專利名稱：：其上設(shè)置有定位分子的器件及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有選定的活性化學(xué)區(qū)域的基板的方法，通過利用基板的各元件來幫助活性化學(xué)基團(tuán)在期望的基板區(qū)域中的定位。描述了各種方法，包括用于沉積、去除、激活和/或滅活在基板選定區(qū)域中的化學(xué)基團(tuán)的光學(xué)、化學(xué)和/或機(jī)械過程，以提供基板的選定活性區(qū)域。
背景技術(shù)：
：許多分析操作都會(huì)受益于對(duì)單個(gè)分子、相對(duì)少量分子、或較低濃度分子的反應(yīng)進(jìn)行分析的能力。已描述了許多方法用于提供這些散在的反應(yīng)混合物。例如，在核酸測(cè)序領(lǐng)域，許多研究者建議聯(lián)合聚合酶的作用下的核酸的模板依賴性合成，由單個(gè)分子或低濃度方法來獲取序列信息。這些測(cè)序技術(shù)的各種不同方法提供了一次監(jiān)測(cè)僅僅一種或很少的合成反應(yīng)的不同方法。例如，在一些情況下，將反應(yīng)混合物分配成包含低濃度反應(yīng)物的液滴。在其他應(yīng)用中，將一些反應(yīng)物固定在表面上，從而監(jiān)測(cè)它們而不會(huì)受到溶液中其他反應(yīng)組分的干擾。在另一種方法中，采用光學(xué)限制技術(shù)，在光限制區(qū)域內(nèi)，僅由相對(duì)少量的反應(yīng)(例如單個(gè)分子)來探究信號(hào)信息。盡管可獲得上述技術(shù)，仍然存在需要進(jìn)一步提高用于分析的反應(yīng)組分的選擇性的情況。本發(fā)明滿足了這些和許多需要。發(fā)明概述本發(fā)明一般提供了在基板的選定區(qū)域內(nèi)提供功能性表面修飾(例如活性化學(xué)基團(tuán))的方法，提供了由此制備的基板以及這種基板的應(yīng)用。第一方面，本發(fā)明提供了制備其上具有選定活性區(qū)域的基板。該方法包括提供其上具有許多納米結(jié)構(gòu)的基板，其中，每個(gè)納米結(jié)構(gòu)限制第一激活控制劑在基板表面的選定部分上提供活性化學(xué)基團(tuán)的能力。然后使該基板與至少第一激活控制劑接觸，以在基板表面的選定部分上選擇性地提供活性化學(xué)基團(tuán)?；钚曰瘜W(xué)基團(tuán)包括例如化學(xué)官能團(tuán)，活性分子(例如酶)以及偶聯(lián)基團(tuán)或結(jié)合基團(tuán)。在另一相關(guān)方面，本發(fā)明提供了制備其上具有選定活性區(qū)域的分析用基板的方法。該方法包括提供其上設(shè)置有光學(xué)分析結(jié)構(gòu)的基板，所述光學(xué)分析結(jié)構(gòu)提供通往基板選定區(qū)域的增強(qiáng)的光學(xué)通路。然后提供能夠通過第一電磁輻射被激活或滅活的表面官能團(tuán)，所述電磁輻射導(dǎo)向基板，從而使光學(xué)分析結(jié)構(gòu)介導(dǎo)電磁輻射，以選擇性地激活或滅活在基板選定區(qū)域中的表面官能團(tuán)以選擇性地提供基板活性區(qū)域。本發(fā)明另一方面的特征在于提供一種方法，該方法提供活性化學(xué)表面基本上在波導(dǎo)的底部的零模式波導(dǎo)。該方法包括提供設(shè)置在基板中的零模式波導(dǎo)，提供在零模式波導(dǎo)表面上的化學(xué)官能團(tuán)，以及使零模式波導(dǎo)表面上的第一部分而非第二部分與激活控制劑接觸，所述激活劑選擇性地激活或滅活在第一部分上的化學(xué)官能團(tuán)，以提供基本上在零模式波導(dǎo)底部的活性化學(xué)表面。本發(fā)明還提供了采用這種方法制備的基板和裝置，其包括零模式波導(dǎo)陣列，該陣列包括許多位于包層中的零模式波導(dǎo)芯體以及基本上只位于芯體中的化學(xué)活性表面，所述各芯體具有底面。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生其上設(shè)置有選定活性區(qū)域的基板的方法，該方法包括提供其上具有光學(xué)增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的基板，所述光學(xué)增強(qiáng)結(jié)構(gòu)能夠?qū)腚姶泡椛洌?3以在基板的選定區(qū)域近端提供增強(qiáng)的電磁場(chǎng)，足以在選定區(qū)域近端產(chǎn)生俘獲力(trappingforce)。電磁輻射導(dǎo)向基板以在選定區(qū)域提供增強(qiáng)的電磁場(chǎng)，該電磁場(chǎng)足以對(duì)選定區(qū)域近端的活性分子產(chǎn)生俘獲力。然后活性分子偶聯(lián)于該選定區(qū)域。本發(fā)明還提供了制備其上設(shè)置有選定活性區(qū)域的基板的方法，該方法包括提供表面具有化學(xué)官能團(tuán)和許多離散的納米級(jí)反應(yīng)區(qū)域的基板，和使一個(gè)或多個(gè)化學(xué)官能團(tuán)或激活控制劑在選定區(qū)域的表面上圖案化，以提供基本上僅在離散的納米級(jí)反應(yīng)區(qū)域中的化學(xué)功能性區(qū)域。本發(fā)明的另一方面提供了鑒別核酸分子序列的方法。該方法包括在基板上的離散觀察區(qū)域內(nèi)提供多種核酸聚合酶/模板/引物復(fù)合物，以及以模板依棘性方式檢測(cè)核苷酸或核苷酸類似物的序列增加，以鑒別結(jié)合到多個(gè)觀察區(qū)域中的核苷酸或核苷酸類似物的序列。在該方法中，基板被構(gòu)造成能顯著減少觀察區(qū)域之外的區(qū)域中的聚合酶活性、聚合酶存在、模板存在及引物存在中的一種或多種情況。相關(guān)地，本發(fā)明提供了鑒別核酸分子序列的方法，該方法包括在基板表面離散的觀察區(qū)域內(nèi)提供多種核酸聚合酶/模板/引物復(fù)合物，以及以模板依賴性方式檢測(cè)核苷酸或核苷酸類似物的序列增加，以鑒別結(jié)合到多個(gè)觀察區(qū)域中的核苷酸或核苷酸類似物的序列。在該方法中，基板表面上至少第一和第二離散觀察區(qū)域之間提供觀察區(qū)域內(nèi)屏障，以基本上避免一種或多種反應(yīng)物或產(chǎn)物在觀察區(qū)域內(nèi)擴(kuò)散。本發(fā)明還提供了使期望的分子優(yōu)先定位在基板上設(shè)置的光限制區(qū)內(nèi)的方法。該方法包括將期望的分子沉積在基板表面上，和選擇性地去除不在光限制區(qū)內(nèi)的基板表面上的期望分子。一方面，基板包括不透明(非透明性)層和透明層，光限制區(qū)包括設(shè)置穿過不透明層至透明層的零模式波導(dǎo)。從基板不在光限制區(qū)內(nèi)的表面選擇性地去除期望分子任選地包括使所述基板與偶聯(lián)排他性組分(exclusionarycomponent)的滅活組分相接觸，所述排他性組分至少部分地被排斥而不能進(jìn)入光限制區(qū)。滅活組分去除可從表面(例如零模式波導(dǎo)芯體的上表面和上壁)接近的分子；由于排他性組分而不能進(jìn)入光限制區(qū)，或光限制區(qū)實(shí)體。在一類實(shí)施方式中，滅活組分包括酶，例如蛋白酶(例如非特異性和位點(diǎn)特異性蛋白酶)、核酶或糖酶。排他性組分任選地是大顆粒如珠、大分子、或剛性或半剛性的長(zhǎng)形聚合物。在一類實(shí)施方式中，排他性組分包括雙鏈核酸分子，例如偶聯(lián)于蛋白酶滅活組分的雙鏈DNA分子。能選擇性地固定的期望分子可以是基本上任何分子，例如活性分子如酶(例如，核酸聚合酶)或包含結(jié)合或偶聯(lián)部分的分子(例如生物素分子)，又可利用這些分子來固定其他分子。進(jìn)一步提供了將分子定位到設(shè)置在基板上的光限制區(qū)內(nèi)的方法，該方法包括在基板表面上，包括光限制區(qū)內(nèi)提供光活化的偶聯(lián)基團(tuán)。然后使活化輻射導(dǎo)向基板，其中，光限制區(qū)使活化輻射僅入射在光限制區(qū)內(nèi)。然后，分子與光活化偶聯(lián)基團(tuán)偶聯(lián)。本發(fā)明的另一方面提供了將感興趣的分子選擇性地固定在基板上的方法。該方法包括提供基板，它具有第一表面組分和第二表面組分，所述第一和第二表面組分具有不同的表面特征，以及基于第一表面組分的表面特征與第二表面組分的表面特征之間的差異，使感興趣的分子選擇性地偶聯(lián)于第一表面組分。在一類實(shí)施方式中，不同的表面特征包括表面電荷或表面上的靜電相互作用。例如，第一表面組分具有或獲得負(fù)表面電荷，而第二表面組分為正表面電荷(反之亦然)。另一個(gè)例子中，表面組分具有不同的表面化學(xué)吸附特征；例如，第二表面組分對(duì)特定基團(tuán)(例如，膦酸鹽/酯(phosphonate)或磷酸鹽/酯(phosphate)基團(tuán))具有強(qiáng)化學(xué)親和力，而第一表面組分對(duì)該基團(tuán)沒有強(qiáng)的親和力。可采用該方法將感興趣的分子選擇性地固定在諸如ZMW或其他復(fù)合基板(hybridsubstrate)上。因此，例如，基板可任選地包括在第一表面組分層上的第二表面組分層，設(shè)置的零模式波導(dǎo)穿過第二表面組分層到達(dá)第一表面組分層。在這種實(shí)施方式中(及其他)，第一表面組分可包括Si02和/或第二表面組分可包括金屬或金屬氧化物(例如，鋁或氧化鋁)。在復(fù)合基板與溶液相接觸的實(shí)施方式中，基板可包括第一表面組分和/或第二表面組分，第一表面組分的材料的零電荷點(diǎn)在溶液的pH以下(例如，Si02的pH》)，第二表面組分包括金屬氧化物，其零電荷點(diǎn)在溶液的pH之上(例如氧化鋁pH<8;中性pH下帶正電的其他金屬氧化物，包括但不限于氧化鉈、氧化鐵、氧化釔、氧化鋅、氧化鑭和氧化鎂)。在某些實(shí)施方式中，感興趣的分子優(yōu)選與第一表面組分締合。例如，正電荷的聚合酶分子優(yōu)先與負(fù)電荷硅酸鹽締合而不是正電荷金屬表面。在其他實(shí)施方式中，基板與第一組合物相接觸，基于第一和第二表面組分的表面特征之間的差異，第一組合物選擇性地與第一表面組分締合。第一組合物可起阻斷作用，或者它可直接或間接與感興趣的分子締合。因此，例如，在一類實(shí)施方式中，第一組合物包含第一偶聯(lián)基團(tuán)，使感興趣的分子選擇性地偶聯(lián)于第一表面組分包括使感興趣的分子與第一偶聯(lián)基團(tuán)(例如，化學(xué)官能團(tuán)、結(jié)合基團(tuán)如生物素等)偶聯(lián)。在一類實(shí)施方式中，第一組合物包含硅烷，例如用于選擇性地與硅酸鹽第一表面組分締合。示例性的硅烷包括但不限于生物素-PEG-硅垸。在另一類實(shí)施方式中，第一組合物包含磷脂。在另一類實(shí)施方式中，第一組合物包含多聚賴氨酸-PEG或多聚賴氨酸-PEG-生物素。該方法任選地包括使基板與第二組合物相接觸，根據(jù)第一表面組分和第二表面組分的表面特征之間的差異，第二組合物選擇性地與第二表面組分締合。用第二組合物處理可任選地在使感興趣的分子與第一表面組分偶聯(lián)之前或之后進(jìn)行，包括用任何第一組合物處理之前或之后。在一些實(shí)施方式中，第二組合物包含通常不同于任何第一偶聯(lián)基團(tuán)的第二偶聯(lián)基團(tuán)。示例性的第二組合物包括例如聚電解質(zhì)和聚電解質(zhì)-PEG-共聚物。該方法任選地包括在第二表面組分上沉積聚電解質(zhì)的多層。其他示例性的第二組合物包括包含一種或多種膦酸或一種或多種磷酸鹽/酯基團(tuán)的化合物。例如，第二組合物可包含聚乙烯基膦酸；2-羧乙基膦酸；氨基三(亞甲基膦酸)；l-羥基亞乙基-l,l-二膦酸；六亞甲基二胺四(亞甲基膦酸)；二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)；乙二胺四(亞甲基膦酸)；二(六亞甲基三胺五(亞甲基膦酸))；2-膦酰基丁烷-1,2,4-三羧酸；或單乙醇胺二膦酸酯。作為其他例子，第二組合物可包括磷酸垸基酯或膦酸垸基酯，例如辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、十六烷基膦酸、十八垸基膦酸、二十二烷基膦酸、羥基-十二烷基膦酸、羥基-十一垸基-膦酸、癸二基二(膦酸)、磷酸十二垸基酯或羥基-磷酸十二烷基酯。這兩種表面組分可通過不同組合物進(jìn)行差異性改性。因此，在一類實(shí)施方式中，該方法包括使基板與能夠選擇性地締合第一表面組分的第一組合物接觸，并使感興趣的分子偶聯(lián)于第一組合物，以使感興趣的分子與第一表面組分選擇性地偶聯(lián)，和使基板與能夠選擇性地締合第二表面組分的第二組合物相接觸(在感興趣的分子偶聯(lián)或第一組合物沉積之前或之后)。在另一方面，本發(fā)明提供了將感興趣的分子選擇性地沉積在基板的選定區(qū)域上的方法，該方法包括提供具有第一組分和第二組分的基板，第一組分包括導(dǎo)電材料，第二組分包括絕緣體；和對(duì)第一組分施加電勢(shì)以增加或減少感興趣的分子與第一組分表面的締合。附圖簡(jiǎn)要說明圖1顯示了應(yīng)用中的零模式波導(dǎo)(ZMW)的示意圖。圖2提供了本發(fā)明光導(dǎo)向表面活化過程的示意圖。圖3提供了在光限制區(qū)如ZMW的光學(xué)相關(guān)部分中提供活性表面的過程是示意圖。圖4提供了兩個(gè)獨(dú)立的活化階段中，表面活性水平隨距ZMW底面的距離變化的模擬圖。圖5提供了使用兩步活化過程的交替光活化方案的示意圖。圖6提供了在限制結(jié)構(gòu)內(nèi)提供活性表面的擴(kuò)散限制性過程的示意圖。圖7提供了在基板的非相關(guān)表面上提供印刷的掩蔽層的過程的示意圖。圖8提供了從基板表面的非相關(guān)部分除去活性基團(tuán)的光致開裂過程的示意圖。圖9示意性地顯示了從基板表面的非相關(guān)部分除去感興趣的分子的基于尺寸排阻顆粒的過程。圖IO顯示了使用電驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)來選擇性固定感興趣的分子。圖11示意性地顯示了使用夾帶基質(zhì)(entrainingmatrix)然后通過頂離(lift-off)發(fā)射技術(shù)從基板的非相關(guān)表面除去分子的過程。圖12顯示了具體使用尺寸排阻顆粒過程的本發(fā)明選擇性固定過程的效果。圖13示意性地顯示了使用交替排他性過程來選擇性定位分子的過程。圖14示意性地顯示了使用排他性過程來選擇性定位分子的示例過程，其中，位點(diǎn)特異性滅活組分從基板去除感興趣的分子。圖15示意性地顯示了使用排他性過程來選擇性定位分子的示例過程，其中，位點(diǎn)特異性滅活組分從基板去除偶聯(lián)部分。圖16示意性地顯示了利用復(fù)合基板如ZMW中不同材料的不同表面特征并用PE-PEG共聚物鈍化來選擇性固定感興趣的分子。圖17示意性地顯示了聚電解質(zhì)多層的形成。圖18示意性地顯示了利用復(fù)合基板如ZMW中不同材料的不同表面特征并用聚電解質(zhì)多層鈍化來選擇性固定感興趣的分子。圖19顯示了核苷酸類似物與聚電解質(zhì)多層處理和等離子體-PDMS處理(非偏置處理)表面結(jié)合的比較。圖20顯示了聚合酶與聚電解質(zhì)多層處理的和未處理的鋁表面結(jié)合的比較。圖21顯示了具體使用選擇性硅烷化和聚電解質(zhì)多層鈍化過程的本發(fā)明選擇性固定過程的效果。圖22顯示了具體使用選擇性硅烷化和聚電解質(zhì)多層鈍化過程的本發(fā)明選擇性固定過程的效果。圖23顯示了中性親和素(neutravidin)涂覆的熒光珠與經(jīng)膦酸酯-處理的ZMW和未處理的ZMW結(jié)合的比較。圖24顯示了核苷酸類似物與經(jīng)膦酸酯-處理的ZMW和未處理的ZMW結(jié)合的比較。示意圖不是按比例繪制的。發(fā)明詳述I.本發(fā)明的一般描述本發(fā)明一般涉及在基板上或設(shè)定容積內(nèi)的預(yù)先選擇的位置或區(qū)域中提供期望分子的方法和過程，涉及該方法或過程制備的制品，具體地，涉及光限制區(qū)內(nèi)期望的低濃度或單個(gè)分子。在特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及使單個(gè)分子定位在特定空間或容積內(nèi)的方法，從而利用分子的空間個(gè)體性，例如化學(xué)、光學(xué)、電學(xué)等性質(zhì)。本發(fā)明還提供了由上述過程制備的基板、裝置、接受器等，例如光限制區(qū)。雖然本發(fā)明的方法可廣泛地用于在多種給定的期望空間或容積類型的任一種內(nèi)提供單個(gè)分子，在特別優(yōu)選的方面，該方法可用于使期望分子(例如酶)選擇性地沉積或固定在光限制區(qū)的光可到達(dá)部分，特別是零模式波導(dǎo)(ZMW)內(nèi)。通常，可采用光限制區(qū)從只有非常小的空間或體積提供電磁輻射或產(chǎn)生這種輻射。這種光限制區(qū)可包括結(jié)構(gòu)限制區(qū)，例如孔、凹陷、管等，或者它們可包括結(jié)合其他組分的光過程，以向只有非常小的體積提供光照或從只有非常小的體積產(chǎn)生發(fā)射的輻射。這種光限制的例子包括使用如基于光系統(tǒng)的全內(nèi)反射(TIR)的系統(tǒng)，從而將光以一定角度導(dǎo)向通過透明基板，在基板內(nèi)產(chǎn)生全內(nèi)反射。雖然產(chǎn)生TIR，但還有一些小部分的光將穿透基板外表面，并根據(jù)距基板表面的距離而快速衰減，導(dǎo)致在表面上非常小體積的光照。類似地，可采用ZMW結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)利用沿包層設(shè)置的窄芯體，例如10-100納米，所述芯體的尺寸能夠避免期望的電磁輻射傳播通過芯體。結(jié)果，輻射從芯體開口處起只透入芯體中非常短的距離，因而僅僅光照在芯體內(nèi)非常小的體積?？