式
中，所述脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的調(diào)節(jié)劑通過(guò)選自靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝動(dòng)脈注射的胃腸外途徑施用。優(yōu)選地，所述脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的調(diào)節(jié)劑被配制為脂質(zhì)體包埋的形式。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含前面所述的血管內(nèi)皮抑制素或者抗體，以及前面所述的脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的抑制劑。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及篩選對(duì)抗腫瘤藥物具有增效作用的脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路調(diào)節(jié)劑的方法。本發(fā)明還涉及與NT作用原理相似的藥物或試劑(如兩性霉素B)，和與ES或EGFR單抗作用機(jī)理或內(nèi)吞途徑相似的藥物試劑之間的聯(lián)合用藥方法、聯(lián)合制劑和藥物組合物。


圖IA-E NT及其同類試劑(兩性霉素B，甲基化@ -環(huán)糊精和菲律賓菌素)可以劑量依賴方式促進(jìn)ES及其衍生物和修飾物在內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞攝取。A :使用Western Blotting方法檢測(cè)出NT促進(jìn)了 ES在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞，且該促進(jìn)作用與NT的濃度正相關(guān)。這種促進(jìn)作用體現(xiàn)在ES內(nèi)吞后在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核組分，以及全細(xì)胞中的含量較沒(méi)有NT時(shí)顯著增加。
B :使用Western Blotting方法檢測(cè)出NT促進(jìn)了 ES在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞，且該促進(jìn)作用與NT的濃度正相關(guān)。C :使用Western Blotting方法檢測(cè)出兩性霉素B,甲基化0 -環(huán)糊精和菲律賓菌素也能夠促進(jìn)ES在內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞，且該促進(jìn)作用與NT的濃度正相關(guān)。D :使用Western Blotting方法檢測(cè)出NT也能夠促進(jìn)PEG化ES在內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞，且該促進(jìn)作用與NT的濃度正相關(guān)。E :使用Western Blotting方法檢測(cè)出NT也能夠促進(jìn)N-末端帶有附加氨基酸(M)GGSHHHHH的重組人血管內(nèi)皮抑制素(Endu)及N-末端被PEG單點(diǎn)修飾的Endu(PEG-Endu)在內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞，且該促進(jìn)作用與NT的濃度正相關(guān)。圖2 :使用Western Blotting方法檢測(cè)出ES與NT的聯(lián)合用藥通過(guò)增加ES在內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞，增強(qiáng)了 ES對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞ERK與p38MAPK信號(hào)通路的抑制效果。圖3A-B ES與NT聯(lián)合應(yīng)用抑制細(xì)胞遷移A :細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ES與NT的聯(lián)合用藥增強(qiáng)了 ES對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞活性的抑制效果，使得發(fā)生遷移的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目較沒(méi)有NT時(shí)進(jìn)一步減少。B :細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中遷移細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，反映了在不同藥物處理下內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。圖4A-E ES與NT聯(lián)合應(yīng)用抑制腫瘤生長(zhǎng)并改善ES在腫瘤組織中的分布A ES與NT的聯(lián)合用藥在A549肺癌動(dòng)物模型中能夠進(jìn)一步增強(qiáng)ES對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果。