紤]了許多其他的光限制技術(shù)，包括例如通過尖銳金屬尖端的場(chǎng)增強(qiáng)，納米管限制區(qū)、薄狹縫限制區(qū)、近場(chǎng)共振能傳遞限制區(qū)、近場(chǎng)孔限制區(qū)、衍射限制的光限制區(qū)和刺激發(fā)射損耗限制區(qū)，以及在待批的美國(guó)專利申請(qǐng)序列第10/944,106號(hào)和第09/572,530號(hào)以及美國(guó)專利6,917,726中描述的所有其他限制區(qū)，這些申請(qǐng)的內(nèi)容全文納入本文作為參考。零模式波導(dǎo)(ZMW)的一般特征在于，存在被包層包圍的芯體，其中，芯體的尺寸能夠阻止顯著量的超出截止頻率的電磁輻射傳播通過芯體。結(jié)果，當(dāng)用頻率低于截止頻率的光進(jìn)行光照時(shí)，光僅能透入芯體中很短的距離，只能對(duì)芯體體積的小部分進(jìn)行有效光照。根據(jù)本發(fā)明，芯體包括被包層包圍的空的空穴或優(yōu)選填充流體的空穴。該芯體提供其中可發(fā)生化學(xué)、生物化學(xué)和/或生物學(xué)反應(yīng)的區(qū)域或體積，特征在于具有極小的體積，并且在一些情況下足以包括;僅僅單個(gè)分子或一組反應(yīng)分子。ZMW、其制造、結(jié)構(gòu)以及在分析操作中的應(yīng)用的詳細(xì)內(nèi)容參見美國(guó)專利6,917,726和Levene等人的Science299(5607):609-764(2003)，其全部?jī)?nèi)容納入本文作為參考。在ZMW及其他光限制內(nèi)的化學(xué)和生物化學(xué)分析的情況下，顯然需要確保關(guān)注的反應(yīng)在所述限制的光學(xué)詢問部分內(nèi)以最小程度進(jìn)行，優(yōu)選在單獨(dú)的限制的詢問部分內(nèi)僅進(jìn)行單個(gè)的反應(yīng)。通?？刹捎迷S多方法在觀察容積內(nèi)提供單獨(dú)19的分子。2005年9月30日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第11/240,662號(hào)描述了許多這種方法，其內(nèi)容被納入本文作為參考，該申請(qǐng)描述了設(shè)計(jì)改性的表面，將單獨(dú)的分子以所需密度固定到表面上，使大約一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或一些其他選定數(shù)量的分子能夠落在指定的觀察體積內(nèi)。典型地，這類方法釆用稀釋技術(shù)，在表面上提供相對(duì)低密度的偶聯(lián)基團(tuán)，即通過稀釋表面上的這些基團(tuán)或者稀釋與關(guān)注的分子相互作用的中間基團(tuán)或最終偶聯(lián)基團(tuán)，或者這兩種方式的組合。在一些情況下，還希望從觀察體積外的其他區(qū)域，例如觀察體積之內(nèi)和之外在總的基板外殼ZMW上、包層上等減少或者甚至消除關(guān)注的反應(yīng)。具體說，在詢問范圍之外的反應(yīng)可能影響關(guān)注的反應(yīng)或該對(duì)反應(yīng)的監(jiān)測(cè)，這種影響是通過反應(yīng)物的損耗影響反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，增加產(chǎn)物濃度，有利于信號(hào)本底噪聲能級(jí)發(fā)生的，例如通過產(chǎn)生產(chǎn)物或消耗反應(yīng)物，這樣可能干擾被詢問的反應(yīng)，或者提供擴(kuò)散進(jìn)入或者離開波導(dǎo)的詢問區(qū)的過度可檢測(cè)的背景產(chǎn)物水平。因此，將反應(yīng)組分選擇性和優(yōu)選沉積和/或固定在觀察區(qū)內(nèi)對(duì)本發(fā)明尤其有益。這些通常適合用作上文所述的低濃度沉積方法的替代方式，優(yōu)選用作除該方法之外的額外方式。在上述內(nèi)容中，感興趣的分子可優(yōu)先位于特定區(qū)域中，或基本上定位在給定的區(qū)域中。應(yīng)理解，使用該術(shù)語優(yōu)先表示該分子以超過非優(yōu)先定位的其他位置的濃度或表面密度定位在給定位置中。因此，第一區(qū)域中給定分子的優(yōu)先固定表示該分子在該區(qū)域中的密度或濃度比其他區(qū)域更高。這些區(qū)域中的密度比其他區(qū)域中的濃度或密度高20%以上、30%以上、50%以上、100%以上、或高達(dá)200%、一直到1000%或更高，在一些情況下，在100倍以上、1000倍以上或更高。類似的涵義通常適用于表示給定分子基本上僅位于給定區(qū)域中。例如在用于單個(gè)分子酶分析的ZMW的情況下，希望在波導(dǎo)光照區(qū)內(nèi)提供單個(gè)酶分子，優(yōu)選在波導(dǎo)的底部或底面上。如上所述，進(jìn)一步希望確保除底面之外的其他表面上，例如芯體的壁和/或不是芯體部分的包層表面上等不存在額外的酶分子。本發(fā)明方法制備的基板尤其有價(jià)值的應(yīng)用是在稱為"單個(gè)分子測(cè)序應(yīng)用"的過程中。通過例子的方式，監(jiān)測(cè)模板核酸、引物序列和聚合酶的復(fù)合物，基于單個(gè)分子，觀察新生鏈的模板依賴性合成過程中每個(gè)額外的核苷酸的結(jié)合。通過鑒別各個(gè)增加的堿基，可鑒別模板中的互補(bǔ)堿基，因而讀取該模板的序列信息。在ZMW的情況下，在ZMW觀察體積內(nèi)提供單獨(dú)聚合酶/模板/引物復(fù)合物。隨著四種標(biāo)記(例如熒光)的核苷酸或核苷酸類似物中的每一種摻入合成鏈，通過相關(guān)的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)將觀察到這種核苷酸或核苷酸類似物上標(biāo)記的延長(zhǎng)存在。這種測(cè)序過程和檢測(cè)系統(tǒng)在2005年8月11日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第2003/0044781號(hào)和待批的美國(guó)專利申請(qǐng)第11/201,768號(hào)中描述，將其全部?jī)?nèi)容納入本文作為參考。認(rèn)為單個(gè)分子的測(cè)序應(yīng)用將受益于本文所述的方法，所述方法包括將聚合酶、模板或引物或這些物質(zhì)中的任一種或所有物質(zhì)的復(fù)合物優(yōu)先選擇性地固定在基板的選定區(qū)域內(nèi)，和/或基本上不在基板的其他部分上。通常，在給定位置，例如ZMW的光照體積內(nèi)，選擇性提供感興趣的分子可采用加法或減法過程來實(shí)現(xiàn)。加法過程通常表示，將單個(gè)分子定位或沉積在期望的位置上而不是其他位置。相反，減法過程表示，感興趣的分子無所不在且非選擇性地沉積在(例如)整個(gè)基板表面上，然后從不期望的位置選擇性地去除感興趣的分子。雖然這些描述提供了描述各種過程的便利，但應(yīng)理解，一個(gè)過程的結(jié)果與另一過程的結(jié)果沒有區(qū)別。還應(yīng)理解，許多過程可包括加法、減法或這兩種方法所述的步驟。雖然一般在酶或其他大分子基團(tuán)的定位方面進(jìn)行描述，但為本發(fā)明的目的，感興趣的分子可以是希望提供空間個(gè)體性或提高定位的各種不同的官能性分子中的任一種。這些基團(tuán)包括活性分子，例如催化分子如酶，而且包括具有更多鈍態(tài)官能的分子，例如非催化基團(tuán)，例如結(jié)合或偶聯(lián)基團(tuán)、疏水或親水基團(tuán)、結(jié)構(gòu)增強(qiáng)基團(tuán)如促進(jìn)粘合的基團(tuán)、可活化或可滅活的基團(tuán)等。結(jié)合或偶聯(lián)基團(tuán)可包括小分子偶聯(lián)基團(tuán)或者它們可包括大分子偶聯(lián)基團(tuán)，例如抗體、抗體片段、特異性結(jié)合對(duì)如親和素/生物素、結(jié)合肽、凝集素、互補(bǔ)核酸、或各種其他結(jié)合基團(tuán)中的任一種。催化活性分子通常包括希望具有空間個(gè)體性的催化活性分子，例如用于單個(gè)分子分析中等。至少一方面，本發(fā)明涉及提高離散反應(yīng)區(qū)和/或觀察區(qū)域的隔離。這不僅提供了這些區(qū)域間的光學(xué)隔離，而且提供了這些區(qū)域的化學(xué)隔離和/或環(huán)境隔離。廣義上，這可通過在反應(yīng)區(qū)域和/或觀察區(qū)域之間提供阻擋或區(qū)域來實(shí)現(xiàn)，可以基本上防止反應(yīng)物和/或產(chǎn)物從特定反應(yīng)區(qū)外擴(kuò)散進(jìn)入并且潛在地干擾特定反應(yīng)區(qū)內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)，或者該區(qū)域的觀察。提供必要隔離時(shí)，關(guān)注以下一點(diǎn)或兩點(diǎn)(1)在相鄰反應(yīng)區(qū)/觀察區(qū)域之間提供足夠的分離/隔離；和(2)從相鄰區(qū)域間的間隔內(nèi)消除任何潛在的干擾組分，例如清除該間隔內(nèi)的任何反應(yīng)物、產(chǎn)物和/或酶，并在觀察區(qū)之間產(chǎn)生一種"非武裝區(qū)域(demilitarizedzone)"。提供增強(qiáng)的隔離通常涉及在觀察區(qū)之間提供一定形式的阻擋。通常，這種阻擋可簡(jiǎn)單地包括在流體系統(tǒng)中的足夠的距離，使反應(yīng)物和產(chǎn)物不能從一個(gè)反應(yīng)區(qū)擴(kuò)散進(jìn)入特定的觀察區(qū)域，不論反應(yīng)是在觀察區(qū)域附近或是位于其他一些位置。提供的距離可跨平面基板或者可以通過在基板上提供結(jié)構(gòu)化或輪廓化的表面來增加有效擴(kuò)散距離。例如，在尤其優(yōu)選的方面，可以在納米孔內(nèi)提供離散反應(yīng)區(qū)/觀察區(qū)域，以有效增加所述區(qū)域間的距離，并且處理或產(chǎn)生這種基板，以降低或消除選定區(qū)域之間的間隔或區(qū)域中，例如納米孔底面處或面向納米孔底面之外的表面中存在或正在產(chǎn)生的任何反應(yīng)物和/或產(chǎn)物。n.加法過程如上所述，在至少一個(gè)方面，采用加法過程來提供本發(fā)明期望的固定化分子。該加法過程通常依賴于在期望位置選擇性地提供結(jié)合或偶聯(lián)基團(tuán)，然后使感興趣的分子沉積。同樣，沉積也可以是加法或減法過程的結(jié)果。至少在第一方面，本發(fā)明加法過程通常包括使偶聯(lián)基團(tuán)沉積在基板表面上，偶聯(lián)基團(tuán)只在表面的期望的區(qū)域內(nèi)(例如光限制如zmw的觀察區(qū)域內(nèi))選擇性地結(jié)合感興趣的分子。官能基團(tuán)(包括可活化的官能團(tuán))與表面的偶聯(lián)通常可通過本領(lǐng)域已知的各種方法中的任一種來實(shí)現(xiàn)。例如，在基于二氧化硅的基板的情況下，例如玻璃、石英、熔融二氧化硅、硅等，可利用充分表征的硅垸化學(xué)將其他基團(tuán)偶聯(lián)于表面。這些其他基團(tuán)包括官能團(tuán)、可活化的基團(tuán)和/或這兩種基團(tuán)任一個(gè)的連接分子、或意圖用于表面最終應(yīng)用中的實(shí)際感興趣的分子。在其他基板類型例如聚合物材料、金屬等的情況下，可采用其他過程，例如使用雜化聚合物表面，該表面具有與其偶聯(lián)或從其延伸的官能團(tuán)，使用如具有與其偶聯(lián)的官能團(tuán)的共聚物、金屬締合性基團(tuán)(即螯合劑)、巰基化合物等。至少在本發(fā)明的第一方面，僅在期望的區(qū)域內(nèi)提供感興趣的分子的偶聯(lián)通常是通過以下方式進(jìn)行，即提供與整個(gè)基板的表面偶聯(lián)的可活化的偶聯(lián)基團(tuán)，該基團(tuán)只在期望的區(qū)域內(nèi)選擇性活化，或者使用可選擇性滅活的偶聯(lián)基團(tuán)并在除期望區(qū)域之外的所有區(qū)域內(nèi)選擇性地滅活該基團(tuán)。只在期望的區(qū)域選擇性地提供活性偶聯(lián)基團(tuán)的方式，使感興趣的分子能夠基本上僅在期望區(qū)域內(nèi)選22擇性地沉積和偶聯(lián)。為了便于描述，對(duì)于給定應(yīng)用希望選擇性地提供感興趣分子的表面或基板部分在這里稱為"期望的區(qū)域"，而這些區(qū)域之外的區(qū)域則稱為非期望區(qū)域。這種期望和非期望的區(qū)域可包括平面或者可包括三維結(jié)構(gòu)，如孔、凹陷、表面不規(guī)則、支柱、柱、溝渠、凹槽、通道、毛細(xì)管、多孔材料等。許多不同的可活化偶聯(lián)基團(tuán)可與本發(fā)明該方面聯(lián)用。通常，這些基團(tuán)包括用可選擇性去除的基團(tuán)封端或保護(hù)的偶聯(lián)基團(tuán)。這些基團(tuán)包括熱可變基團(tuán)，例如不耐熱的保護(hù)基團(tuán)，化學(xué)可變基團(tuán)，例如酸或堿不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)，以及光可變基團(tuán)，例如光分解或可去除的保護(hù)基團(tuán)。對(duì)在例如非期望區(qū)域中的偶聯(lián)基團(tuán)滅活包括使用可直接選擇性滅活的基團(tuán)，例如通過使用能俘獲官能團(tuán)或?qū)е鹿倌軋F(tuán)去除的熱、化學(xué)或光誘導(dǎo)的化學(xué)，即通過光誘導(dǎo)的交聯(lián)、光致裂解等?；蛘撸谀承﹥?yōu)選的方面，這種滅活方法釆用選擇性活化在非期望區(qū)域中的偶聯(lián)基團(tuán)，然后用中性或惰性的封閉基團(tuán)(blockinggroup)例如基本上不能與感興趣的分子偶聯(lián)的基團(tuán)，或者中間連接分子來保護(hù)或封端所得活性偶聯(lián)基團(tuán)，然后在偶聯(lián)條件下使所述基團(tuán)偶聯(lián)于期望的區(qū)域。這種隨后加入的封閉基團(tuán)是不可逆的或是可逆的。然而，這種封端的可逆性如果存在，通常將涉及不同于潛在的可活化偶聯(lián)基團(tuán)的機(jī)制，以避免在非期望區(qū)域中的封端基團(tuán)再活化，同時(shí)活化期望的區(qū)域中潛在的可活化基團(tuán)。例如，采用光活化方案來選擇性地激活在期望的區(qū)域中的基團(tuán)時(shí)，應(yīng)用于非期望區(qū)域的封端基團(tuán)通常不會(huì)光活化，或因?yàn)閼?yīng)用中表面接觸的任何條件而活化。將非期望區(qū)域中的偶聯(lián)基團(tuán)封端之后，期望的區(qū)域或感興趣的區(qū)域內(nèi)的偶聯(lián)基團(tuán)可選擇性地活化而與感興趣的分子偶聯(lián)。為了便于討論，無論光活化涉及封閉基團(tuán)的光致裂解還是通過改變化學(xué)結(jié)構(gòu)而不去除較大的封閉基團(tuán)本身，例如導(dǎo)致改性的基團(tuán)或其他基團(tuán)的加入，來實(shí)現(xiàn)光活化，在這里都將通常稱為活化，例如光活化。在至少一個(gè)尤其優(yōu)選的方面，使用光致活化的偶聯(lián)基團(tuán)以將感興趣的分子選擇性地沉積在期望區(qū)域中，例如采用能夠用光不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)封端的化學(xué)活性偶聯(lián)基團(tuán)。這種光致活化的偶聯(lián)機(jī)制尤其適用于采用光限制的系統(tǒng)，使得用于觀察最終關(guān)注的反應(yīng)和用于活化偶聯(lián)基團(tuán)的光只能照射在期望的區(qū)域，例如最接近芯體開口處的ZMW區(qū)域，光通過該開口光照該芯體。具體說，因?yàn)閷?dǎo)向ZMW的激活光將只能照射有限的區(qū)域，例如光照區(qū)，所以感興趣的分子將基本上只在光照體積內(nèi)選擇性地偶聯(lián)。需要重申的是，相同的光限制效應(yīng)過去僅用于監(jiān)測(cè)光照體積的小限制區(qū)(在設(shè)置ZMW的可應(yīng)用的分析操作中通?；旧舷薅ǔ龅挠^察區(qū))內(nèi)的反應(yīng)，類似地只允許在ZMW的相同限制體積或部分內(nèi)的活化(及后續(xù)偶聯(lián))。應(yīng)理解，通過調(diào)制活化輻射，可以將活化期間的光照體積進(jìn)一步控制在比應(yīng)用期間的光照體積要小的體積。具體說，通過應(yīng)用較低能量的光照，采用比光照/問詢光更長(zhǎng)波長(zhǎng)的活化光，可以對(duì)光照的分子進(jìn)行光照、活化，并使其只偶聯(lián)于在最終的應(yīng)用中最終位于光照體積內(nèi)的表面子集。在本發(fā)明的許多具體方面，通常優(yōu)選采用能使電磁輻射選擇性地導(dǎo)向期望區(qū)域的基板，在該基板的最終應(yīng)用方面，例如在這些基板上查詢化學(xué)、生物化學(xué)和/或生物學(xué)反應(yīng)，以及提供選擇性活化表面用于感興趣的分子在所述分析期間選擇性地固定在利用區(qū)域?？傊捎米罱K應(yīng)用中使用的基板的基礎(chǔ)功能，并利用該功能來改善所述應(yīng)用中基板的制造和加工。在定向輻射的內(nèi)容中，使用相同的輻射導(dǎo)向性質(zhì)，對(duì)用于使輻射聚焦在期望區(qū)域以査詢?cè)搮^(qū)域內(nèi)的反應(yīng)的基板進(jìn)行產(chǎn)率，使該期望的區(qū)域選擇性地功能化。根據(jù)后續(xù)沉積在基板上和偶聯(lián)于基板的感興趣的分子的性質(zhì)，本發(fā)明可使用許多不同的偶聯(lián)基團(tuán)。例如，偶聯(lián)基團(tuán)可包括功能性化學(xué)部分，例如胺、羧基、羥基、巰基、金屬、螯合劑等?？