B :使用免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)ES與NT的聯(lián)合用藥能夠增強(qiáng)ES對(duì)于A549肺癌動(dòng)物模型中腫瘤組織新生血管生成的抑制效果。C ES與NT聯(lián)合用藥在H22肝癌動(dòng)物模型中能夠進(jìn)一步增強(qiáng)ES對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果。D :使用免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)ES與NT的聯(lián)合用藥能夠增強(qiáng)ES對(duì)于H22肝癌動(dòng)物模型中腫瘤組織新生血管生成的抑制效果。E :使用動(dòng)物熒光成像系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)ES與NT的聯(lián)合用藥能夠增強(qiáng)ES (帶有羅丹明熒光標(biāo)記)在荷瘤動(dòng)物腫瘤組織中的攝取和分布。圖5A-B NT促進(jìn)EGFR單抗進(jìn)入腫瘤細(xì)胞
A :使用Western Blotting方法檢測(cè)出NT促進(jìn)了 EGFR單抗在癌細(xì)胞中的內(nèi)吞。B :使用活體熒光標(biāo)記示蹤方法發(fā)現(xiàn)NT與EGFR單抗聯(lián)合用藥能夠加強(qiáng)EGFR單抗在小鼠移植腫瘤中的分布和攝取。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是提供多烯類廣譜抗生素NT及其同類藥物的一種新用途。同時(shí)，為ES和EGFR單抗等借助脂後-膜穴依賴型內(nèi)吞途徑(caveola/lipid raft pathway)和籠形蛋白包被小泡內(nèi)吞途徑(clathrin-coated pits pathway)這兩條途徑發(fā)生內(nèi)吞的蛋白藥物提供一種增強(qiáng)療效的新藥物組合物和新用藥方法。脂後(lipid raft)是質(zhì)膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域(microdomain)。鞘磷脂和鞘糖脂的飽和脂肪鏈緊密聚集，飽和脂肪鏈之間的空隙填滿了作為間隔分子的膽固醇，形成液態(tài)有序相(liquid-ordered phase,即脂後)，直徑大約在50nm左右。脂後是一 種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)分選均有密切關(guān)系。膜穴(也稱細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷，質(zhì)膜微囊，caveolae)是脂筏的一種結(jié)構(gòu)，具有和脂後一樣的膜脂組成，不含籠形蛋白(也稱網(wǎng)格蛋白，clathrin),含有caveolin(—種小分子量蛋白，21KD)。大量存在于脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等，與內(nèi)吞有關(guān)。另外，膜穴中還富含某些信號(hào)分子，說(shuō)明它與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)?；\形蛋白包被小泡(clathrin-coated pits)是籠形蛋白參與介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程中形成的一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。依賴于該種結(jié)構(gòu)的內(nèi)吞方式即稱為籠形蛋白包被小泡依賴型內(nèi)吞途徑。血管發(fā)生相關(guān)性疾病(Angiogenesis related diseases)和淋巴管發(fā)生相關(guān)性疾病(Lymphangiogenesis related diseases)即與血管和淋巴管異常生成密切相關(guān)的疾病，包括腫瘤，關(guān)節(jié)炎和牛皮癬等多種自身免疫性疾病，糖尿病，肥胖癥以及多種眼科疾病。本發(fā)明顯示，將脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的抑制劑NT與ES共同加入到血管內(nèi)皮細(xì)胞的液體培養(yǎng)環(huán)境中，可以顯著增強(qiáng)ES在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞，且這種增強(qiáng)效果與NT的濃度正相關(guān)。同時(shí)，我們?cè)诹馨凸軆?nèi)皮細(xì)胞中也觀察到了同樣的結(jié)果。基于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)事實(shí)，本發(fā)明還將NT的增效作用擴(kuò)展至與NT作用原理相似的其他藥物和試劑。如實(shí)施例I中所述，與NT作用原理相似的一類物質(zhì)，如兩性霉素B(AMB)、甲基化￠-環(huán)糊精(M3-CD)和菲律賓菌素(filipin)，也能夠增強(qiáng)ES在內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞。AMB與filipin也是已經(jīng)成藥的抗真菌抗生素，與NT同樣具有應(yīng)用于實(shí)際聯(lián)合用藥的潛力。與此相類似的，兩性霉素Wamphotericin B)，甲基化￠-環(huán)糊精(methyl-0-cyclodextrin)和菲律賓菌素(filipin)可以顯著增強(qiáng)ES在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞，且這種增強(qiáng)效果與上述多稀類抗生素的濃度正相關(guān)。同樣的，NT還可以顯著促進(jìn)PEG修飾的ES (PEG-ES)，N-末端帶有(M) GGSHHHHH附加氨基酸的ES (Endu)，以及N-末端被PEG單點(diǎn)修飾的Endu (PEG-Endu)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞，且這種增強(qiáng)效果與NT的濃度正相關(guān)。在分子細(xì)胞生物學(xué)水平上，本發(fā)明還通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了通過(guò)NT聯(lián)合用藥促進(jìn)ES在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞，并進(jìn)一步增強(qiáng)ES對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞存活相關(guān)信號(hào)通路(如ERK和P38MAPK)的抑制效果。在細(xì)胞水平上，本發(fā)明證明了 NT與ES的聯(lián)合用藥增強(qiáng)了 ES對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性的抑制效果。更進(jìn)一步地，在A549肺癌和H22肝癌的動(dòng)物腫瘤模型中，證明了 NT能夠增強(qiáng)ES對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)以及腫瘤新生血管生成的抑制效果。更進(jìn)一步的，NT還能夠增強(qiáng)ES在腫瘤組織中的攝取和分布。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，EGFR單抗藥物作為EGFR的配體，其內(nèi)吞的機(jī)制與ES有一定的相似性，它在腫瘤細(xì)胞中的內(nèi)吞也能夠被NT所調(diào)節(jié)。在分子細(xì)胞生物學(xué)水平上，本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明了通過(guò)NT聯(lián)合用藥促進(jìn)EGFR單抗在癌細(xì)胞中的內(nèi)吞。更進(jìn)一步地，本發(fā)明還通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了 NT與EGFR單抗的聯(lián)合用藥促進(jìn)了 EGFR單抗在小鼠移植腫瘤中的分布和攝取。因此，本發(fā)明公開(kāi)了 NT這個(gè)現(xiàn)有的抗真菌抗生素藥物的一種新用途，即通過(guò)聯(lián)合用藥的方式促進(jìn)了現(xiàn)有抗腫瘤藥物ES或EGFR單抗的攝入和藥效，具有進(jìn)一步應(yīng)用于腫瘤治療和腫瘤顯像等領(lǐng)域的潛力。用高分子聚合物對(duì)蛋白進(jìn)行修飾，是改變和控制藥物的動(dòng)力學(xué)特性如半衰期、免 疫學(xué)特征、毒理特性的常用方法。其中聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是應(yīng)用最為普遍的一種蛋白修飾分子。本實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)PEG(單甲氧基聚乙二醇丙醛)進(jìn)行N-末端a -氨基定點(diǎn)修飾的ES蛋白及其衍生物Endu在內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞也因NT聯(lián)合用藥而顯著增加。這一事實(shí)為NT與修飾、標(biāo)記的ES或其衍生物聯(lián)合用藥達(dá)到增效目的的用藥方法提供了理論依據(jù)?；诹硪徊糠謱?shí)驗(yàn)事實(shí)，本發(fā)明還將聯(lián)合用藥的適用范圍擴(kuò)展至其他與ES具有相似內(nèi)吞途徑和作用機(jī)理的藥物，包括EGFR單抗和經(jīng)過(guò)修飾、標(biāo)記的基于EGFR單抗的分子等能夠靶向腫瘤或腫瘤血管并用于治療或顯像用途的物質(zhì)，也可因?yàn)镹T等多烯類試劑的聯(lián)合用藥而促進(jìn)藥物攝取和效果。本發(fā)明還涉及一種NT (或AMB等)與ES聯(lián)合用藥的新劑型和藥物組合物。ES應(yīng)用于腫瘤治療中的給藥方式為靜脈滴注。NT屬多烯類廣譜抗真菌抗生素，難溶于水，口服后胃腸道不易吸收，直接注射用藥毒性較大。不過(guò)，有研究表明，NT可通過(guò)脂質(zhì)體包埋方法實(shí)現(xiàn)靜脈滴注給藥，例如Aronex公司的NT脂質(zhì)體劑型Nyotran已于1999年完成III期臨床試驗(yàn)，有望近年上市，這將使NT實(shí)現(xiàn)靜脈滴注的給藥方式。AMB與NT同屬于多烯類廣譜抗真菌抗生素，作用機(jī)理完全相同。迄今為止，已有3種兩性霉素B脂質(zhì)體劑型藥物在歐美上市(商品名分別為Abelcet、Amphocil和AmBisome),實(shí)現(xiàn)了這一類難溶性抗生素的靜脈滴注給藥。另一種兩性霉素B脂質(zhì)體靜脈滴注液也于2003年上市，商品名為鋒克松。因此，結(jié)合脂質(zhì)體劑型和靜脈滴注給藥來(lái)制備ES或EGFR單抗與NT或AMB等聯(lián)合用藥的新劑型或新的藥物組合物是完全可行的。