蛇x地或額外地，可包括特定的結(jié)合元件，例如生物素、親和素、抗生物素蛋白鏈菌素、中性親和素、凝集素、SNAP-標(biāo)簽TM或底物(考凡利生物科學(xué)AG公司(CovalysBiosciencesAG);SNAP-標(biāo)簽TM是一種基于哺乳動(dòng)物06-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉(zhuǎn)移酶的多肽，SNAP-標(biāo)簽底物是芐基嘌呤和嘧啶的衍生物)、締合或結(jié)合的肽或蛋白質(zhì)、抗體或抗體片段、核酸或核酸類似物等。此外或可選地，偶聯(lián)基團(tuán)可用于與感興趣的分子偶聯(lián)或結(jié)合的其他基團(tuán)偶聯(lián)，在一些情況下這些其他基團(tuán)包括化學(xué)官能團(tuán)和特定的結(jié)合元件。通過例子的方式，使光致活化的偶聯(lián)基團(tuán)，例如光致活化的生物素沉積在基板表面上并在給定區(qū)域中選擇性地激活。然后，中間結(jié)合劑，例如抗生物素蛋白鏈菌素可與第一偶聯(lián)基團(tuán)偶聯(lián)。然后，感興趣的分子(在具體的例子是生物素化的)偶聯(lián)于抗生物素蛋白鏈菌素。本發(fā)明該方面中采用的光不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)可包括多種己知的可光致裂解的保護(hù)基團(tuán)，包括例如硝基藜蘆基、l-芘基甲基、6-硝基藜蘆氧基羰基、二甲基二甲氧基芐氧基羰基、2-硝基芐氧基羰基、甲基、甲基-6-硝基胡椒氧基羰基、2-氧亞甲基蒽醌、二甲氧基芐氧基羰基、5-溴-7-硝基二氫吲哚基、o-羥基-a-甲基肉桂?；约八鼈兊幕旌衔?，如美國(guó)專利5,412,087和5,143,854所述，將其內(nèi)容全部納入本文作為參考。光致活化的偶聯(lián)基團(tuán)與感興趣的表面的偶聯(lián)可通過許多本領(lǐng)域已知的方法來實(shí)現(xiàn)。例如，光保護(hù)或可活化的基團(tuán)可包括羧基，它通過表面上的羥基發(fā)生偶聯(lián)或者通過連接基團(tuán)(例如PEG分子)與表面相連?；蛘?，光致活化的基團(tuán)上的胺基可偶聯(lián)于結(jié)合環(huán)氧基的表面?；蛘撸A(yù)先與連接分子(例如PEG基團(tuán))偶聯(lián)的可活化的基團(tuán)可通過已知方法進(jìn)行硅垸化并直接附連于表面。下面顯示了上述偶聯(lián)方案中使用的化合物的例子，例如使用MeNPOC保護(hù)的生物素oMeNPO\jNNHO2H——C=CH2!■Jn'O其他光敏感保護(hù)基團(tuán)包括用于偶聯(lián)胺的基團(tuán)，例如三甲基苯氧基羰基25u:coHe(TMPOC)，用于偶聯(lián)酸的基團(tuán)，例如苯甲酰甲酯(313nm裂解)、a-苯甲酰甲酯、二苯乙酮酯(350nm)、二(o-硝基苯基)甲酯(320nm)、1-芘基甲酯(340nm)、N-8-硝基-l,2,3，4-四氫喹啉酰胺(350nm)，以及以下化合物的酯.OH對(duì)于本發(fā)明那些使用較長(zhǎng)波長(zhǎng)進(jìn)行活化或脫保護(hù)的方面，可使用合適的長(zhǎng)波長(zhǎng)不穩(wěn)定基團(tuán)，例如溴化7-羥基香豆素(hydroxyxoumarin)-4-基-甲基，它在約740nm為光不穩(wěn)定。其他這類基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。有用的還有用于偶聯(lián)醇的光不穩(wěn)定基團(tuán)，包括例如，一些如上所述的基團(tuán)，以及對(duì)硝基芐氧基甲基醚、對(duì)甲氧基芐基醚、對(duì)硝基芐基醚、單、二或三甲氧基三苯甲基、二苯基甲基甲硅烷基醚、三(三甲基甲硅烷基)甲硅垸基醚(sisylether)、3'，5，-二甲氧基苯偶姻碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯等。這些和許多其他光致裂解的基團(tuán)可與本發(fā)明的該方面聯(lián)用，參見例如《有機(jī)光化學(xué)的CRC手冊(cè)》(CRCHandbookofOrganicPhotochemistryandPhotobiology)，第二版禾卩《有機(jī)合成中的保護(hù)基》(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis)(T.W.Greene禾QP.G.Wuts，第三版，JohnWiley&Sons,1999)，將其全部?jī)?nèi)容納入本文作為參考。除使用前述較大的光可去除的保護(hù)基團(tuán)之外或可選地，本發(fā)明除了通過去除這類封閉基團(tuán)之外，還包括使用光致活化的基團(tuán)，例如化學(xué)改變的基團(tuán)。例如，乙烯基或烯丙基可與表面偶聯(lián)，同時(shí)光照并與含有例如巰基的合適的待偶聯(lián)基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)，例如直接偶聯(lián)或通過連接分子偶聯(lián)的具有巰基的生物素，它們與活化的乙烯基或烯丙基反應(yīng)而與表面偶聯(lián)?；蛘撸刹捎闷渌鶊F(tuán)如硝基芳基疊氮基作為可活化的偶聯(lián)基團(tuán)。類似地也可使用許多其他光致活化的化合物，例如硝基螺環(huán)吡喃基團(tuán)(參見Blonder等，J.Am.Chem.Soc.1997,119:10467-10478和Blonder等,J.Am.Chem.Soc.1997,119:11747-11757)。一方面，采用能夠在530nm的波長(zhǎng)處引發(fā)自由基反應(yīng)的光引發(fā)劑(例如長(zhǎng)波長(zhǎng)光引發(fā)劑)，例如Irgacure784(雙(1!5-2,4-環(huán)戊二烯-1-基)二[2，6-二氟-3-(111-吡咯-l-基)苯基]鈦；塞霸專業(yè)化學(xué)品公司(CibaSpecialtyChemicals))。這種長(zhǎng)波長(zhǎng)光引發(fā)劑具有許多應(yīng)用。例如，用乙烯基-垸基-膦酸酯涂覆表面(例如金屬氧化物表面)。在Irgacure784和生物素-PEG-SH的存在下，使期望的表面區(qū)域在530nm激光下曝光，導(dǎo)致在該區(qū)域中形成生物素-PEG-烷基-膦酸酯。然后，可采用生物素將感興趣的分子固定至期望的區(qū)域。在相關(guān)的方面，光致活化組分可以溶液形式提供，并在需要定位的表面區(qū)域近端活化。例如，將可活化的結(jié)合組分或其他感興趣的分子接枝在活性硅烷表面上。這種系統(tǒng)的一個(gè)例子包括光致活化的補(bǔ)骨脂素-生物素化合物(從如安碧恩有限公司(Ambkm，Inc.)獲得)，該化合物在紫外光下活化而與硅烷化表面，例如三甲氧基硅烷改性的表面偶聯(lián)。本發(fā)明的這些方面包括使用選擇性表面活化的加法過程，通常包括在期望位置中選擇性活化的許多不同的方案。這些方案可包括單個(gè)活化步驟，多個(gè)活化步驟的過程，包括活化和滅活步驟的多步過程，等等。為便于討論，參考光活化和/或光滅活過程來描述多步過程，但是應(yīng)理解，類似地可采用其他非光驅(qū)動(dòng)的過程。至少在第一相對(duì)簡(jiǎn)單的方面，對(duì)在期望區(qū)域中的光致活化的偶聯(lián)基團(tuán)進(jìn)行選擇性活化涉及在期望區(qū)域中進(jìn)行活化輻射并使感興趣的分子與位于其上的活化偶聯(lián)基團(tuán)偶聯(lián)的單個(gè)步驟。如上所述，在光限制的情況下，希望將感興趣的分子(例如酶)定位在光照體積內(nèi)，單個(gè)步驟的光驅(qū)動(dòng)的活化應(yīng)導(dǎo)致基本上只在光照體積內(nèi)的偶聯(lián)。而且，如上所述，通過調(diào)制活化輻射，可以將活化進(jìn)一步聚焦在最終應(yīng)用期間(例如使用固定化聚合酶的核酸序列測(cè)定)問詢的光照區(qū)子集內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)感興趣的基團(tuán)的偶聯(lián)。ZMW結(jié)構(gòu)的基本功能結(jié)構(gòu)在圖1中示意性地所示。如圖所示，提供的ZMW結(jié)構(gòu)100，其包括沉積在透明基層104上的包層102。芯體106被設(shè)置成穿過包層而接觸下方的透明層104。芯體的尺寸能提供光限制區(qū)，能夠防止截止頻率以下的電磁輻射傳播通過芯體。相反，光只能透芯體中很短的距離，光照了相對(duì)較小的體積，由虛線108限定表示。通過在觀察體積內(nèi)提供感興趣的反應(yīng)物，例如酶110和底物112，可以選擇性地觀察其運(yùn)作而不會(huì)干擾觀察體積之外(例如線108上方)的反應(yīng)物(例如底物114)。如前所述，通常希望在進(jìn)行分子分析(例如酶分析)的過程中，優(yōu)先在光照或觀察體積內(nèi)提供感興趣的分子。因此，參考圖1，圖2示意性地顯示了簡(jiǎn)單的活化方案，例如ZMW的活化方案。如圖所示，首先處理ZMW結(jié)構(gòu)100，以提供可活化的表面，例如實(shí)線202所示。如圖所示，處理步驟是非選擇性的，因?yàn)樵诮Y(jié)構(gòu)的整個(gè)表面(包括包層102)上提供可活化的表面。然后，使光照體積內(nèi)(例如虛線108所示)的可活化的基團(tuán)進(jìn)行活化(如虛線204所示)。在ZMW結(jié)構(gòu)的內(nèi)容中，通常涉及使可活化基團(tuán)暴露于通過透明基層104的活化輻射，如波浪箭頭206所示。應(yīng)理解，超出光照體積的活化輻射顯著衰減，因此，基本上只活化在光照區(qū)內(nèi)的基團(tuán)，如虛線108下方的基團(tuán)。然后，在觀察體積內(nèi)而不是表面上的其他地方，感興趣的分子(例如酶或酶特異性偶聯(lián)基團(tuán))與活化的基團(tuán)偶聯(lián)。應(yīng)理解，將對(duì)光照體積的標(biāo)注簡(jiǎn)化為良好限定的邊界只是為了便于討論，而光照通過ZMW芯體的衰減并且不是如此突然的。結(jié)果，照度和光照導(dǎo)致的光活化表面水平，將隨著距波導(dǎo)芯體光照端距離的增加而降低。輻射衰減的速率以及活化水平可以不同的速率降低，取決于活化過程的性28質(zhì)，例如在任何點(diǎn)的飽和，以及活化過程是單或多光子的過程。在另一種過程中，可采用額外的活化步驟來進(jìn)一步選擇偶聯(lián)的感興趣分子的區(qū)域。具體說，在光限制(例如ZMW)內(nèi)給定的輻射步驟中，如圖1和2所示，光照通常產(chǎn)生在所述限制內(nèi)的活化譜，照度最強(qiáng)處例如波導(dǎo)的底面存在更多的活化基團(tuán)。當(dāng)光照因進(jìn)一步透入波導(dǎo)而降低時(shí)，活化水平或活化效率將根據(jù)可活化基團(tuán)的特性、光照強(qiáng)度以及曝光時(shí)間量而降低。這將導(dǎo)致在光穿透降低的光照區(qū)部分中活化可能性下降，因而照度變小。然后通過用第二光可去除的基團(tuán)對(duì)這些活化基團(tuán)封端，并重復(fù)該活化步驟，類似地限制了遠(yuǎn)離高照度的基團(tuán)被活化的可能性，但可應(yīng)用于的基團(tuán)數(shù)量較少。這可通過下面的例子進(jìn)一步證明如果可用第一波長(zhǎng)的光活化的光致活化基團(tuán)均勻分布在ZMW結(jié)構(gòu)中，則在距波導(dǎo)底部特定距離，所有存在的可活化基團(tuán)中的一半被激活。然后，用在不同波長(zhǎng)處激活的第二光致活化基團(tuán)對(duì)所述活性基團(tuán)封端，這些基團(tuán)的活化再次使在特定距離處存在的可活化基團(tuán)中僅一半，即最初可活化基團(tuán)的四分之一的基團(tuán)活化。應(yīng)用于活化譜時(shí)的結(jié)果是接近波導(dǎo)結(jié)構(gòu)底部的更集中聚焦的活化/偶聯(lián)區(qū)域。圖3提供了雙活化方法的示意圖。根據(jù)雙活化方法，提供波導(dǎo)結(jié)構(gòu)300，其表面上具有均勻涂布的光致活化基團(tuán)的表面涂層(如圖片I所示，以黑色菱形302表示)。第一步活化(圖片II)用于激活波導(dǎo)內(nèi)的可活化基團(tuán)(如空心菱形304所示)，例如將活化光導(dǎo)入穿過波導(dǎo)300的底面306。代替感興趣的分子與那些活化的基團(tuán)偶聯(lián)，而是第二可活化基團(tuán)(如圖片III中黑色圓圈308所示)被用于對(duì)活化基團(tuán)304進(jìn)行封端的不同波長(zhǎng)的光活化。然后，后續(xù)活化步驟(圖片IV)將新封端的基團(tuán)(如空心圓圈310所示)的子集活化，感興趣的分子(未示出)與這些新活化的基團(tuán)偶聯(lián)。圖4提供了第一和第二活化步驟的表面活化(活化的表面基團(tuán)的濃度)與距ZMW底面距離的示例性模擬圖。如圖所示，預(yù)計(jì)第一活化步驟產(chǎn)生的活化曲線中，活化隨著離開ZMW底面的活化光的衰減速率而下降。用第二光可去除的基團(tuán)封端之后，在不同的波長(zhǎng)處再次活化，預(yù)計(jì)類似的衰減曲線，但是僅基于先前已活化的基團(tuán)。結(jié)果，活化的基團(tuán)可更多地聚焦在波導(dǎo)的底面而不是僅僅以一個(gè)活化步驟活化那樣。雖然以兩步法進(jìn)行描述，但是應(yīng)理解也可進(jìn)行更多步以使活化區(qū)進(jìn)一步聚焦在所述表面上。除非另有特殊說明，如本文所述，封端通常是指將其他基團(tuán)偶聯(lián)于反應(yīng)性基團(tuán)，使所得化合物對(duì)進(jìn)一步應(yīng)用的偶聯(lián)或其他感興趣的反應(yīng)沒有活性。這些封端分子通常包括將與露出的偶聯(lián)基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)而對(duì)期望的反應(yīng)是自然發(fā)生的基團(tuán)，并將根據(jù)被封端基團(tuán)的性質(zhì)而變化。這些基團(tuán)包括用于封端硅醇表面基團(tuán)的中性硅垸基團(tuán)，或者可包括其他非反應(yīng)性物質(zhì)，例如非反應(yīng)性有機(jī)物質(zhì)，例如醇、垸基、烯基等。這些封端基團(tuán)可以是小分子或者可包括較大的聚合物或大分子結(jié)構(gòu)，例如聚乙二醇(PEG)等。封端化學(xué)廣泛應(yīng)用于表面改性、衍生化和鈍化過程，例如參見《分析中的固定化生物分子實(shí)踐方法》(ImmobilizedBiomoleculesinAnalysis:APracticalApproach)(Cass禾卩Ligler編)OxfordUniversityPress,1998禾卩Hermansonn等，《固定化親和配體技術(shù)》(ImmobilizedAffinityLigandTechniques),AcademicPress,Inc.1992，將這些文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容納入本文作為參考。在另一多步方法中，采用反復(fù)的激活和滅活步驟以聚焦感興趣的分子的偶聯(lián)。如前所述，根據(jù)上文所述的滅活方案可采用光致活化基團(tuán)，例如在除期望的區(qū)域之外的其他區(qū)域進(jìn)行活化和封端或保護(hù)，然后在感興趣的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行活化并使感興趣的分子偶聯(lián)。該方法更適用于基于ZMW的應(yīng)用。具體說，通過從波導(dǎo)開放端的光照，通常不僅將包層上表面上的可活化基團(tuán)，而且將波導(dǎo)芯體壁上的可活化基團(tuán)的一些部分活化，然后封端。然后，從芯體底部或閉合端的后續(xù)活化將只能活化尚未封端的那些可活化基團(tuán)。在一定程度上，活化輻射透入芯體長(zhǎng)度的一半以上，這將導(dǎo)致更多的活化選擇，用于沉積在ZMW底部或面向ZMW底部。該方法示意性地示出在圖5中。具體說，在具有光限制(例如ZMW500)的基板上，可在整個(gè)表面上，例如在限制的內(nèi)部和外部(步驟I)提供包括光致活化的偶聯(lián)基團(tuán)(實(shí)心菱形502)的均勻表面。在后續(xù)步驟中(步驟II),該表面暴露于來自頂側(cè)(例如在遠(yuǎn)離希望固定感興趣的分子的區(qū)域的一側(cè))的活化輻射。然后通過用另一保護(hù)基團(tuán)(實(shí)心圓圈506)(例如非可去除的保護(hù)基團(tuán))進(jìn)行封端來滅活活化的基團(tuán)(空心菱形504)。然后，從底部光照ZMW，使得光照體積包括期望的區(qū)域和在該區(qū)域中活化的偶聯(lián)基團(tuán)(步驟IV，空心菱形508)。然后感興趣的分子偶聯(lián)于這些活化的基團(tuán)。通過控制最初的活化照度，可以有效控制后續(xù)活化步驟之前封端的可活化基團(tuán)的量。具體說，在第一活化步驟中，通過使用活化輻射，或允許活化輻射有效傳播超出波導(dǎo)芯一半以上的波導(dǎo)幾何形狀或其他曝光條件，在第一活化和封端步驟中可以有效封端一半以上的可活化基團(tuán)。然后從底側(cè)導(dǎo)入活化輻射，基本上所有剩余的可活化基團(tuán)(原來主要面向在第一步中尚未活化和封端的芯體底部定位)被活化而能夠與感興趣的分子偶聯(lián)。應(yīng)理解，上述各種方法可組合以進(jìn)一步提高選擇性。在類似于上述光致活化方法的另一種方法中，可采用深度紫外蝕刻方法在所需區(qū)域中(例如，在ZMW的底面上)產(chǎn)生活化表面。具體說，使用深度UV曝光，例如不到200nm光照，即使用深度UV激光，深度UV燈，例如Xeradex激基燈，在真空下選擇性降解表面結(jié)合的有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)，例如這種UV曝光能夠直接裂解化學(xué)鍵，而不需要該過程期間可能形成的氧自由基(oxygenradical)的幫助，氧自由基可能導(dǎo)致過度蝕刻。由于氧自由基能夠接觸和蝕刻其他表面，通過在真空下或其他限制條件下進(jìn)行這種曝光，可能照射并從選定的基板區(qū)域最終可控地去除有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)。在本發(fā)明有關(guān)表面的內(nèi)容中，例如，ZMW基板可具有第一阻擋層，該層對(duì)另外的偶聯(lián)基團(tuán)基本上惰性，例如，對(duì)最終使感興趣的分子與表面連接中所采用的偶聯(lián)方案是非反應(yīng)性的。因此，原來表面上的官能團(tuán)被該阻擋層有效阻斷。阻擋層的例子包括有機(jī)硅垸，例如PEG-硅烷、深度UV阻抗、或其他長(zhǎng)鏈有機(jī)硅烷。波導(dǎo)自底部或基板側(cè)面暴露于深度UV輻射，使波導(dǎo)內(nèi)的阻擋層，優(yōu)選在波導(dǎo)底面的阻擋層降解。在曝光或蝕刻過程期間，希望限制氧自由基與表面其他部分，例如ZMW之外或面向ZMW底部的觀察區(qū)之外的部分接觸的能力。在這種情況下，系統(tǒng)可在真空下運(yùn)行，或者可選地或除此外，在ZMW上提供密封層。這種密封層可包括剛性層，例如玻璃或硅晶片，或較柔性的材料，例如聚合物片，例如PDMS、PTFE、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯或能夠密封波導(dǎo)結(jié)構(gòu)的各種聚合物材料中的任一種，優(yōu)選不會(huì)過度脫氣或?qū)е虏▽?dǎo)中不期望的化學(xué)殘留物。曝光之后，基板與包含有用于與感興趣的分子偶聯(lián)的官能團(tuán)的材料相接觸，優(yōu)先結(jié)合于未阻擋的區(qū)域，例如通過"蝕刻"過程裸露的硅醇基團(tuán)。這種附加的材料可以只包括官能化基團(tuán)，或者可以包括官能化基團(tuán)和惰性基團(tuán)的混合物以控制官能團(tuán)的密度，并最終控制在波導(dǎo)結(jié)構(gòu)內(nèi)的感興趣的分子的密度。這種官能化基團(tuán)可以是反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)和/或特異性結(jié)合的分子，例如親和素、生物素等。一旦適當(dāng)密度的偶聯(lián)基團(tuán)沉積在期望區(qū)域中，例如波導(dǎo)結(jié)構(gòu)的底面，感興趣的分子可與偶聯(lián)基團(tuán)偶聯(lián)，例如通過反應(yīng)性基團(tuán)或通過附連的生物素或親和素基團(tuán)或其他特異性結(jié)合部分，與偶聯(lián)基團(tuán)或與該偶聯(lián)基團(tuán)連接的基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。在類似于上文所述光致活化方法的另一種過程中，使用柔性連接(tether)或接枝的光引發(fā)劑。尤其感興趣的是光引發(fā)-轉(zhuǎn)移-終止劑，如二硫代氨基甲酸酯(DTC)，它能夠引發(fā)并控制丙烯酸酯、烯烴的自由基聚合或封端劑與用于對(duì)感興趣的分子特異性固定的配體的終止自由基加成。對(duì)涂覆光引發(fā)劑表面的期望區(qū)域進(jìn)行光照，只在該區(qū)域中引發(fā)反應(yīng)。例如，羥基化的硅基板可用光引發(fā)-轉(zhuǎn)移-終止劑，例如N,N-(二乙基氨基)二硫代氨甲酰基芐基(三甲氧基)-硅烷(SBDC)處理，在基板表面上形成自集結(jié)(sdf-assemble)的單層。然后提供甲基丙烯酸甲酯溶液，在表面的期望區(qū)域中的UV輻射僅在該期望區(qū)域中引發(fā)聚合反應(yīng)，形成表面受限制的PMMA的聚合物叢(例如包括偶聯(lián)基團(tuán))。將感興趣的分子選擇性固定在基板表面的期望區(qū)域中的另一種方法包括在不同區(qū)域?qū)哂胁煌卣鞯牟牧线M(jìn)行選擇性圖案化，依賴于在選擇性固定過程中不同的表面特征。在本文所述的示例ZMW基板中(以及其他復(fù)合基板類型，例如依賴于表面上締合的感興趣的分子的基于金屬或半導(dǎo)體的傳感器，例如ChemFETS)，已經(jīng)存在這種圖案化的復(fù)合表面。具體說，ZMW基板典型地包括沉積在二氧化硅基(例如Si02)層上的金屬包層，例如鋁，該包層通常包括氧化鋁表層，具有穿過包層在Si02層頂部的孔。所得波導(dǎo)結(jié)構(gòu)包括金屬或金屬氧化物壁，例如具有Si02基底的A1203。氧化鋁表面在水性溶液中通常具有較高的正電荷，而Si02表面基本上帶負(fù)電荷?？扇菀椎乩眠@種電荷差異將感興趣的分子相對(duì)于其他表面選擇性定位和固定在一個(gè)表面上。通過例子的方式，DNA聚合酶通常具有相對(duì)較高水平的正電荷的表面殘留物。因此，聚合酶通常被正電荷金屬包層排斥，而對(duì)波導(dǎo)結(jié)構(gòu)底部的負(fù)電荷的玻璃表面具有吸引和吸附作用。偶聯(lián)基團(tuán)可類似地沉積，然后聚合酶(或其他感興趣的分子)與偶聯(lián)基團(tuán)偶聯(lián)。通過以下方式可容易地調(diào)節(jié)不同表面的相對(duì)吸引/排斥作用，即通過調(diào)節(jié)環(huán)境性質(zhì)以改變酶的電荷，例如離子強(qiáng)度、pH、添加劑等，通過對(duì)各表面改性以提高或降低表面上的電荷組分，或者使金屬充電/放電，或者通過對(duì)酶、偶聯(lián)反應(yīng)物、或其他感興趣的分子進(jìn)行改性，以調(diào)節(jié)表面電荷水平，例如通過使酶突變或通過偶聯(lián)帶電基團(tuán)，例如聚離子如聚賴氨酸、聚精氨酸等。一方面，聚合酶(或其他感興趣的基團(tuán)或分子)沉積到負(fù)電荷的表面上之后，用諸如牛血清白蛋白(例如乙?；腂SA)、聚谷氨酸、聚電解質(zhì)、聚電解質(zhì)多層、聚電解質(zhì)-PEG共聚物、膦酸酯、或磷酸酯等試劑涂覆，使正電荷的表面鈍化，如下更詳細(xì)所述。鈍化作用可以例如在單分子核酸測(cè)序應(yīng)用期間防止核苷酸類似物與ZMW芯體帶正電荷的金屬壁的非特異地結(jié)合。在相關(guān)方面，鈍化在聚合酶(或其他感興趣的基團(tuán)或分子)沉積之前完成，通過阻斷聚合酶與壁的結(jié)合能任選地促進(jìn)選擇性沉積。如上所述，在一些實(shí)施方式中，材料表面電荷可為活性、可調(diào)特性，例如通過pH調(diào)節(jié)和/或通過表面的外部極化作用來解決。例如，可摻入氧化錫(透明材料)使其導(dǎo)電，將其表面電荷(極化作用)調(diào)制到期望值。可類似地采用其他表面選擇性化學(xué)。例如，在鈣存在或不存在條件下，不同的磷脂組合物顯示這種能力，即能夠在金屬氧化物表面和基于二氧化硅的表面上形成不同水平的負(fù)載性磷脂雙層。通過選擇脂質(zhì)組合物以及鈣的存在與否，可以將分子有目標(biāo)地沉積在不同表面類型上，或作為封閉基團(tuán)或作為偶聯(lián)基團(tuán)。例如，可以選擇對(duì)金屬氧化物表面具有高結(jié)合選擇性的磷脂，并用其保護(hù)表面的金屬部分?；蛘?，可以使用具有適當(dāng)偶聯(lián)基團(tuán)的磷脂，所述偶聯(lián)基團(tuán)對(duì)下面的玻璃基板具有高的結(jié)合選擇性，因而能夠使附加的基團(tuán)選擇性地偶聯(lián)于透明基板。這些選擇性磷脂組合物的例子例如參見Rossetti等，Langmuir.2005;21(14):6443-50，將其全部?jī)?nèi)容納入本文作為參考。簡(jiǎn)要地說，將DOPC(二油?；字；憠A)中含50-20%DOPS(二油?；字；z氨酸)的磷脂運(yùn)載體加入混合的TiCVSK)2表面，顯示在沒有鈣的情況下，在Si02表面上選擇性地形成脂質(zhì)雙層，而在鈣的存在下則在Ti02表面上形成雙層。應(yīng)理解，可以使用玻璃選擇性磷脂雙層(或其他表面選擇性組合物)作為偶聯(lián)基團(tuán)，或者可用作對(duì)后續(xù)阻擋層沉積到金屬層上的掩蔽層。然后從玻璃基板去除脂質(zhì)雙層，然后將感興趣的分子偶聯(lián)。或者，基于特異性選擇的化學(xué)，不同表面間的物理/化學(xué)差異可進(jìn)行不同的結(jié)合。例如，可利用與特定金屬基團(tuán)締合的特定基團(tuán)，將分子相對(duì)于其他選擇性地定位在一個(gè)表面上，例如金/硫醇化學(xué)等。另一個(gè)例子是，硅垸(例如甲氧基-硅垸反應(yīng)物)與二氧化硅表面通過Si-O-33Si鍵形成穩(wěn)定的鍵，但在適當(dāng)選擇的反應(yīng)條件(例如，氣相有利于對(duì)二氧化硅表面的改性，溶液中的某些條件也是如此)下不會(huì)顯著改變鋁或氧化鋁的表面)。硅垸，例如用結(jié)合酶或其他感興趣的分子結(jié)合的偶聯(lián)基團(tuán)進(jìn)行改進(jìn)的硅烷(例如生物素-PEG-硅垸，如美國(guó)專利申請(qǐng)11/240,662所述的那些)能夠用于對(duì)復(fù)合基板如含二氧化硅表面的ZMW進(jìn)行圖案化。預(yù)先用Al203改性的硅表面上的橢圓對(duì)稱和接觸角測(cè)量顯示，不可檢測(cè)量的硅烷反應(yīng)物沉積。此外，生物素-PEG-硅烷沉積在滑片上之后，熒光標(biāo)記的中性親和素不會(huì)特異性結(jié)合經(jīng)八1203改性的熔融二氧化硅滑片，相反，熔融二氧化硅滑片的生物素-PEG-硅烷改性(不是用A1203改性)會(huì)導(dǎo)致中性親和素通過生物素配體以非常高的特異性結(jié)合。這種結(jié)果表明，使用甲氧基硅垸反應(yīng)物，僅對(duì)ZMW或類似裝置的熔融的二氧化硅底部進(jìn)行改性的可行性，而幾乎不會(huì)或絕對(duì)不會(huì)對(duì)裝置的鋁壁或頂面進(jìn)行改性。另一個(gè)例子是，通過吸附含正電荷聚電解質(zhì)嵌段和PEG化(或類似防污(anti-fouling))嵌段的共聚物來選擇性地改性負(fù)電荷表面。該聚陽離子嵌段結(jié)合在裝置的負(fù)電區(qū)域，PEG組分提供排斥非特異性結(jié)合的非反應(yīng)性表面。示例性的聚電解質(zhì)-PEG共聚物包括PLL-PEG(聚(L-賴氨酸)-聚(乙二醇))。PEG或其子集可包括偶聯(lián)基團(tuán)，例如生物素或本文所述的其他基團(tuán)(例如參見Hubbell等的美國(guó)專利申請(qǐng)公開2002/0128234"MultifunctionalPolymericSurfaceCoatingsinAnalyticandSensorDevices(分析和傳感裝置中的多功能聚合物表面涂層)"，Huang等(2002)"Biotin-DerivatizedPoly(L-lysine))-g-Poly(ethyleneglycol):ANovelPolymericInterfaceforBioaffmitySensing(生物素-衍生的聚(L-賴氨酸))-g-聚(乙二醇)一種新的用于生物親和感應(yīng)的聚合界面)"Langmuir18(1):220-230)。因此，例如，可用PLL-PEG-生物素涂覆ZMW的Si02表面，然后生物素化的聚合酶通過與PLL-PEG-生物素結(jié)合的親和素或抗生物素蛋白鏈菌素而偶聯(lián)于ZMW的底部。一方面，通過對(duì)另一種類型的材料進(jìn)行改性可補(bǔ)充或促進(jìn)將感興趣的分子選擇性地固定到復(fù)合基板(例如ZMW)中的一種類型材料上。例如，對(duì)于諸如單分子核酸測(cè)序等應(yīng)用中使用的ZMW，希望將聚合酶選擇性地固定到ZMW底部二氧化硅表面上，也希望對(duì)該裝置的金屬壁和頂面(在聚合酶固定之前或之后)鈍化。未改性的鋁或氧化鋁ZMW表面，如上所述在水性溶液中傾向于帶正電，這種表面顯示對(duì)蛋白質(zhì)(例如中性親和素或抗生物素蛋白鏈菌素和聚合酶)、核苷酸類似物(例如，通過類似物的磷酸鹽/酯基團(tuán))和染料(例如，帶有磺酸或羧酸基團(tuán)的染料)的不希望的非特異結(jié)合。如上所述，這種不期望的靜電相互作用可通過在表面結(jié)合鈍化劑來最小化；合適的鈍化劑的其他例子包括但不限于陰離子聚電解質(zhì)如聚(苯乙烯磺酸酯)和聚(丙烯酸)和大分子如肝素和藻蛋白堿。然而，在一些例子中，陰離子聚電解質(zhì)吸附于正電荷表面可能導(dǎo)致表面凈電荷的過度補(bǔ)償，聚陰離子的吸附導(dǎo)致從凈表面電荷正電到負(fù)電的轉(zhuǎn)變。這種改變?cè)瓌t上使核苷酸類似物或其他負(fù)電荷化合物與表面間的非特異性吸附最小，但缺點(diǎn)是許多蛋白質(zhì)(例如聚合酶)對(duì)負(fù)電表面具有親和力。因此，這種過度補(bǔ)償產(chǎn)生的負(fù)電表面可導(dǎo)致不希望的高水平的聚合酶非特異性結(jié)合。這個(gè)問題可通過采用高鹽固定條件來解決；但是，高鹽方案可引起聚電解質(zhì)層的溶脹以及聚電解質(zhì)的部分損失。此外，用聚電解質(zhì)涂覆表面是一動(dòng)態(tài)過程，聚合酶可能最終與聚電解質(zhì)形成穩(wěn)定的活性-封閉復(fù)合物。任選地，代替通過陰離子聚電解質(zhì)吸附來使正電荷表面鈍化，采用通過使含聚電解質(zhì)嵌段(負(fù)電)和PEG化嵌段的共聚物結(jié)構(gòu)的結(jié)合來使正電荷表面鈍化。共聚物的聚電解質(zhì)嵌段使大分子吸附或錨定到裝置的正電區(qū)域(例如，ZMW的鋁或氧化鋁區(qū)域)，PEG組分提供非離子緩沖墊以防止聚合酶與聚電解質(zhì)嵌段的表面附連或復(fù)合。聚電解質(zhì)(PE)-PEG共聚物可以是例如，雙嵌段(PEG-PE)或多嵌段共聚物(例如，PE-PEG-PE或PEG-PE-PEG)以及分支共聚物、梳形聚合物(combpolymer)或樹突樣聚合物(dendron-likepolymer)。一些示例性的線性或支化共聚物示意性地如圖16的圖片VI所示。顯然，雖然在此所述的示例共聚物采用PEG,但可應(yīng)用任何防污主鏈，例如聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、葡聚糖和聚丙烯酰胺。例如，參見美國(guó)專利申請(qǐng)公開2002/0128234，Voros等(2003)"PolymerCushionstoAnalyzeGenesandProteins(分析基因和蛋白質(zhì)的聚合物緩沖墊)"BioWorld2:16-17,Huang等(2002)Langmuir18(1):220-230，和Zoulalian等(2006)J.Phys.Chem.B110(51):25603-25605。用對(duì)不同表面特征具有不同選擇性的兩種組合物對(duì)復(fù)合基板進(jìn)行正交改性在如圖16中示意地示出。如圖片I所示，ZMW1600包括芯體1602，該芯體設(shè)置為穿過鋁包層1604至透明二氧化硅基板1606。鋁芯體的表面上具有氧化鋁薄層1605。如圖片n所示，ZMW的底面用生物素-PEG-硅烷1620和PEG-硅烷1622的混合物進(jìn)行選擇性地改性(例如，所選比率能提供在表面，任選每個(gè)芯體的一個(gè)表面上所需密度的生物素偶聯(lián)基團(tuán)，因此最終提供感興趣的分子)。如圖片III所示，然后用聚陰離子-PEG共聚物1630對(duì)裝置的壁和頂面選擇性改性。如圖片V的放大圖所示，共聚物1630包括聚陰離子(A)嵌段1631和PEG(B)嵌段1632。(應(yīng)注意，鋁表面的改性任選地在二氧化硅表面進(jìn)行改性之前而不是之后進(jìn)行)。然后，生物素化的聚合酶1608通過中性親和素1609與生物素-PEG-硅垸1620上的生物素偶聯(lián)基團(tuán)結(jié)合，如圖片IV所示。一方面，用于使未結(jié)合感興趣的分子的表面(例如，鋁表面)鈍化的組合物也可具有選定密度部分，該部分在該表面增加官能度。例如，在上述PE-PEG共聚物中，熒光淬滅部分1640可附連于PEG嵌段的官能端(圖16的圖片V)。作為另一個(gè)例子，可采用正交配體方案來附連蛋白質(zhì)，與聚合酶或其他感興趣的分子前后作用，例如，在利用生物素固定聚合酶1608的實(shí)施方式中，官能團(tuán)1640可以是SNAP、HA、GST或類似的非生物素偶聯(lián)基團(tuán)，以結(jié)合適當(dāng)改性的第二蛋白質(zhì)。這些第二蛋白質(zhì)可用于裂解新合成的DNA鏈，幫助從溶艱中去除反應(yīng)產(chǎn)物，幫助將反應(yīng)物帶到反應(yīng)區(qū)域，幫助三聯(lián)體淬滅劑的再生，等等。作為另一個(gè)例子，可用聚電解質(zhì)多層使未固定感興趣的分子的復(fù)合基板表面鈍化。聚電解質(zhì)多層可通過相繼沉積相反電荷的聚電解質(zhì)交替層而方便地形成。例如參見Decher(1997)Science277:1232。聚電解質(zhì)多層的形成示意性示于圖17。如圖片I和II所示，步驟1中正電荷基板1705與聚陰離子1732相接觸而吸附于基板表面。步驟2中沖掉過多的聚陰離子。步驟3中，將聚陽離子層1734沉積到步驟l形成的聚陰離子層1732上，步驟4中沖掉過多的聚陽離子。需要時(shí)可重復(fù)進(jìn)行步驟l-2和/或3-4，以交替沉積帶相反電荷的聚電解質(zhì)層，并形成實(shí)際上任意所選厚度和所得表面電荷的多層(如果最后沉積聚陰離子則為負(fù)，或者如果最后沉積聚陽離子則為正)。圖片III顯示了示例性的聚陽離子聚(吖丙錠)和示例性的聚陰離子聚(丙烯酸)，任選地應(yīng)用以形成聚電解質(zhì)多層。任選地，聚電解質(zhì)多層中的最后一層包含聚電解質(zhì)-PEG-共聚物，例如，上述包含聚電解質(zhì)嵌段(正電荷或負(fù)電荷，取決于多層中前一層的電荷)和PEG化的嵌段的共聚物。