實(shí)施例實(shí)施例I :NT促進(jìn)了 ES在血管及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞和攝取。人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC) (ATCC保藏號(hào)分別為CRL 10636)，應(yīng)用不完全弗氏佐劑誘導(dǎo)小鼠形成腹腔淋巴管瘤，消化法分離獲得鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞mLEC(Zhuo ff. et al, Zhuoff. et al, Journal of Pathology ；222 :249-260), Endu(SEQ ID NO. 3 或 SEQ ID NO. 4, BPN末端具有9個(gè)額外的氨基酸(M)GGSHHHHH的ES，其中第一個(gè)氨基酸M在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)可發(fā)生隨機(jī)刪除)(先聲麥得津公司)，ES (SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2，其中第一個(gè)氨基酸M在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)可發(fā)生隨機(jī)刪除)(Protgen),特異性修飾蛋白N-末端a-氨基的PEG試劑采用20kD的單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)(北京鍵凱科技有限公司)，PEG-ES及PEG-Endu由Protgen公司按照所用PEG試劑說(shuō)明書(shū)提示制備，ES單克隆抗體購(gòu)自O(shè)ncogene公司，NT及其他試劑均購(gòu)自Sigma Aldrich公司。待血管內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至密度約90%時(shí)，更換為含有NT的DMEM培養(yǎng)基(Hyclone):將NT儲(chǔ)液加入到培養(yǎng)基中，至一定終濃度(0 u g/ml, 25 u g/ml, 50 u g/ml)，于37°C ,5%C02培養(yǎng)箱中靜置20min進(jìn)行NT預(yù)處理；預(yù)處理之后將濃度為5mg/ml的ES儲(chǔ)液加入培養(yǎng)基，至終濃度5 u g/ml，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置30min使ES被血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞。內(nèi)吞結(jié)束時(shí)棄培養(yǎng)基，用冰PBS洗3次，收集內(nèi)皮細(xì)胞。使用Western Blotting方法，檢測(cè)全細(xì)胞裂解液、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核等組分中ES的攝入水平，與沒(méi)有NT共同處理的細(xì)胞中ES內(nèi)吞量進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在ES劑量相同、內(nèi)吞時(shí)間相同的情況下，全細(xì)胞裂解液、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核組分中ES的含量均因NT的聯(lián)合使用而顯著增加，25 ii g/ml及50 y g/ml的NT分別可使ES內(nèi)吞攝取量提高約2倍和15倍，且ES內(nèi)吞增加的幅度與所用NT的濃度正相關(guān)(圖1A)。 用分別含有NT濃度為0，75，150和300 u g/ml的培養(yǎng)基于37°C對(duì)mLEC細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理30min，然后在37°C條件下用含有ES濃度為g/ml的培養(yǎng)液孵育15min，用PBS清洗三遍，收細(xì)胞。利用Western blotting對(duì)不同濃度NT處理的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行ES內(nèi)吞測(cè)定，結(jié)果顯示75，150和300 u g/ml的NT可分別使ES在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞量提高約16，32和78倍，且ES內(nèi)吞增加的幅度與所用NT的濃度正相關(guān)(圖1B)。在本實(shí)施例中，NT還可以被替換為與NT作用機(jī)理相同的藥物，如兩性霉素B (25-50 u g/ml)，甲基化P -環(huán)糊精(l_2mM)和菲律賓菌素(2. 5-5 u g/ml)，都能夠促進(jìn)ES在內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞(圖1C)。在本實(shí)施例中，ES還可以被替換為與ES內(nèi)吞機(jī)理相同的藥物，如PEG化修飾的 ES。使用分子量為20kDa的特異性修飾蛋白N-末端的聚乙二醇修飾試劑(單甲氧基聚乙二醇并醛，mPEG-ALD)來(lái)修飾ES，其產(chǎn)物(簡(jiǎn)稱PEG-ES)為一個(gè)聚乙二醇分子與一個(gè)重組人內(nèi)皮抑制素相連，連接位點(diǎn)為蛋白的N-末端a-氨基的蛋白。結(jié)果表明，在PEG-ES劑量相同、內(nèi)吞時(shí)間相同的情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于PEG-ES的內(nèi)吞也由于NT的聯(lián)合使用而顯著增加，而且PEG-ES內(nèi)吞增加的幅度與所用NT的濃度正相關(guān)(圖1D)。在另一種ES的衍生物Endu的內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)中也觀察到了類似的結(jié)果，即在Endu及其N-末端a -氨基單一定點(diǎn)PEG修飾產(chǎn)物PEG-Endu劑量相同、內(nèi)吞時(shí)間相同的情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于Endu及PEG-Endu的內(nèi)吞也由于NT的聯(lián)合使用而顯著增加，而且Endu及PEG-Endu內(nèi)吞增加的幅度與所用NT的濃度正相關(guān)(圖1E)。實(shí)施例2 :NT增加了 ES在內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)吞，從而增強(qiáng)了 ES對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)通路的抑制作用。Kim et al (2002)發(fā)現(xiàn)ES在內(nèi)皮細(xì)胞中可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,簡(jiǎn)稱ERK)、p38促分裂素原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,簡(jiǎn)稱p38MAPK)和 pl25 局部粘著斑激酶(pl25focal adhesion kinase,簡(jiǎn)稱pl25FAK)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而發(fā)揮抑制內(nèi)皮細(xì)胞的活性(Kim et al，J. Biol. Chem. 2002，277，27872—27879)。本實(shí)施例選用 ERK 和 p38 MAPK 這兩條信號(hào)通路作為檢測(cè)指標(biāo)，NT的聯(lián)合使用進(jìn)一步增強(qiáng)了 ES對(duì)于這些信號(hào)通路的抑制作用。本實(shí)施例中，內(nèi)皮細(xì)胞被分成四組加以不同處理。第一組陰性對(duì)照組，無(wú)NT處理，也無(wú)ES處理；第二組，NT處理組，只有NT(50ii g/ml，20min)處理，無(wú)ES處理；第三組，ES處理組，無(wú)NT處理，只有ES(5ii g/ml，30min)處理；第四組，NT與ES聯(lián)合用藥組，NT (50 y g/ml，先于ES 20min加入)和ES (5 y g/ml，30min)聯(lián)合處理。按實(shí)施例I中的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行NT或ES相應(yīng)處理，收集細(xì)胞，檢測(cè)ERK和p38MAPK信號(hào)通路。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相t匕，第二組僅用NT處理不會(huì)影響ERK和p38MAPK信號(hào)的水平；第三組ES處理抑制了 ERK和P38MAPK信號(hào)通路，與Kim et al的報(bào)道相符；第四組NT和ES聯(lián)合用藥增加了 ES的內(nèi)吞，并進(jìn)一步增強(qiáng)了 ES對(duì)ERK和p38MAPK信號(hào)通路的抑制作用。這證明了 NT的聯(lián)合用藥進(jìn)一 步增強(qiáng)了 ES對(duì)細(xì)胞活化信號(hào)通路的抑制作用(圖2)。實(shí)施例3 NT增強(qiáng)了 ES對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制效果。細(xì)胞遷移的測(cè)定方法內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC，每孔2父104個(gè)細(xì)胞)接種到TranswellTM板(8 u m孔徑,Costar)的上層含 0. 5%胎牛血清(Hyclone)以及 10ng/ml VEGF(PeproTechEC)的DMEM(Hyclone)培養(yǎng)基中。同時(shí)在板的上層和下層加入一定濃度的ES(40 y g/ml)或NT (50 u g/ml)，在37°C和5% CO2中繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)使細(xì)胞遷移。用戊二醛固定和結(jié)晶紫染色后，每個(gè)孔隨機(jī)選取5個(gè)高倍放大(400倍)視野(Olympus 1X71),計(jì)算其中完全穿過(guò)膜遷移到板下層的細(xì)胞數(shù)并取平均值，每一組平行三個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。本實(shí)施例中，內(nèi)皮細(xì)胞也被分成四組加以不同處理。