僅僅作為一個(gè)例子，聚電解質(zhì)多層中的聚(丙烯酸)層后是PLL-PEG或聚谷氨酸鹽-PEG層，提供對(duì)PEG的修飾。顯然，雖然本文所述的示例共聚物采用PEG,但可應(yīng)用任何防污主鏈，例如聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、葡聚糖和聚丙烯酰胺。用對(duì)不同表面特征具有不同選擇性的兩種組合物對(duì)復(fù)合基板進(jìn)行差異性表面衍生化并形成聚電解質(zhì)多層示意性地示于如圖18。如圖片I所示，ZMW1800包括芯體1802，該芯體設(shè)置為穿過鋁包層1804至透明的熔凝二氧化硅層1806。鋁壁表面上具有氧化鋁薄層1805。如圖片II所示，用生物素-PEG-硅烷1820和PEG-硅烷1822的混合物對(duì)ZMW的底面進(jìn)行選擇性地改性。如圖片m所示，然后，將聚電解質(zhì)多層1830沉積到裝置的壁和頂面上。.聚電解質(zhì)多層可如圖17所示沉積；例如，將聚陰離子層(例如聚(丙烯酸)沉積到帶正電的氧化鋁層1805上，然后沉積聚陽離子層(例如聚(吖丙啶))，再是另一層的聚陰離子等。對(duì)于單分子測(cè)序或類似的應(yīng)用，聚電解質(zhì)多層的最后一層通常為聚陰離子層，使得聚電解質(zhì)多層的表面帶負(fù)電以排斥核苷酸類似物(或任選地聚電解質(zhì)-PEG共聚物或類似地提供與類似物低結(jié)合的表面)。如圖片IV所示，生物素化的聚合酶1808通過中性親和素1809與生物素-PEG-硅垸1820上的生物素偶聯(lián)基團(tuán)連接。利用構(gòu)成ZMW的材料的表面性質(zhì)上的差異，例如對(duì)玻璃底部的特異性硅烷化和用聚電解質(zhì)多層對(duì)氧化鋁側(cè)面和頂面鈍化以防止非特異性結(jié)合，能限制聚合酶聚集在ZMW底部，避免聚合酶占據(jù)側(cè)壁和頂面，同時(shí)限制核苷酸類似物等物質(zhì)的非特異結(jié)合。在根據(jù)其不同表面特征對(duì)復(fù)合基板中的不同材料的差異改性的又一個(gè)例子中，采用磷酸鹽/酯或磷酸化合物(也可采用顯示表面特異性化學(xué)吸附和/或形成自集結(jié)單層的其他化合物)。磷酸鹽/酯或磷酸部分與金屬氧化物(例如氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯、氧化鉭、氧化鈮、氧化鐵和氧化錫)牢固結(jié)合，但不與氧化硅牢固結(jié)合。因此，包含至少一個(gè)磷酸鹽/酉旨基團(tuán)(-OP(0)(OH)2，無論是質(zhì)子化、部分或完全去質(zhì)子化、和/或部分或完全中和)或磷酸基團(tuán)(-P(0)(0H)2，無論是質(zhì)子化、部分或完全去質(zhì)子化、和/或部分或完全中和)的化合物可用于對(duì)ZMW或類似復(fù)合基板的氧化鋁表面進(jìn)行選擇性改性。例如，可用磷酸烷基酯或膦酸烷基酯對(duì)金屬氧化物表面改性。(術(shù)語膦酸和膦酸鹽/酯在這里可互換使用)。示例性的磷酸烷基酯和膦酸烷基酯包括但不37限于垸基是直鏈未取代垸基(例如具有1-26個(gè)碳，例如8-20個(gè)碳，例如12-18個(gè)碳的直鏈垸基)的磷酸烷基酯或膦酸烷基酯。其他示例性的磷酸垸基酯和膦酸烷基酯包括官能化的或取代的膦酸烷基酯和磷酸烷基酯，例如，官能化的X-垸基-膦酸酯和X-烷基-磷酸酯，其中X是包括以下基團(tuán)的端基乙烯基(CH2)、甲基(CH3)、胺(NH2)、醇(CH20H)、環(huán)氧化物、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、硫醇、羧酸酯、活性酯(NHS-酯)、馬來酰亞胺、鹵化物、膦酸鹽/酯或磷酸鹽/酯基團(tuán)、或乙二醇(EG)低聚物(EG4、EG6、EG8)或聚乙二醇(PEG)、光引發(fā)劑(例如，光引發(fā)-轉(zhuǎn)移-終止劑，如二硫代氨基甲酸鹽(DTC))、光俘獲基團(tuán)(photocagedgroup)、或光反應(yīng)性基團(tuán)(例如補(bǔ)骨脂素)。X-垸基-膦酸酯或X-垸基-磷酸酯分子中的烷基鏈的間隔基是任選地具有l(wèi)-26個(gè)，優(yōu)選8-20個(gè)，更優(yōu)選12-18個(gè)亞甲基(CH2)重復(fù)單元的疏水柔性連接基。垸基鏈可包含一個(gè)或多個(gè)(最多全部)氟化基團(tuán)和/或可以是沿鏈長(zhǎng)具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵或三鍵的烴鏈。而且，X-烷基-磷酸酯或X-烷基-膦酸酯層也可用作底物，以錨定表面堆疊的其他配體或組分，例如聚電解質(zhì)多層或化學(xué)吸附多層。磷酸垸基酯/膦酸烷基酯可完成穩(wěn)定的抗耐溶劑的自集結(jié)單層，該單層能保護(hù)下面的物質(zhì)(例如鋁)免于腐蝕等，上述結(jié)構(gòu)中烷基柔性連接基的作用是增強(qiáng)化學(xué)吸附單層在水性環(huán)境時(shí)的側(cè)向穩(wěn)定性。在膦酸酯或磷酸酯包括不飽和烴鏈的實(shí)施方式中，雙鍵或三鍵可用作側(cè)向交聯(lián)部分以穩(wěn)定包含該化合物的自集結(jié)單層。具體示例性的磷酸垸基酯和膦酸垸基酯包括但不限于辛基膦酸、膦酸,癸基膦酸，十二垸基膦酸，十六垸基膦酸，十八垸基膦酸，二十二烷基膦酸(艮卩C22膦酸)，羥基沖二垸基膦酸(HO(CH2:h2P(OXOH)2),羥基沖一烷基-膦酸，癸二基二(膦酸)，十二垸基磷酸酯和羥基-十二烷基磷酸酯。橢圓對(duì)稱性和/或接觸角測(cè)量顯示，相對(duì)于Si/Si02表面，辛基膦酸、十八烷基膦酸，羥基-十二烷基膦酸和十二烷基膦酸對(duì)鋁/氧化鋁表面具有特異性。用上述磷酸酯或膦酸酯對(duì)金屬氧化物改性已在Langmuir(2001)17:3428,Chem.Mater.(2004)16:5670;J,Phys.Chem.B(2005)109:1441，Langmuir(2006)22:6469，Langmuir(2006)22:9254,Langmuir(2006)22:3988,J.Phys.Chem.B(2003)107:11726,J.Phys.Chem.B(2003)107:5877,Langmuir(2001)17:462，J.Phys.Chem.B(2006)110:25603,Langmuir(2002)18:3957,Langmuir(2002)18:3537,andLangmuir(2001)17:4014中描述。類似地，可用聚磷酸鹽/酯或聚膦酸鹽/酯對(duì)金屬氧化物表面改性。例如聚膦酸酯的化學(xué)吸附不同于前述聚電解質(zhì)吸附，因?yàn)榕潴w(膦酸基團(tuán))與底物(例如氧化鋁、氧化鋯或氧化鈦)形成化學(xué)配合物。這種相互作用比簡(jiǎn)單靜電相互作用更強(qiáng)且鹽交換的可逆性較低。例子包括但不限于PEG-膦酸酯，例如Zoulalian等(2006)"Functionalizationoftitaniumoxidesurfacesbymeansofpoly(alkyl-phosphonates)(通過聚(垸基-膦酸酯)方式使氧化鈦表面功能化"J.Phys.Chem.B110(51):25603-25605所述，或PEG-聚乙烯(膦酸酯)共聚物。(通常，本文考慮包括化學(xué)吸附部分加上PEG或其他抗污基團(tuán)的共聚物)。其他合適的膦酸鹽/酯包括高分子量聚合膦酸酯，例如聚乙烯膦酸(PVPA)+CH—CH—、^JP03H2.封端的膦酸鹽如ONa203P禾口^^-(CH2C印2o—HONaC02Na71.|/50^)NaC°2H和(從羅迪亞(Rhodia)公司分別以AquariteEC4020和AquariteESL購(gòu)得);共聚物，例如乙烯基膦酸-丙烯酸共聚物(從羅迪亞公司(Rhodia)以AlbritectTMCP30購(gòu)得)。合適的膦酸酯還包括低分子量膦酸酯，例如2-羧乙基膦酸(也稱為3-膦酰基丙酸；從羅迪亞公司以AlbritecfMPM2購(gòu)得)以及表1所列的化合物(以0691^51@化合物形式從密蘇里州圣路易斯的塞露迪亞公司(8011^^Inc.,St.LouisMissouri)購(gòu)得)。膦酸鹽/酯化合物可以鹽形式供應(yīng)(例如，鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽或銨鹽)或者優(yōu)選是游離酸形式。表l:示例性的膦酸化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>下面是膦酸鹽/酯和磷酸鹽/酯在ZMW處理方面的一些示例性應(yīng)用，其中，將感興趣的分子如聚合酶選擇性地固定在ZMW波導(dǎo)芯體的二氧化硅底面上。顯然，類似的考慮適用于對(duì)其他復(fù)合基板的處理。例如，可用膦酸鹽/酯處理ZMW芯片以鈍化ZMW的氧化鋁表面，然后，帶正電荷的聚合酶通過選擇性結(jié)合于帶負(fù)電荷的二氧化硅表面而固定。類似地，可用膦酸鹽/酯處理ZMW芯片，用于后續(xù)固定聚合酶(例如親和素)的俘獲試劑通過與二氧化硅表面結(jié)合而固定，然后聚合酶通過與俘獲試劑結(jié)合被固定。在這些例子中，膦酸鹽/酯對(duì)氧化鋁表面鈍化，提供偏置(例如通過保護(hù)氧化鋁)并提供與核苷酸類似物等物質(zhì)低非特異結(jié)合的表面。在相關(guān)的例子中，聚合酶或俘獲試劑固定之后，在氧化鋁表面上形成聚電解質(zhì)多層以鈍化該表面。膦酸鹽/酯和磷酸鹽/酯也可與對(duì)ZMW二氧化硅表面選擇性改性的化合物聯(lián)用。因此，例如，氧化鋁表面可用膦酸鹽/酯進(jìn)行鈍化和/或保護(hù)，然后用硅烷試劑對(duì)二氧化硅表面改性(或反之亦然，先對(duì)二氧化硅表面改性再沉積膦酸鹽/酯)。在一類實(shí)施方式中，磷酸鹽/酯或膦酸鹽/酯化合物用作第一層，如上所述在該表面上例如通過相繼沉積帶相反電荷的聚電解質(zhì)來建立聚電解質(zhì)多層。在相關(guān)的一類實(shí)施方式中，在該表面上形成化學(xué)吸附的多層?；瘜W(xué)吸附的多層可包括例如，含多種膦酸鹽/酯的試劑(例如，二膦酸酯，如l,n-垸基二膦酸、或多聚膦酸酯，例如聚乙烯基膦酸酯)和鋯(IV)配體的交替層。膦酸鹽/酯的鋯(IV)配基可通過前體如叔丁醇鋯、乙酰丙酮酸鋯、或乙醇鋯提供，膦酸鹽/酯從這些前體取代在鋯周圍的配基。多層可使用本領(lǐng)域公知的方法形成，例如通過將基板或表面交替浸漬到膦酸鹽/酯溶液中和鋯前體的溶液中(有中間加熱退火步驟)，或者通過交替浸漬在膦酸鹽/酯溶液中，和用機(jī)金屬化學(xué)氣相沉積(MOCVD)或快速熱化學(xué)氣相沉積(RT-CVD)鋯(必要時(shí)采用退火步驟)形成。這種化學(xué)吸附的多層為牢固的，類似于聚電解質(zhì)多層，但具有以下優(yōu)點(diǎn)在相鄰層之間而不是物理靜電層之間具有和在如聚電解質(zhì)多層中等同的化學(xué)吸附"交聯(lián)"。另一方面，可采用限制的熱力學(xué)或擴(kuò)散過程對(duì)期望的或不期望的區(qū)域進(jìn)行選擇性活化和/或滅活。具體說，可將活性偶聯(lián)基團(tuán)設(shè)置到基板表面，包括在ZMW結(jié)構(gòu)內(nèi)，以活性形式提供。然后，通過使基板與封端基團(tuán)或封閉基團(tuán)接觸隨后選擇性滅活，防止與這些基團(tuán)的任何額外的偶聯(lián)。因?yàn)榕悸?lián)基團(tuán)位于ZMW內(nèi)的期望區(qū)域(例如底面)，封端劑或封閉劑向這些基團(tuán)的擴(kuò)散受到一定程度的限制。結(jié)果，這些偶聯(lián)基團(tuán)不太容易被封閉(很可能是最后被封閉的基團(tuán))，并可能用于將感興趣的分子向著ZMW底面偶聯(lián)。具體說，通過控制基板整體與封閉劑接觸的時(shí)間，封閉劑的濃度以及封端反應(yīng)的其他條件，例如溫度等，則可以控制波導(dǎo)內(nèi)偶聯(lián)基團(tuán)被保護(hù)或封端的程度。在本發(fā)明的該方面，應(yīng)理解，封閉組分無需特異性結(jié)合特定的偶聯(lián)基團(tuán)以防止感興趣的分子的偶聯(lián)。在一些情況下，這些封閉或封端基團(tuán)通過在波導(dǎo)內(nèi)或表面其他區(qū)域內(nèi)的存在來阻止這種結(jié)合。這可包括在表面上形成薄層或單層的疏水或親水涂層材料，從而阻斷所感興趣的分子的結(jié)合，或者在給定的偶聯(lián)基團(tuán)處提供空間或立體阻擋，而實(shí)際上沒有與偶聯(lián)基團(tuán)的活性偶聯(lián)組分結(jié)合。本發(fā)明的上述方面示意性示于圖6。如圖所示，波導(dǎo)結(jié)構(gòu)600上設(shè)置有均勻的偶聯(lián)基團(tuán)602(以空白菱形表示)的涂層。整個(gè)結(jié)構(gòu)與封端基團(tuán)604(以實(shí)心圓圈表示)接觸導(dǎo)致波導(dǎo)結(jié)構(gòu)內(nèi)擴(kuò)散限制性封端，結(jié)果，面向波導(dǎo)結(jié)構(gòu)底面留下較多活性(未封端)的偶聯(lián)基團(tuán)602，用于在后續(xù)接觸步驟中與感興趣的分子偶聯(lián)。應(yīng)理解，如果僅僅希望將基團(tuán)直接偶聯(lián)于下表面，例如硅醇基團(tuán)在玻璃基板上偶聯(lián)，則可以避免在整個(gè)表面上提供活性偶聯(lián)基團(tuán)的初始步驟。具體說，通過初始封閉表面上任何活性偶聯(lián)基團(tuán)相對(duì)較短的時(shí)間，最容易到達(dá)的那些基團(tuán)(例如，不位于ZMW底部區(qū)域)將首先被封閉。接著，部分封閉或封端的表面基團(tuán)與能夠和該表面基團(tuán)結(jié)合的偶聯(lián)基團(tuán)較長(zhǎng)時(shí)間的接觸將導(dǎo)致這些偶聯(lián)基團(tuán)固定在波導(dǎo)結(jié)構(gòu)的底部區(qū)域上。每一步驟的時(shí)間、濃度、溫度和其他條件可以變化以提供對(duì)每一封閉步驟和偶聯(lián)步驟的最佳條件，并可以根據(jù)容易鑒別的特征和簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)來確定。在期望位置額外提供感興趣的分子的另一種方式是通過例如使用光"鑷(tweezer)"技術(shù)在期望位置中光學(xué)俘獲分子。具體說，采用光限制(例如ZMW)內(nèi)集中的激光能量來產(chǎn)生的高增強(qiáng)的電場(chǎng)，可以提高粒子如感興趣的分子的濃度，或使它們富集到ZMW的聚焦區(qū)內(nèi)，然后使其與該區(qū)域內(nèi)的結(jié)合基團(tuán)偶聯(lián)。感興趣的分子可與另外的基團(tuán)，例如親和素、抗生物素蛋白鏈菌素、中性親和素、生物素、或顆粒如小珠，例如肝素離散珠等偶聯(lián)，以提供足夠大的顆粒用于俘獲。這種光俘獲/增強(qiáng)技術(shù)的使用已有詳細(xì)描述，可用于對(duì)小到10nm的顆粒施加俘獲力。例如，參見Novotny等，Phys.Rev.Letts.79(4):645-648(July1997)，將其內(nèi)容納入本文作為參考。作為上文或下文所述的選擇性激活/滅活過程的替代或另外的過程，本發(fā)明任選地或額外還包括初始圖案化步驟，以在不希望偶聯(lián)感興趣的分子的區(qū)域提供中性或惰性基團(tuán)。這種圖案化通常提供對(duì)定位的粗略選擇，因?yàn)椴⒉皇翘匾庖a(chǎn)生最終的選擇表面。例如，在有關(guān)微孔或納米孔、或其他平面中所提供的其他結(jié)構(gòu)的內(nèi)容中，惰性基團(tuán)可以在基板的上表面印壓、施加或圖案化，而不會(huì)將這些材料沉積到納米結(jié)構(gòu)(例如ZMW)中。先用惰性基團(tuán)保護(hù)非相關(guān)的表面，然后將活性基團(tuán)沉積和偶聯(lián)在相關(guān)區(qū)域內(nèi)。同樣，在ZMW陣列的內(nèi)容中，根據(jù)陣列密度，例如整個(gè)基板上被波導(dǎo)結(jié)構(gòu)占據(jù)的百分比，顯著量的非相關(guān)表面可被封閉，從而防止這些表面容納感興趣的分子，這些分子可能干擾裝置的最終應(yīng)用(例如通過基板損耗、過度形成產(chǎn)物等)。這種圖案化過程可包括將惰性分子簡(jiǎn)單地沖壓到表面上，因而惰性基團(tuán)不會(huì)穿透表面凹陷，或者可涉及采用納米光刻產(chǎn)生印模產(chǎn)生更復(fù)雜的印壓圖案，來提供選擇性沉積，噴墨印刷等，將惰性基團(tuán)選擇性地沉積到整個(gè)基板表面上。本發(fā)明過程的例子示意性示于圖7。如圖所示，基板700包括位于其表面704上的ZMW702的陣列(圖片1)，基板700與具有能阻止活性官能團(tuán)與基板表面704偶聯(lián)的可印壓材料708的另一基板706相接觸(t圖片11)。表面704與可印壓材料708接觸之后，所述材料轉(zhuǎn)移到基板704上但不透入ZMW702(圖片III和IV)。結(jié)果，感興趣的分子隨后與基板700的上表面704的偶聯(lián)被阻斷?？捎翰牧习ǜ鞣N不同材料中的任一種，包括例如能簡(jiǎn)單封端表面上的任何活性基團(tuán)的惰性表面締合基團(tuán)?；蛘撸摬牧峡砂ǚ乐古c感興趣的分子締合的涂覆材料，例如疏水或親水材料，排斥任何結(jié)合或締合的高度帶電材料，或?yàn)樗霾牧咸峁┎豢蓾B過的屏障的材料，例如聚合物涂層、阻擋層等等。應(yīng)理解，任何上述過程可與本文所述的其他過程結(jié)合以進(jìn)一步提高表面選擇性和/或定位。III減法過程如上所述，在另一些方面，采用減法過程在基板的期望區(qū)域中以期望的分子濃度和/或密度提供感興趣的分子。如上所述，減法過程一般性特征不同于上述加法過程，因?yàn)樵摲椒苁垢信d趣分子更廣泛地沉積在如整個(gè)基板表面上，包括期望區(qū)域中。然后，去除過量的感興趣分子，例如非期望區(qū)域中的感興趣分子。在減法過程中可采用許多不同的方法。一個(gè)例子是，采用的方法與上述光致活化過程大致相反。