第一組陰性對(duì)照組，無(wú)NT處理，也無(wú)ES處理；第二組，NT處理組，只有NT (50 ii g/ml)處理，無(wú)ES處理；第三組，ES處理組，無(wú)NT處理，只有ES (40 u g/ml)處理；第四組，NT與ES聯(lián)合用藥組，NT (50 u g/ml)和ES(40 u g/ml)聯(lián)合處理。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，第二組僅用NT處理，基本不影響內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力；第三組ES處理能抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移，減少了內(nèi)皮細(xì)胞遷移到下層膜的數(shù)量，抑制率為61%;第四組NT和ES聯(lián)合用藥，增強(qiáng)了 ES對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用，發(fā)生遷移的細(xì)胞很少，抑制率為87% (相對(duì)于ES組結(jié)果，P < 0.001)。上述結(jié)果說(shuō)明，NT增強(qiáng)了 ES對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用。各處理組遷移細(xì)胞代表性視野(圖3A)，各處理組遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值比較(圖3B)。實(shí)施例4 NT能夠在動(dòng)物模型中增強(qiáng)ES對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)和新生血管生成的抑制作用，并促進(jìn)ES在腫瘤組織中的攝取和分布。培養(yǎng)處于旺盛增殖狀態(tài)的人源肺腺癌A549細(xì)胞(ATCC保藏號(hào)為CCL-185)接種至6 8周齡的裸鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)皮下。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到IOOmm3左右時(shí)，將荷瘤裸鼠分為四組進(jìn)行不同的給藥處理。第一組陰性對(duì)照，生理鹽水處理組；第二組，NT給藥組,只有NT (6mg/kg,腹腔注射,每天一次)給藥處理，無(wú)ES給藥處理；第三組，ES給藥組，無(wú)NT給藥處理，只有ES (12mg/kg,腹腔注射，每天一次)給藥處理；第四組，NT與ES聯(lián)合用藥組，NT (6mg/kg,腹腔注射，每天一次)和ES (12mg/kg,腹腔注射，每天一次)聯(lián)合給藥。給藥兩周后，裸鼠被處死，稱腫瘤并比較腫瘤體積。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，第二組僅用NT給藥處理對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用；第三組ES處理能抑制腫瘤生長(zhǎng)，抑瘤率約40% ;第四組NT和ES聯(lián)合用藥，增強(qiáng)了 ES對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，抑瘤率提高到60%左右。這說(shuō)明在動(dòng)物模型中，NT能夠顯著增強(qiáng)ES的抑瘤活性(圖4A)。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重、進(jìn)食和日?；顒?dòng)均未發(fā)生異常改變。腫瘤內(nèi)血管發(fā)生水平的檢測(cè)方法所有四組的裸鼠的腫瘤被取出、固定、切片。使用抗⑶31 (腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志分子)的一抗以及FITC標(biāo)記的二抗(Santa Cruz)檢測(cè)，在Nikon Al激光掃描共聚焦成像系統(tǒng)下觀察(Nikon Inc.)。各組腫瘤隨機(jī)選取高倍放大(400倍)視野，使用顯微鏡系統(tǒng)自帶軟件計(jì)算各個(gè)視野中血管截面積并取平均值進(jìn)行比較。NT增強(qiáng)ES抑制腫瘤組織新生血管生成活性的作用與其增強(qiáng)ES抑瘤活性的作用相類似。各處理組腫瘤平均重量比較(圖4A)，各處理組腫瘤組織平均血管面積(相對(duì)單位，arbitrary unit)比較(圖 4B)NT顯著增強(qiáng)ES抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤新生血管生成活性的作用在H22肝癌的動(dòng)物模型中也得到了驗(yàn)證。各處理組腫瘤平均重量比較(圖4C)，各處理組腫瘤組織平均血管面 積(相對(duì)單位,arbitrary unit)比較(圖4D)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重、進(jìn)食和日?；顒?dòng)均未發(fā)生異常改變。熒光標(biāo)記ES在荷瘤小鼠的腫瘤組織中攝取和分布的檢測(cè)方法培養(yǎng)處于增殖狀態(tài)的人源肺腺癌A549細(xì)胞接種至6 8周齡的裸鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)皮下。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到300mm3左右時(shí)給藥。