具體說，使用可選擇性裂解的連接基或偶聯(lián)基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)感興趣分子與基板表面的偶聯(lián)。許多光致裂解連接基的化學(xué)是本領(lǐng)域已知的，包括2-硝基芐基連接基(例如參見Rodebaugh，R.;Fraser-Reid,B.;Geysen,H.M.r"ra/^腦1997，3S,7653-7656)，以及許多其他已知的光致裂解連接基類型，例如參見Og.2(15),2315-2317,2000。在本發(fā)明的內(nèi)容中，可使用光致裂解連接基團(tuán)將偶聯(lián)基團(tuán)廣泛地應(yīng)用于基板表面。然后，感興趣的分子基本上非選擇性地與偶聯(lián)基團(tuán)偶聯(lián)。對(duì)期望區(qū)域之外的區(qū)域進(jìn)行選擇性光照，從這些區(qū)域釋放感興趣的分子，使這些分子基本上只在期望區(qū)域內(nèi)偶聯(lián)。然后沖洗基板，去除任何潛在地干擾期望應(yīng)用的分子。本發(fā)明的該方面示意性示于圖8。具體說，在波導(dǎo)結(jié)構(gòu)的表面上以均勻涂層的形式提供偶聯(lián)基團(tuán)802(空白菱形)，但這些基團(tuán)通過光致裂解連接基團(tuán)804(以實(shí)心圓圈表示)附連于表面。然后，使感興趣的區(qū)域之外的表面(例如不在ZMW芯體的底面806處)曝光(以波浪箭頭808表示)，以裂解在非期望區(qū)域中的連接基團(tuán)，這些區(qū)域中最終不希望發(fā)生偶聯(lián)，將偶聯(lián)基團(tuán)保留在期望區(qū)域中，用于后續(xù)的偶聯(lián)，例如底面806中的偶聯(lián)。將感興趣的分子選擇性固定在具體是納米結(jié)構(gòu)孔或其他限制空間，如ZMW的光限制內(nèi)的另一種減法釆用滅活組分，例如使感興趣的分子或使該分子與表面相連的組分滅活，或者導(dǎo)致這些分子從表面消化、失活、釋放或去除。為了便于討論，這些組分在這里稱為"滅活組分"，不管這些組分是降解和/或消化感興趣的分子，滅活這些分子，例如通過不可逆地結(jié)合活性位點(diǎn)或?qū)Ω信d趣的分子的其他改性，等等，或者僅僅使這些分子從表面釋放，例如通過連接基團(tuán)的裂解，等等。這些方法依賴于熱力學(xué)，當(dāng)較大滅活組分(例如酶)擴(kuò)散時(shí)，選擇性地避免ZMW內(nèi)的失活或去除，即蛋白酶或其他較大的大分子組分等較慢擴(kuò)散到波導(dǎo)內(nèi)，類似于圖6所示的偶聯(lián)基團(tuán)的擴(kuò)散限制性俘獲?；蛘?，該方法可依賴于使用附加組分來阻止滅活組分接近在限制空間(例如ZMW)內(nèi)的感興趣的分子。這種阻止作用的一個(gè)尤其優(yōu)選的方面涉及使滅活組分偶聯(lián)于較大組分，例如小珠或其他顆粒，或大的聚合物分子或分子聚集體，這些物質(zhì)至少部分地不能進(jìn)入ZMW。這些較大的組分通常稱為排他性組分，因?yàn)樗鼈兊某叽缁蛐螤钪辽俨糠值夭荒苓M(jìn)入基板上諸如ZMW的凹陷內(nèi)。因?yàn)闇缁罱M分與排他性組分偶聯(lián)，它只能夠或更可能接近在結(jié)合了ZMW的基板的上表面或上或其附近露出的感興趣的分子，因此能夠到達(dá)滅活組分，而不是該結(jié)構(gòu)內(nèi)的那些分子。根據(jù)本發(fā)明的該方面，滅活組分可包括消化分子，例如蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶，即解蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶等，蘇氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和谷氨酸蛋白酶，例如，以非特異性或特異性方式消化，裂解或釋放基于蛋白質(zhì)或肽的感興趣分子或連接組分，例如，使用靶向蛋白酶來裂解特定的連接分子，例如生物素?；蛘?，這些滅活組分可包括碳水化合物消化酶(也稱為糖酶)，例如纖維素酶和淀粉酶，或核酶，例如核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶等，用于消化或裂解基于碳水化合物或核酸的連接分子或感興趣的分子。本發(fā)明的該方面示意性示于圖9。如圖所示，限制性結(jié)構(gòu)(例如ZMW902)的陣列中，感興趣的分子904隨機(jī)沉積在其整個(gè)表面上，例如包括包層908和基層915的表面(步驟I)。然后使表面上固定有滅活組分(或能夠以其他方式滅活、裂解或釋放感興趣分子的組分)的大顆粒，例如小珠912與陣列900相接觸。因?yàn)樾≈?12比波導(dǎo)902的開口大，固定在小珠上的滅活組分僅僅能夠到達(dá)并滅活、消化、裂解或釋放已沉積在結(jié)構(gòu)902外部表面上的感興趣的分子，或滅活組分足夠接近該結(jié)構(gòu)開口的感興趣分子，小珠912上的滅活組分也是如此。結(jié)果，ZMW結(jié)構(gòu)外部表面上或其附近的分子被除去或滅活，僅僅留下波導(dǎo)限制區(qū)或禁入?yún)^(qū)內(nèi)的那些分子(步驟III)。下面將進(jìn)一步闡明本發(fā)明的該方面。在相關(guān)的方面，小珠可具有能夠與感興趣分子結(jié)合或交聯(lián)的結(jié)合組分或交聯(lián)組分。然后，可從表面上機(jī)械去除小珠，將至少一部分的感興趣分子帶走?？墒褂迷S多不同類型的小珠，包括化學(xué)和生物化學(xué)分子中常用的小珠，即瓊脂糖、丙烯酸、二氧化硅或聚丙烯酰胺小珠等，或其他色譜或酶固定介質(zhì)/基質(zhì)，例如F7m或G3m基質(zhì)，購(gòu)自MoBiTec,GmbH(G加ingen,德國(guó))，磁珠或其他金屬珠。類似地，使滅活組分與小珠相連的方法可以變化，以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果。例如，可使用各種長(zhǎng)度的連接基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)滅活基團(tuán)部分地透入ZMW或其他限制空間。類似地，可通過化學(xué)結(jié)構(gòu)和/或連接基的交聯(lián)來調(diào)節(jié)連接基的剛性，以提供滅活組分進(jìn)入限制空間如ZMW的更大或更小的能力。在使用小珠的替代方法中，也可使用其他支架材料來支撐滅活組分并使該組分能夠到達(dá)整個(gè)基板的上表面，以及在一些情況下，到達(dá)該表面上凹陷內(nèi)的表面子集，例如波導(dǎo)芯體。具體說，支架組分導(dǎo)致滅活組分不能被基板表面上的給定凹陷，例如零模式波導(dǎo)芯體完全排斥。通過例子的方式，滅活組分可柔性連接或偶聯(lián)于支架或支承分子，這些分子僅部分地被凹陷排除或者僅僅在一定取向時(shí)被排斥。例如，可使用剛性或半剛性線性分子，例如雙鏈核酸或其他剛性或半剛性的長(zhǎng)形聚合物，包括如在中間位置偶聯(lián)于其的滅活組分(例如蛋白酶)。支承分子具有足夠的長(zhǎng)度，它們只有在適當(dāng)定向，例如縱向取向時(shí)才能進(jìn)入凹陷。因?yàn)榭v向進(jìn)入凹陷或保持在上表面上的結(jié)果，只有在上表面上或凹陷內(nèi)的分子將失活，而不是在滅活組分到達(dá)范圍的分子。類似地，支承分子和中間滅活組分起到煙囪清掃工的作用，通過將滅活組分中間定位在支承分子上，至少部分地去除基板上表面以及凹陷一定距離內(nèi)的感興趣分子，如上所述。在較典型的深約100nm、直徑約70nm的零模式波導(dǎo)結(jié)構(gòu)的情況下，可使用附連有滅活組分(例如蛋白酶等)的長(zhǎng)150nm的雙鏈DNA寡核苷酸。定位與偶聯(lián)于核苷酸類似物是通過共價(jià)偶聯(lián)化學(xué)來實(shí)現(xiàn)的，所述核苷酸類似物在距一端或兩端的給定距離的選定位置處插入寡核苷酸序列。因?yàn)殡p鏈DNA為機(jī)械剛性，附連滅活組分的寡核苷酸的中心部分遠(yuǎn)離支承分子的末端。一旦進(jìn)入波導(dǎo)芯體后，只有支承雙鏈DNA分子的一端將能夠到達(dá)芯體的底部，因此，滅活組分受到幾何上的限制而遠(yuǎn)離芯體的底部或其他限制空間。因此，(例如)在ZMW頂面或側(cè)壁上的感興趣的分子將被除去，而在ZMW底部或其附近(例如，光照體積內(nèi))的感興趣的分子保留。滅活組分與雙鏈核酸的定位偶聯(lián)可通過許多方法來進(jìn)行。例如，在使蛋白質(zhì)(例如蛋白酶或其他酶)偶聯(lián)于核酸支承分子的情況下，通過結(jié)合雙官能交聯(lián)劑如GMBS(得自皮爾斯公司(PIERCE))，使蛋白酶或其他酶發(fā)生馬來酰亞胺活化。這種馬來酰亞胺活化的蛋白質(zhì)可直接偶聯(lián)于具有內(nèi)部巰基改性的單鏈或雙鏈DNA(例如THSS內(nèi)部標(biāo)記的分子，得自歐派隆公司(OperonX)。巰基改性可通過二硫化物封端，二硫化物在被TCEP(也得自皮爾斯公司(PIERCE))結(jié)合時(shí)去除。類似地，具有內(nèi)部巰基的核酸可與雜雙官能交聯(lián)劑(MAL-NHS，馬來酰亞胺-N-羥基琥珀酰亞胺)結(jié)合，再通過胺-NHS反應(yīng)與蛋白酶結(jié)合?？刹捎妙愃频姆磻?yīng)將氨基-改性的DNA結(jié)合于在表面上或表面附近獲得的具有巰基的蛋白酶。前述方法示意性示于圖13。如圖所示，ZMW裝置1300包括位于包層1304內(nèi)的芯體1302，同樣延伸至下面的透明基板1306。如圖片I所示，許多感興趣的活性分子，例如蛋白酶分子1308吸附或以其他方式偶聯(lián)于整個(gè)基板的表面，包括期望的光照區(qū)內(nèi)(以虛線1310表示)，在上表面1312上，和芯1302上壁表面處。在本發(fā)明的內(nèi)容中，如圖片II所示，滅活組分如蛋白酶分子1314在中間位置偶聯(lián)于剛性、線型或細(xì)長(zhǎng)的支承分子，如雙鏈DNA分子1316。因?yàn)槠涑叽绾徒Y(jié)構(gòu)剛性，締合有滅活組分的支承分子1316只能以端點(diǎn)取向方式透入波導(dǎo)結(jié)構(gòu)1300的芯體1302，否則平鋪在整個(gè)結(jié)構(gòu)的上表面1312上。結(jié)果，只有位于上表面或透入波導(dǎo)芯部分距離的滅活組分所到達(dá)范圍內(nèi)的聚合酶潛在地受到滅活組分的影響。這樣，位于波導(dǎo)芯底面上或其附近(例如，光照區(qū)內(nèi))的聚合酶分子免于滅活(圖片m)。應(yīng)理解，通常可選擇滅活組分的定位和/或支承分子的剛性，以調(diào)節(jié)發(fā)生滅活的芯結(jié)構(gòu)內(nèi)的深度。如上所述，滅活組分任選地是蛋白酶(例如解蛋白酶K)，這種蛋白酶非特異性地消化活性分子或偶聯(lián)基團(tuán)等，從基板表面去除這些分子或基團(tuán)。在其他實(shí)施方式中，滅活組分是位點(diǎn)特異性的蛋白酶(例如腸激酶、凝血酶、TEV蛋白酶，或本領(lǐng)域可獲得的多種其他位點(diǎn)特異性蛋白酶中的任一種)。使用位點(diǎn)特異性蛋白酶能避免蛋白酶的自我蛋白酶解成為排他性組分，釋放可溶性活性蛋白酶，這種蛋白酶會(huì)不希望地進(jìn)入結(jié)構(gòu)的最佳限制光照體積。采用位點(diǎn)特異性蛋白酶的示例性的實(shí)施方式示意性示于圖14。如圖所示，ZMW裝置1400包括位于包層1404內(nèi)的芯體1402，同樣延伸至下面的透明基層1406。在該實(shí)施例中，聚合酶分子1408通過肽連接基1421與生物素1420共價(jià)連接，該肽連接基包括位點(diǎn)-特異性蛋白酶1415的裂解識(shí)別位點(diǎn)。生物素1420與抗生物素蛋白鏈菌素1409結(jié)合，再與吸附或以其他方式偶聯(lián)于基板表面的生物素1422結(jié)合，使聚合酶1408偶聯(lián)于表面。如圖片I所示，許多感興趣的活性分子，例如聚合酶分子1408，偶聯(lián)于整個(gè)基板表面，包括期望光照區(qū)內(nèi)(以虛線1410表示)和芯體1402的上壁表面(任選地還在上表面1412上)。如圖片II所示，連接件基1421被蛋白酶1415裂解，從表面釋放聚合酶1408。位點(diǎn)特異性蛋白酶分子1415在中間位置偶聯(lián)于剛性、線型或細(xì)長(zhǎng)的支承分子，如雙鏈DNA分子1416。在上述的實(shí)施方式中，締合蛋白酶1415的排他性組分1416因?yàn)槠涑叽绾徒Y(jié)構(gòu)剛性，只能以端點(diǎn)取向方式透入波導(dǎo)結(jié)構(gòu)1400的芯體1402，否則平鋪在整個(gè)結(jié)構(gòu)的上表面1412上。結(jié)果，只有位于上表面或透入波導(dǎo)芯體的部分距離的滅活組分所到達(dá)范圍內(nèi)的聚合酶潛在地受到滅活組分的影響。因此，位于波導(dǎo)芯體底面或其附近(例如光照區(qū)內(nèi))的聚合酶分子將保持附連于表面，因?yàn)樗鼈兊倪B接基不能達(dá)到蛋白酶而不能裂解。另一個(gè)采用位點(diǎn)特異性蛋白酶的示例性的實(shí)施方式示意性地示于圖15。如圖所示，ZMW裝置1500包括位于包層1504內(nèi)的芯體1502，同樣延伸至下面的透明基層1506。在該實(shí)施例中，如圖片I所示，生物素偶聯(lián)基團(tuán)1522通過肽連接基1521偶聯(lián)于整個(gè)基板表面，其包括用于位點(diǎn)-特異性蛋白酶1515的裂解識(shí)別位點(diǎn)。連接基1521被蛋白酶1515裂解，從表面釋放生物素1522。由于蛋白酶1515偶聯(lián)于排他性組分雙鏈DNA1516，如圖片II所示，蛋白酶從所有表面除去生物素1522，除了芯體1502最底部之外。如圖片III所示，然后，與生物素1520偶聯(lián)的抗生物素蛋白鏈菌素1509(或中性親和素等)和聚合酶1508沉積在基板上，通過與只在最佳限制光照區(qū)1510內(nèi)的生物素1522結(jié)合而保留。另一種選擇性定位感興趣的分子的可選的減法方法包括利用在非期望區(qū)域內(nèi)分子的自身活性。例如，在固定的核酸聚合酶的情況下，已確定當(dāng)該酶摻入熒光標(biāo)記核苷酸時(shí)，在激發(fā)光照下由于光致?lián)p傷而基本失活。根據(jù)本發(fā)明的減法過程，在熒光標(biāo)記的核苷酸或核苷酸類似物的存在下進(jìn)行核酸合成期間，通過使波導(dǎo)基板上表面的酶在核酸合成期間經(jīng)受長(zhǎng)時(shí)間光照，可有效滅活這些分子。對(duì)于上述基于活化/滅活的加法過程，應(yīng)理解，破壞性光照不能透入ZMW的底面或感興趣的區(qū)域，因而這些位置中的酶將保留活性。熒光團(tuán)介導(dǎo)的聚合酶滅活在2005年12月2日提交的共同授予的美國(guó)專利申請(qǐng)11/293,040中詳細(xì)描述，將其內(nèi)容納入本文作為參考。預(yù)計(jì)其他酶/熒光團(tuán)底物對(duì)可產(chǎn)生類似的特征，例如ATP結(jié)合蛋白質(zhì)/熒光標(biāo)記的ATP。此外，還可利用其他組分，這些組分經(jīng)輻射產(chǎn)生自由基，破壞擴(kuò)散接觸的那些分子。在這些化合物的存在下，通過照射波導(dǎo)結(jié)構(gòu)的上表面，可產(chǎn)生氧或其他自由基，滅活在這些化合物擴(kuò)散到達(dá)范圍內(nèi)的感興趣分子。許多這類化合物是本領(lǐng)域已知的，包括例如亞甲基藍(lán)、竹紅菌甲素A、竹紅菌甲素B、金絲桃素、玫瑰紅雙醋酸酯、部花青540以及例如得自英吉/分子探針公司(Invitrogen/MolecularProbes(Eugene，OR.))的其他染料。在本發(fā)明的另一方面，在減法選擇感興趣的分子中可主動(dòng)利用基板的結(jié)構(gòu)特征。具體說，包括光限制(例如ZMW)的基板典型地包括沉積在透明層(例如玻璃或石英)上的金屬層，設(shè)置的波導(dǎo)透過金屬層，在波導(dǎo)底面上露出透明基板。根據(jù)本發(fā)明，包括同時(shí)偶聯(lián)于金屬層和玻璃層的感興趣的分子的整個(gè)基板可選擇性地分配，例如通過在金屬層和其上設(shè)置的溶液之間施加電勢(shì)，例如通過使用與該流體接觸的電極，來去除金屬表面上的感興趣的分子。因?yàn)橄旅娴幕宀粚?dǎo)電，基板表面與流體間的電場(chǎng)將顯著小于金屬層與流體間的電場(chǎng)。然后，利用電勢(shì)將感興趣的分子從金屬表面選擇性地驅(qū)動(dòng)到溶液中(參見圖10)?？蛇x擇和/或控制這種驅(qū)動(dòng)力以產(chǎn)生電泳力，例如驅(qū)動(dòng)帶電的感興趣的分子離開在非期望表面區(qū)域的表面，或驅(qū)動(dòng)封端基團(tuán)靠近該表面，或者可選地或附加地，改變金屬表面的局部環(huán)境，例如因金屬表面上產(chǎn)生質(zhì)子而改變pH，導(dǎo)致從表面釋放，例如通過使用酸不穩(wěn)定連接基，基于電荷的連接鍵，例如氫鍵、通過產(chǎn)生局部惡劣環(huán)境使金屬表面上的被感興趣的分子水解降解，等等。在另一方面，可采用電化學(xué)釋放連接基化合物，從電學(xué)活性表面釋放感興趣的分子。通過例子的方式，可以在復(fù)合(金屬/絕緣體)基板的整個(gè)表面上將包括電化學(xué)可控偶聯(lián)的連接分子圖案化。施加電流通過表面的金屬部分導(dǎo)致釋放偶聯(lián)的分子。這種電轉(zhuǎn)換連接基的例子包括連接于帶有連接基化合物的醌丙酸酯的自集結(jié)單層，即金表面上的垸基硫醇鹽。對(duì)下面的金屬基板施加電勢(shì)導(dǎo)致醌還原為氫醌，快速發(fā)生內(nèi)酯化而釋放柔性連接的分子，例如生物素(例如參見Hodneland等，J.Am.Chem.Soc.2000，122:4235-4236)。