荷瘤裸鼠分為兩組進(jìn)行不同的給藥處理(每組四只)。第一組ES給藥組，無(wú)NT給藥處理，只有羅丹明(Pierce)熒光標(biāo)記ES (劑量20mg/kg)腹腔注射給藥；第二組，NT與ES聯(lián)合用藥組，NT (6mg/kg，腹腔注射)和羅丹明熒光標(biāo)記ES (20mg/kg,腹腔注射)聯(lián)合給藥。給藥4小時(shí)后，取出腫瘤組織，利用動(dòng)物熒光成像系統(tǒng)(清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系)對(duì)腫瘤中熒光標(biāo)記ES的攝取量進(jìn)行顯像與定量分析。NT增強(qiáng)了 ES在動(dòng)物腫瘤組織中的攝取和分布，增幅達(dá)到4倍(圖4E)。實(shí)施例5 :NT能夠顯著增加EGFR單抗(西妥昔單抗)在腫瘤細(xì)胞中的內(nèi)吞和在動(dòng)物腫瘤組織中的攝取和分布。本實(shí)施例中選用表達(dá)EGFR的人源肺腺癌A549細(xì)胞，待其貼壁生長(zhǎng)至密度約90%時(shí)，更換為含有NT的DMEM培養(yǎng)基將NT儲(chǔ)液加入到培養(yǎng)基中，至一定終濃度(0 u g/ml,25 u g/ml, 50 u g/ml)，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置20min進(jìn)行NT預(yù)處理；預(yù)處理之后將濃度為5mg/ml的EGFR單抗(西妥昔單抗，Merck公司)儲(chǔ)液加入培養(yǎng)基,至終濃度5 y g/ml，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置30min使EGFR單抗被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞；內(nèi)吞結(jié)束時(shí)棄培養(yǎng)基，用冰PBS洗3次，收集內(nèi)皮細(xì)胞。使用Western Blotting方法，檢測(cè)細(xì)胞組分中EGFR單抗的攝入水平，與沒(méi)有NT共同處理的細(xì)胞中EGFR單抗內(nèi)吞量進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在EGFR單抗劑量相同、內(nèi)吞時(shí)間相同的情況下，細(xì)胞中EGFR單抗的內(nèi)吞量因NT的聯(lián)合使用而顯著增加，即NT能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)EGFR單抗的內(nèi)吞，而且EGFR單抗內(nèi)吞量增加的幅度與所用NT的濃度正相關(guān)(圖5A)。培養(yǎng)處于增殖狀態(tài)的人源肺腺癌A549細(xì)胞接種至6 8周齡的裸鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)皮下，分兩組，每組4只。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到500_3左右時(shí)，一組小鼠給以熒光(Cy5. 5，GE公司)標(biāo)記的EGFR單抗，另一組小鼠給以熒光標(biāo)記的EGFR單抗(與前一組劑量相等)加上NT的聯(lián)合用藥。使用熒光成像系統(tǒng)(清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系)對(duì)這兩組取出的小鼠腫瘤中EGFR單抗的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，證明NT可增強(qiáng)EGFR單抗在腫瘤組織中的攝取和分布，有促進(jìn)藥物攝取、提高療效和用于腫瘤成像研究的作用(圖5B)。
權(quán)利要求
1.脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的調(diào)節(jié)劑在制備用于提高對(duì)象中靶細(xì)胞對(duì)治療劑的攝取的藥物組合物中的用途。
2.權(quán)利要求I的用途，其中所述脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的調(diào)節(jié)劑是脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的抑制劑。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的抑制劑是多烯類抗真菌藥。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的抑制劑選自制霉菌素和兩性霉素B。
5.權(quán)利要求2的用途，其中所述脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的抑制劑是甲基化￠-環(huán)糊精或菲律賓菌素。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的用途，其中所述治療劑可以通過(guò)脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路和籠形蛋白包被小泡內(nèi)吞通路這兩條通路被靶細(xì)胞攝取。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的用途，其中所述對(duì)象患有血管發(fā)生相關(guān)性疾病或淋巴管發(fā)生相關(guān)性疾病。