除了在光限制內(nèi)使用該方法，應(yīng)理解，這種電泳和/或電化學(xué)選擇和固定方法可類似地應(yīng)用于其他雜化分子基板類型，包括例如依賴于表面締合的感興趣的分子的基于金屬或半導(dǎo)體的傳感器,例如ChemFETS(化學(xué)場(chǎng)效應(yīng)晶體管)等。具體說，可釆用金屬或半導(dǎo)體傳感器元件可作為在傳感器表面排斥或吸引不同基團(tuán)以增強(qiáng)偶聯(lián)的一個(gè)電極。其他減法過程可釆用頂離方法，用頂離層涂覆其他活性表面，該頂離層將感興趣的分子帶到基板的上表面，在有些情況下透入ZMW內(nèi)一定的距離。該層的頂離將該層與感興趣的分子一起帶走，使諸如在ZMW底面處的感興趣的分子保留。該技術(shù)示意性地示于圖11。如圖所示，將感興趣的分子1104均勻或隨機(jī)分布地沉積到基板1100上，該基板包括期望這些分子的選定區(qū)域(步驟1)。在圖11的情況下，這些區(qū)域包括光限制區(qū)如ZMW1102。然后，使涂覆層1106以粘稠液體的形式沉積在表面上，例如粘度為1或更高(步驟n)。因?yàn)橥扛矊拥南鄬?duì)粘度和波導(dǎo)1102的相對(duì)小的尺寸，和/或波導(dǎo)芯體中存在的液體材料相對(duì)較慢的材料擴(kuò)散，涂覆層1106—般不會(huì)完全流入波導(dǎo)結(jié)構(gòu)。然后通常使涂覆層固化，例如通過空氣干燥、加熱或暴露于UV輻射、化學(xué)交聯(lián)，帶走涂覆層內(nèi)的感興趣的分子，例如感興趣的分子1108。一旦去除，涂覆層中帶走的任何感興趣分子也被除去，僅在波導(dǎo)結(jié)構(gòu)內(nèi)留下感興趣分子，例如分子lllO(步驟III)。雖然上述方法依賴于涂覆層透入波導(dǎo)結(jié)構(gòu)的有限能力，而使該結(jié)構(gòu)內(nèi)的感興趣的分子保留，應(yīng)理解，該方法也可應(yīng)用于不存在這種限制結(jié)構(gòu)的情況。例如，可通過絲網(wǎng)或噴墨印刷方法使涂覆層在表面上選擇性圖案化，以從選定區(qū)域帶走和去除感興趣的分子。另一種減法的選擇性固定方法通常依賴于掩蔽方案，以確保感興趣分子定位在期望的區(qū)域。具體說，這種掩蔽方案通常采用掩蔽層，該掩蔽層可以去除，以從非期望的位置消除感興趣的分子，或該掩蔽層可沉積在均勻分布的眾多感興趣的分子上，以使非期望位置中的這些分子不能接近期望的操作。本發(fā)明的有些方面也包括其他更簡(jiǎn)單粗暴力的方法，尤其涉及減法過程。例如，可使用簡(jiǎn)單的消融方法來去除露出的表面上的偶聯(lián)基團(tuán)，例如波導(dǎo)陣列基板上表面或其附近的偶聯(lián)基團(tuán)。預(yù)計(jì)除去這些基團(tuán)可降低結(jié)合于波導(dǎo)結(jié)構(gòu)外部表面的感興趣的分子的量。這種消融方法包括例如，在接觸或暴露后去除材料的激光消融技術(shù)、高剪切流體消融技術(shù)、機(jī)械消融技術(shù)等。通過在上表面實(shí)施消融過程，預(yù)計(jì)幾乎沒有或沒有消融力會(huì)傳播到波導(dǎo)結(jié)構(gòu)內(nèi)。可進(jìn)行額外的調(diào)節(jié)以進(jìn)一步增強(qiáng)該過程的選擇性。例如，采用激光消融技術(shù)，可以將光束以一定傾斜角度導(dǎo)向基板的上表面，從而在高長(zhǎng)寬比的凹陷(例如ZMW)中透入最小的距離。類似地，可調(diào)制消融能量使其聚焦到不包括期望最終偶聯(lián)感興趣的分子的區(qū)域的區(qū)域上，例如聚焦到陣列中ZMW之間的基板表面區(qū)域或間隔上。一旦在基板表面，例如，在期望的區(qū)域如ZMW的底面上設(shè)置偶聯(lián)基團(tuán)，則感興趣的分子將與這些活性基團(tuán)偶聯(lián)。如本文所述，偶聯(lián)可通過化學(xué)官能團(tuán)，例如羥基、氨基、環(huán)氧基團(tuán)等?；蛘?，偶聯(lián)可通過特異性結(jié)合物發(fā)生，例如特異性結(jié)合對(duì)中的一個(gè)是附連于表面的偶聯(lián)基團(tuán)(或附連于與表面相連的偶聯(lián)基團(tuán))，則結(jié)合對(duì)中的另一個(gè)附連于感興趣的分子或與其整合。在尤其優(yōu)選的方面，使用這種特異性結(jié)合對(duì)將感興趣分子與表面偶聯(lián)，包括例如使用親和素、抗生物素蛋白鏈菌素或中性親和素作為結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員，使用生物素作為另一個(gè)成員。此外，還可采用夾心結(jié)合的方案，例如使生物素與感興趣的區(qū)域的表面偶聯(lián)，然后與親和素連接，再連接于和感興趣的分子偶聯(lián)的生物素分子。通常，使用硅垸連接基團(tuán)作為起始的官能團(tuán)。該基團(tuán)可直接位于表面上，或者如上所述，用對(duì)其他偶聯(lián)惰性的類似的連接基硅烷稀釋。在尤其優(yōu)選的方面，第一步，將具有(例如)生物素基團(tuán)的連接硅烷固定，然后通過偶聯(lián)有連接酶的生物素基團(tuán)的橋接親和素基團(tuán)，而使感興趣的分子(例如聚合酶)偶聯(lián)。應(yīng)理解，多種不同構(gòu)型中的任一種的實(shí)施都在本發(fā)明的內(nèi)容之內(nèi)。在感興趣的分子是酶或其他活性蛋白的情況下，固定的方向是優(yōu)化酶活性的重要特征。例如，在DNA聚合酶的情況下，至少部分地因?yàn)橐恍┓肿拥娜∠蚍绞阶柚蛊浔憩F(xiàn)最佳活性，導(dǎo)致聚合酶與表面的隨機(jī)吸附產(chǎn)生的活性明顯小于100%。因此，希望提供特定取向的分子，通過在分子上提供結(jié)合基團(tuán)(anchoringgroup)以增加正確取向的可能性。該方法已在2005年12月22日提交的共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)60/753,446中描述，將其內(nèi)容納入本文作為參考?；蛘?，給基板分子或基板替代物提供酶，能夠以封閉酶活性位點(diǎn)的方式阻止表面吸附。通過例子的方式，己經(jīng)確定，在模板核酸分子的存在下，核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)的固定可產(chǎn)生明顯更高活性的表面固定的聚合酶。雖然不受具體操作理論的限制，相信由于相關(guān)的模板的立體或其他干擾作用，聚合酶活性位點(diǎn)內(nèi)模板分子的存在能夠防止聚合酶以干擾活性位點(diǎn)的方式固定。雖然可使用模板核酸分子，也可使用其他模板樣分子，包括例如LNA聚合物鏈、PNA聚合物或其他核酸類似物。IV.實(shí)施例實(shí)施例l:用于選擇性固定DNA聚合酶的光致活化基團(tuán)所用基板包括玻璃基層，該玻璃層上沉積有鋁包層。在包層中制造ZMW芯體陣列，以提供穿過包層到達(dá)玻璃基板的孔。任選對(duì)整個(gè)基板進(jìn)一步處理，以在包層和芯體上提供絕緣薄層，例如提供基本上均勻的表面。這種層通常包括氣相沉積技術(shù)施加的Si02涂層，所述沉積技術(shù)包括例如CVD和MVD方法，以及其他方法如利用在玻璃體系上旋涂的流體沉積或原位成形。對(duì)基板表面衍生化，首先提供偶聯(lián)于表面的相對(duì)均勻的眾多氨基端基。例如，對(duì)于玻璃表面，這種衍生化通常采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)氨基硅垸化學(xué)。或者，胺基團(tuán)可提供在連接分子上，該分子通過存在的羥基偶聯(lián)于表面或以其他方式衍生的表面。這種偶聯(lián)基團(tuán)的密度有限以進(jìn)一步控制最終與表面結(jié)合的感興趣的分子的密度(例如，參見2005年9月30日提交的共同授予的美國(guó)專利申請(qǐng)11/240,662，將其內(nèi)容納入本文作為參考)。然后，使用已知的化學(xué)，例如通過生物素分子上的環(huán)氧基團(tuán)，將用合適的光不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)(例如MeNPOC)封端的生物素分子偶聯(lián)于該衍生的表面。清洗表面之后，將合適的光照輻射導(dǎo)向基板，通過透明玻璃基板層，僅照射在ZMW底面處或其附近的生物素基團(tuán)并使其脫保護(hù)。然后，與親和素、抗生物素蛋白鏈菌素或中性親和素連接的DNA聚合酶與基板接觸，選擇性地結(jié)合在波導(dǎo)底部露出的親和素。在第二個(gè)示例性的過程中，光致活化酸基團(tuán)(例如偶聯(lián)于表面的(x-甲基苯甲酰甲酯)以上述相同的方式偶聯(lián)于表面。以313nm的光照通過ZMW，在波導(dǎo)底面產(chǎn)生酸基團(tuán)，然后與氨基生物素基團(tuán)接觸，再偶聯(lián)于連接親和素的聚合酶，只在波導(dǎo)底面或其附近產(chǎn)生酶基團(tuán)。實(shí)施例2:使用結(jié)合蛋白酶的小珠選擇性消化DNA聚合酶預(yù)先在PDMS墊料存在下(以提供底層)對(duì)ZMW進(jìn)行等離子體處理，該ZMW上提供吸附在整個(gè)陣列表面上的029N62DDNA聚合酶(與環(huán)形模板核酸配合)的基本上均勻表面，包括在包層的上表面。然后，室溫下，該陣列與具有固定化解蛋白酶K的小珠(西格瑪化學(xué)公司(SigmaChemicalCo.)，P0803或P9290)在25mMTris-HCl,pH7.5，10mM的J5-巰基乙醇，1mMEDTA中接觸5分鐘。小珠直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出陣列上波導(dǎo)芯體的標(biāo)稱直徑，避免小珠或其結(jié)合的蛋白酶分子以任何顯著程度進(jìn)入芯體。然后，在適合DNA合成的條件下(50mMTris-HCl,pH7.5,75mMKC1,20mM(NH4)2S04,10mMU-巰基乙醇，0.7mMMnCl2)，包含四種dNTP的聚合反應(yīng)混合物與陣列接觸，在3(TC下進(jìn)行合成30分鐘。合成后，用SybrGold著色劑對(duì)陣列上任何合成的DNA進(jìn)行染色。然后，用標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡對(duì)陣列成像。陣列圖像以及負(fù)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的圖像示于圖12。如負(fù)性對(duì)照(行I)所示，底側(cè)光照(列A)顯示在波導(dǎo)結(jié)構(gòu)內(nèi)存在顯著量的DNA，而頂側(cè)光照和觀察(列B)顯示在整個(gè)陣列表面上產(chǎn)生均勻的DNA層。在解蛋白酶處理的陣列中(行II),底側(cè)和(列A)和頂側(cè)(列B)顯示在特定波導(dǎo)內(nèi)DNA存在的類似模式。而且，如圖所示，陣列中除波導(dǎo)內(nèi)部外，波導(dǎo)上表面上幾乎不存在DNA，表明相對(duì)于對(duì)照實(shí)驗(yàn)中存在的高水平DNA合成的顯著降低。還應(yīng)注意，從上表面顯示存在DNA的波導(dǎo)追蹤至從下表面顯示DNA存在的相同波導(dǎo)，表明DNA合成發(fā)生在波導(dǎo)結(jié)構(gòu)內(nèi)而不是在波導(dǎo)芯體的外部。這也表明，在波導(dǎo)內(nèi)進(jìn)行合成的DNA有明顯的長(zhǎng)度，例如大于500個(gè)堿基，潛在地一直到1000個(gè)或更多個(gè)堿基長(zhǎng)度，橫跨在直徑約70nm、深約100nm的芯體區(qū)域的波導(dǎo)結(jié)構(gòu)的頂部和底部的光照區(qū)域。DNA合成實(shí)驗(yàn)也在標(biāo)記的核苷酸聚磷酸鹽/酯類似物(在末端磷酸根基團(tuán)處標(biāo)記)的存在下進(jìn)行(例如，參見美國(guó)專利申請(qǐng)公開2003-0044781和Levene等，Science(2003)299:609-764，將其全部?jī)?nèi)容納入本文作為參考)。這些試驗(yàn)顯示，相對(duì)于沒有用蛋白酶處理的波導(dǎo)陣列明顯更佳的信噪比，表明來自其他噪音源(例如被聚合酶反應(yīng)的產(chǎn)物標(biāo)記)的干擾顯著降低。結(jié)果清楚地表明，僅在分析用基板的期望區(qū)域(即觀察區(qū))內(nèi)提供感興趣的分子(聚合酶)，在基板最終應(yīng)用中具有深遠(yuǎn)的有益結(jié)果。實(shí)施例3:通過差異性改性表面來選擇性固定DNA聚合酶下面提出了一系列實(shí)驗(yàn)，表明將DNA聚合酶選擇性固定到ZMW的底面上和用聚電解質(zhì)多層對(duì)保留的ZMW表面鈍化。該過程采用硅烷與玻璃和氧化鋁的差異反應(yīng)性，該過程示意性地示于圖18。PEG-生物素硅垸化在所用條件下特異性針對(duì)玻璃，從而導(dǎo)致僅在ZMW底面上的化學(xué)衍生化。然后，用聚電解質(zhì)多層鈍化鋁層，在該實(shí)施例中是2.5x的PAA/PEI/PAA/PEI/PAA多層(其中，PAA是聚(丙烯酸)，PEI是聚(吖丙啶))。生物素標(biāo)簽的聚合酶被聚電解質(zhì)多層排斥，而是通過親和素化學(xué)結(jié)合于生物素化的PEG表面，從而導(dǎo)致聚合酶偏置地固定在ZMW的底面。此外，聚電解質(zhì)多層限制核苷酸類似物與鋁層的非特異結(jié)合。將聚合酶偏置固定在ZMW底面的過程是如下實(shí)現(xiàn)的。在2托(中等功率設(shè)置)下，ZMW芯片在氧等離子體中清潔2分鐘。使用PEG甲氧基硅烷和生物素-PEG硅烷(聚合物來源公司(PolymerSourceInc))的混合物，在270:1(w/w)的乙醇:甲醇溶劑中，于4°C，進(jìn)行PEG-生物素硅烷化反應(yīng)3小時(shí)。用甲醇沖洗樣品，在熱水(7(TC)中超聲3分鐘，用冷水洗滌。聚電解質(zhì)過程包括在室溫下，按PAA/PEI/PAA/PEI/PAA的順序，將芯片連續(xù)浸入20mg/ml的聚丙烯酸和聚吖丙啶(西格瑪公司(Sigma-Aldrich)，用HC1調(diào)節(jié)pH為7.5)中5分鐘，每一步后用水沖洗3次。最后的沖洗是用5體積的等同量的水。比較四種核苷酸類似物與偏置固定表面(用PEG-硅垸的混合物處理，然后形成聚電解質(zhì)多層的ZMW芯片)和與對(duì)照表面(等離子體-PDMS處理的芯片)的非特異結(jié)合。對(duì)照芯片上采用的等離子體-PDMS處理因?yàn)檎麄€(gè)結(jié)構(gòu)上涂覆均勻?qū)佣淮嬖谄校瑓⒁?006年11月27提交的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US2006/045,429。芯片用熒光標(biāo)記的核苷酸類似物(A488-dA4P、FAM-A532-dG4P、FAM-A594-dT4P、A633-dC4P，各5jiM，例如參見美國(guó)專利申請(qǐng)11/645,223的類似物命名)的混合物保溫培養(yǎng)，然后經(jīng)歷激光照射。以100fps照相速率獲得1分鐘電影。采用閾值算法，通過定制的分析軟件分析熒光痕跡，以確定每一種圖譜分離的類似物的圖中顯示的非特異吸附事件的數(shù)量。如圖19所示，偏置的固定表面在防止非特異性類似物結(jié)合方面與等離子體-PDMS表面一樣好(顯示優(yōu)良的非特異結(jié)合特征)。沒有對(duì)結(jié)合于未處理表面的類似物進(jìn)行定量，因?yàn)轭愃莆锱c未處理表面的結(jié)合程度未達(dá)到被單脈沖識(shí)別的程度。聚電解質(zhì)多層在鋁表面上的沉積阻止了聚合酶的非特異結(jié)合，如圖20所55示。在用2.5xPAA/PEI/PAA/PEI/PAA聚電解質(zhì)多層處理的鋁表面上基本沒有觀察到DNA合成(圖片1)，而在沒有用聚電解質(zhì)多層處理的對(duì)照表面的整個(gè)表面上產(chǎn)生DNA(圖片II)。聚合反應(yīng)過程如下。4°C，在含有25mMTris-乙酸鹽，pH7.5,300mM醋酸鉀，0.05%吐溫20禾口5mM二硫蘇糖醇的BF-300緩沖液中30分鐘，100nM聚合酶與中性親和素(Neutravidin，含量超過150nM)結(jié)合。通過用不含醋酸鉀的相同緩沖液(BF-0)2倍稀釋，將該溶液稀釋至醋酸鉀有效濃度為150mM。4tl下，將聚合酶/中性親和素混合物在ZMW芯片上保溫培養(yǎng)30分鐘，用BF-150緩沖液洗滌(該緩沖液與BF-300相同只是包含150mM醋酸鉀)3次。4。C下，在補(bǔ)充了4mMEDTA的反應(yīng)緩沖液(50mMTris乙酸鹽，pH7.5，75mM醋酸鉀，20mM硫酸銨，0.05%吐溫20禾口5mM二硫蘇糖醇)中加入100nM模板20分鐘。除去模板溶液，加入在反應(yīng)緩沖液中的延伸反應(yīng)混合液(extensionreaction)，該混合物含0.7mMMnCl2，dATP、AlexaFluorChromaTide488-dCTP(英杰公司(Invitrogen))、dGTP禾口dTTP各10|iM。室溫下進(jìn)行DNA合成10分鐘，然后用補(bǔ)充1mMEDTA的BF-150洗滌5次。使用60x0.9NA生理物鏡在ZMW芯片頂(溶液)側(cè)成像，和60x1.2NA物鏡用于底側(cè)，在寬視野熒光顯微鏡(奧林巴斯(Olympus))上觀察ChromaTide核苷酸加入DNA中。偏置固定過程(用PEG-硅烷的混合物處理ZMW芯片，然后形成聚電解質(zhì)多層)，導(dǎo)致聚合酶選擇性固定在波導(dǎo)內(nèi)。如前段所述在偏置固定ZMW芯片上和對(duì)照ZMW芯片上(均勻涂布，等離子體-PDMS層在下，然后PEG-甲氧基/生物素-PEG硅垸衍生化)進(jìn)行聚合反應(yīng)。偏置固定ZMW陣列的圖像以及對(duì)照陣列的圖像均示于圖21。如對(duì)照所示(列11)，底側(cè)光照(行B)顯示波導(dǎo)結(jié)構(gòu)內(nèi)存在顯著量的DNA，而頂側(cè)光照(行A)顯示在整個(gè)陣列表面上產(chǎn)生均勻的DNA層。