8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的用途，其中所述對(duì)象患有腫瘤。
9.權(quán)利要求7或8的用途，其中所述治療劑是血管或淋巴管生成抑制劑。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述血管或淋巴管生成抑制劑是選自天然血管內(nèi)皮抑制素和重組人血管內(nèi)皮抑制素的一種血管內(nèi)皮抑制素或其衍生物。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述血管內(nèi)皮抑制素具有SEQID NO. I或SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求10的用途，其中所述血管內(nèi)皮抑制素是N-末端帶有附加氨基酸序列(M)GGSHHHHH的血管內(nèi)皮抑制素，具有SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的用途，其中所述血管內(nèi)皮抑制素衍生物是聚乙二醇(PEG)修飾的血管內(nèi)皮抑制素。
14.權(quán)利要求13的用途，其中所述聚乙二醇(PEG)是平均分子量為5-40kD的單甲氧基聚乙二醇。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述單甲氧基聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇丙醛。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述單甲氧基聚乙二醇丙醛的平均分子量是20kD。
17.權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的用途，其中聚乙二醇(PEG)修飾的位點(diǎn)是血管內(nèi)皮抑制素的N-末端的a -氨基。
18.權(quán)利要求8的用途，其中所述治療劑是能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。
19.權(quán)利要求18的用途，其中所述抗體是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的抗體。
20.權(quán)利要求18的用途，其中所述抗體是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的單克隆抗體。
21.權(quán)利要求18的用途，其中所述表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的單克隆抗體是西妥昔單抗。
22.權(quán)利要求8-21中任一項(xiàng)的用途，其中所述腫瘤選自肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、食道癌、鼻咽癌、惡性黑色素腫瘤、骨癌、淋巴癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、血管瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、口腔癌、肉瘤、腎癌和膽癌。
23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的用途，其中所述脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的調(diào)節(jié)劑通過(guò)選自靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝動(dòng)脈注射的胃腸外途徑施用。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的調(diào)節(jié)劑被配制為脂質(zhì)體包埋的形式。
25.一種藥物組合物，其包含 (a)權(quán)利要求10-17中任一項(xiàng)所定義的血管內(nèi)皮抑制素或者權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)所定義的抗體，和 (b)權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所定義的脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過(guò)促進(jìn)靶細(xì)胞對(duì)治療劑的攝取而提高其療效的方法和組合物，所述的組合物含有脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的調(diào)節(jié)劑，所述治療劑例如為抗腫瘤藥物。本發(fā)明也涉及含有脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路的調(diào)節(jié)劑和治療劑的藥物組合物。本發(fā)明還涉及篩選對(duì)抗腫瘤藥物具有增效作用的脂筏-膜穴依賴型內(nèi)吞通路調(diào)節(jié)劑的方法。
文檔編號(hào)A61K45/00GK102698270SQ201110085338
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者付彥, 常國(guó)棟, 羅永章, 賈琳, 陳陽(yáng) 申請(qǐng)人:北京普羅吉生物科技發(fā)展有限公司, 清華大學(xué)