相反，對(duì)于偏置固定ZMW陣列(列1)，底側(cè)(行B)和頂側(cè)(行A)在特定波導(dǎo)內(nèi)都顯示類似的DNA存在的圖案。而且，如圖所示，陣列中除波導(dǎo)內(nèi)部之外的上表面上幾乎不存在DNA，表明相對(duì)于對(duì)照實(shí)驗(yàn)中存在的DNA合成水平的顯著降低。還應(yīng)注意，從上表面顯示DNA存在的波導(dǎo)追蹤到從下表面顯示DNA存在的相同波導(dǎo)，表明DNA合成是在波導(dǎo)結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)生，而不是在波導(dǎo)芯體的外部；參見圖22，圖中，將偏置固定ZMW陣列的頂面圖像(圖片I)和相同陣列的底面圖像(圖片II)進(jìn)行重合(圖片III)。這些結(jié)果表明，聚電解質(zhì)多層對(duì)核苷酸類似物是相對(duì)非粘性的，且聚電解質(zhì)多層能很好地鈍化結(jié)合于鋁表面的聚合酶。差異性PEG-生物素-硅垸化學(xué)，然后是聚電解質(zhì)多層鈍化，產(chǎn)生具有高對(duì)比度的聚合酶偏置固定。實(shí)施例4:采用膦酸的選擇性固定和鈍化聚乙烯基膦酸(PVPA)沉積到未處理的ZMW上導(dǎo)致對(duì)結(jié)合于鋁表面的非特異蛋白(例如中性親和素和聚合酶)和核苷酸類似物鈍化的ZMW。PVPA是鋁特異性的，不會(huì)影響ZMW的Si02底面，可用于非特異俘獲劑或用于特異性聚合酶沉積的聚合固定或后續(xù)的衍生化(例如，通過硅垸化或化合物如PLL-PEG的結(jié)合)。用PVPA處理活復(fù)合材料基板(例如玻璃上100nm鋁膜)導(dǎo)致中性親和素俘獲試優(yōu)先固定在基板的Si02部分，而不是鋁部分上，如圖23所示。在沒有用PVPA處理的基板上，更多的中性親和素沉積在基板的鋁部分上(圖片I的行A)而不是Si02部分上(圖片I的行B)。相反，在PVPA-處理的基板上，中性親和素優(yōu)先固定到基板的Si02部分上(圖片II的行B)，而幾乎沒有中性親和素粘附于基板的鋁部分(圖片II的行A)。為了評(píng)價(jià)中性親和素結(jié)合，芯片先在丙酮中漂洗，然后在異丙醇中漂洗并用氮?dú)饬鞲稍?，清潔去除芯片的保護(hù)性光致抗蝕層。在2托(中等功率設(shè)置)下，芯片在等離子體凈化器(Harrick)中清潔2分鐘。在設(shè)置至90°C的加熱塊上進(jìn)行PVPA處理，將芯片置于加熱塊上，并將90°C的PVPA溶液(分子量24,000，來自聚合科學(xué)公司(PolysciencesInc.)(Warrington,賓夕法尼亞州)，25%儲(chǔ)備液用水稀釋至2%工作溶液濃度)置于芯片上2分鐘，然后用水漂洗。氮?dú)饬鞔底叨嘤嗟乃?，然后在干燥烘箱?CTC下熱處理10分鐘。將40nmA488-中性親和素乳膠小珠(英杰公司)在緩沖液(50mMMOPS-乙酸鹽，pH7.5,75mM醋酸鉀，5mMDTT)中稀釋至0.01%，室溫下與芯片保溫培養(yǎng)15分鐘。芯片用水漂洗，使用60x0.9NA生理學(xué)物鏡(奧林巴斯)在寬視野熒光顯微鏡上成像。PVPA處理減少核苷酸類似物結(jié)合，如圖24所示。用PVPA處理ZMW芯片，如實(shí)施例3所述，分析核苷酸類似物與芯片的非特異結(jié)合。如圖24所示，該類似物與未處理的ZMW具有明顯的非特異結(jié)合(圖片II),而在PVPA-處理的ZMW中幾乎沒有觀察到類似物的結(jié)合(圖片1)。盡管為了說明的目的已經(jīng)進(jìn)行詳細(xì)的討論，但應(yīng)該意識(shí)到的是，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，業(yè)內(nèi)熟練技術(shù)人員可以采用多種己知或者適當(dāng)?shù)淖兓３巧舷挛膬?nèi)容的清晰和明確闡述，本文所提供的任何濃度數(shù)值就混合數(shù)值或者百分比而言都是給定的，而與基于混合物的特定分量或者其它附加所產(chǎn)生的任何變化無關(guān)。對(duì)于本文還沒有明確包含的內(nèi)容，用于本披露參考的所有出版的參考文獻(xiàn)和專利文檔都通過引用全文合并于此，以用于所有目的。權(quán)利要求1.一種制備其上具有選擇的活性區(qū)域的基板的方法，所述方法包括提供其上限定有許多納米結(jié)構(gòu)的基板，其中，所述各納米結(jié)構(gòu)限制第一激活控制劑的能力，以在基板的選定的表面部分上提供活性化學(xué)基團(tuán)；和使所述基板與至少所述第一激活控制劑接觸，以在基板的選定的表面部分上選擇性地提供活性化學(xué)基團(tuán)。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米結(jié)構(gòu)能基本上阻止所述基板的選定的表面部分與所述第一激活控制劑接觸。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述提供步驟包括在基板表面上提供可滅活的化學(xué)官能團(tuán)，所述第一激活控制劑使在基板表面上除所述選定部分之外的部分上的化學(xué)官能團(tuán)滅活。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米結(jié)構(gòu)能基本上阻止基板表面上除所述選定部分之外的部分與所述第一激活控制劑接觸。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述提供步驟包括在基板表面上提供可活化的化學(xué)官能團(tuán)，所述第一激活控制劑使基板表面上選定的部分上的化學(xué)官能團(tuán)激活。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米結(jié)構(gòu)包括設(shè)置在基板表面中的納米級(jí)孔。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米結(jié)構(gòu)包括設(shè)置在不透明基板中的納米級(jí)光學(xué)孔。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述提供步驟包括在基板表面上提供化學(xué)官能團(tuán)，其中，所述化學(xué)官能團(tuán)在與所述激活控制劑接觸后活化或失活。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述納米結(jié)構(gòu)包括納米級(jí)孔，所述選定區(qū)域包括所述納米級(jí)孔的底面；所述激活控制劑包括帶走化學(xué)官能團(tuán)且基本上不會(huì)擴(kuò)散到納米級(jí)孔內(nèi)的夾帶基質(zhì)；和該方法還包括去除夾帶基質(zhì)以從基板上除在所述選擇區(qū)域外的基板表面部分除去化學(xué)官能團(tuán)的步驟。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一激活控制劑包括其所選波長(zhǎng)能激活或滅活基板表面上的化學(xué)官能團(tuán)的光。11.如權(quán)利要求io所述的方法，其特征在于，選擇所述光以激活化學(xué)官能團(tuán)，所述納米結(jié)構(gòu)能基本上阻止基板表面上除所述選定部分之外的表面部分與所述第一激活控制劑接觸。12.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)官能團(tuán)包括選自下組的光致活化基團(tuán)硝基藜戸基、l-芘基甲基、6-硝基藜蘆氧基羰基、二甲基二甲氧基節(jié)氧基羰基、2-硝基芐氧基羰基、甲基、甲基-6-硝基胡椒氧基羰基、2-氧亞甲基蒽醌、二甲氧基芐氧基羰基、5-溴-7-硝基二氫吲哚基、o-羥基-a-甲基肉桂?；约八鼈兊幕旌衔铩?3.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，選擇所述光以滅活化學(xué)官能團(tuán)，所述納米結(jié)構(gòu)能基本上阻止所述選定的基板表面部分與所述第一激活控制劑接觸。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)官能團(tuán)通過可光致裂解的連接基團(tuán)與基板表面偶聯(lián)。15.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述化學(xué)官能團(tuán)包括第一可活化的化學(xué)官能團(tuán)；所述第一激活控制劑包括其選定波長(zhǎng)能活化所述第一可活化化學(xué)官能團(tuán)的光；所述基板包括不透明層和透明層，所述納米結(jié)構(gòu)包括設(shè)置成穿過所述不透明層至所述透明層的零模式波導(dǎo)，所述接觸步驟包括將光導(dǎo)向所述基板的透明層以激活所述第一可活化的化學(xué)官能團(tuán)，在所述透明層上或其附近的零模式波導(dǎo)內(nèi)提供第一活性化學(xué)官能團(tuán)。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)所述接觸步驟中提供的所述第一活性化學(xué)官能團(tuán)封端，提供可由其波長(zhǎng)不同于所述接觸步驟中的波長(zhǎng)的光激活的第二可活化的化學(xué)官能團(tuán)；和將光導(dǎo)向所述基板的透明層，所述光的波長(zhǎng)選擇為能激活所述第二可活化的化學(xué)官能團(tuán)而不是所述第一可活化的化學(xué)官能團(tuán)；其中，所述對(duì)光導(dǎo)向的步驟在能夠使在所述第一接觸步驟中活化的化學(xué)官能團(tuán)部分激活的條件下進(jìn)行。17.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于所述化學(xué)官能團(tuán)包括可滅活的化學(xué)官能團(tuán)；所述第一激活控制劑包括其選定的波長(zhǎng)能使可滅活的化學(xué)官能團(tuán)滅活的光；所述基板包括不透明層和透明層；所述納米結(jié)構(gòu)包括設(shè)置成穿過所述不透明層至所述透明層的零模式波導(dǎo)；和所述接觸步驟包括將光導(dǎo)向所述基板的不透明層以使所述不透明層上的化學(xué)官能團(tuán)滅活。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述可滅活的化學(xué)官能團(tuán)包括能通過可光致裂解的連接基團(tuán)與基板表面偶聯(lián)的活性化學(xué)官能團(tuán)。19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述可光滅活的化學(xué)官能團(tuán)包括通過在所述接觸步驟中曝光而至少部分地被滅活的蛋白質(zhì)。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述可滅活的化學(xué)官能團(tuán)包括熒光團(tuán)結(jié)合蛋白，所述接觸步驟在所述熒光團(tuán)的存在下進(jìn)行。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述熒光團(tuán)結(jié)合蛋白包括核酸聚合酶。22.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述第一激活控制劑包括能夠激活或滅活所述化學(xué)官能團(tuán)的化學(xué)試劑。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于所述第一激活控制劑包括能夠滅活所述化學(xué)官能團(tuán)的化學(xué)試劑；所述納米結(jié)構(gòu)包括限定在基板表面，能夠限制所述化學(xué)試劑擴(kuò)散進(jìn)入其中的納米級(jí)孔；和所述接觸步驟包瞎在能夠使基板上除所述納米級(jí)孔底面處或其附近的表面部分之外的基板表面上的化學(xué)官能團(tuán)滅活的條件下，使所述基板與所述化學(xué)試劑接觸。24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)試劑包括與所述化學(xué)官能團(tuán)結(jié)合而使其失活的封端基團(tuán)。25.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)試劑與至少部分地被排斥而不能進(jìn)入所述納米級(jí)孔的排他性組分偶聯(lián)。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述排他性組分選自大顆粒和大分子。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述顆粒包括小珠。28.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)試劑包括滅活組分。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述滅活組分包括酶。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述酶選自蛋白酶、核酶和糖酶。31.—種制備其上具有選定的活性區(qū)域的分析用基板的方法，所述方法包括提供其上設(shè)置有光學(xué)分析結(jié)構(gòu)的基板，所述光學(xué)分析結(jié)構(gòu)提供通往選定基板區(qū)域的增強(qiáng)的光學(xué)通路；提供能夠被第一電磁輻射激活或滅活的表面官能團(tuán)；將所述第一電磁輻射導(dǎo)向基板，所述光學(xué)分析結(jié)構(gòu)引導(dǎo)電磁輻射對(duì)在基板的選定區(qū)域中的表面官能團(tuán)選擇性地激活或滅活，以選擇性地提供活性基板區(qū)域。32.—種提供活性化學(xué)表面基本上位于波導(dǎo)底部的零模式波導(dǎo)的方法，所述方法包括提供設(shè)置在基板中的零模式波導(dǎo)；在所述零模式波導(dǎo)的表面提供化學(xué)官能團(tuán)；和使零模式波導(dǎo)表面上的第一部分而非第二部分與激活控制劑接觸，對(duì)所述第一部分上的化學(xué)官能團(tuán)選擇性地激活或滅活，提供基本上位于所述零模式波導(dǎo)底部的活性化學(xué)表面。33.—種零模式波導(dǎo)陣列，其包括許多設(shè)置在包層中的零模式波導(dǎo)芯體，每個(gè)芯體具有底面；和基本上僅位于所述芯體內(nèi)的化學(xué)活性表面。34.如權(quán)利要求33所述的陣列，其特征在于，所述化學(xué)活性表面優(yōu)先定位于所述芯體的底面。35.—種提供其上設(shè)置有選定的活性區(qū)域的基板的方法，所述方法包括提供其上具有光增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的基板，所述光增強(qiáng)結(jié)構(gòu)能夠引導(dǎo)電磁輻射，以在所述基板表面的選定區(qū)域附近提供足以在所述選定區(qū)域附近產(chǎn)生俘獲力的增強(qiáng)的電磁場(chǎng)；將電磁輻射導(dǎo)向所述基板，以在所述選定區(qū)域處提供足以對(duì)所述選定區(qū)域附近的活性分子產(chǎn)生俘獲力的增強(qiáng)的電磁場(chǎng)；和使所述活性分子偶聯(lián)于所述選定區(qū)域。36.—種制備其上設(shè)置有選定的活性區(qū)域的基板的方法，所述方法包括提供基板，該基板具有包括化學(xué)官能團(tuán)的表面和許多離散的納米級(jí)反應(yīng)區(qū)域；禾口使一種或多種化學(xué)官能團(tuán)或激活控制劑在表面的選定區(qū)域中圖案化，以基本上僅在所述離散的納米級(jí)反應(yīng)區(qū)域內(nèi)提供活性化學(xué)功能區(qū)域。37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述圖案化包括引導(dǎo)激活控制劑通過掩模，以基本上僅在所述離散的納米級(jí)反應(yīng)區(qū)域中產(chǎn)生活性化學(xué)官能團(tuán)。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述活化控制劑包括其所選波長(zhǎng)能使基板表面上的化學(xué)官能團(tuán)激活或滅活的光。39.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述圖案化包括在印壓過程中施用激活控制劑。40.—種鑒別核酸分子序列的方法，所述方法包括在基板上離散的觀察區(qū)域內(nèi)提供多個(gè)核酸聚合酶/模板/引物復(fù)合物，以模板依賴性方式檢測(cè)核苷酸或核苷酸類似物的序列添加，以鑒別所述多個(gè)觀察區(qū)域中核苷酸或核苷酸類似物的加入序列；其中，所述基板被制造成能夠顯著降低所述觀察區(qū)域外部的區(qū)域中的聚合酶活性、聚合酶存在、模板存在和引物存在中的一種或多種。41.一種鑒別核酸分子序列的方法，所述方法包括在基板表面上離散的觀察區(qū)域內(nèi)提供多個(gè)核酸聚合酶/模板/引物復(fù)合物，并以模板依賴性方式檢測(cè)核苷酸或核苷酸類似物的序列添加，以鑒別所述多個(gè)觀察區(qū)域中核苷酸或核苷酸類似物的加入序列；在所述基板表面上至少第一和第二離散的觀察區(qū)域之間提供內(nèi)部觀察區(qū)屏障，以基本上阻止一種或多種反應(yīng)物或產(chǎn)物的內(nèi)部觀察區(qū)擴(kuò)散。42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述屏障包括第一流體，和在所述第一和第二觀察區(qū)域之間的足夠距離，以基本上阻止一種或多種產(chǎn)物或反應(yīng)物從所述第一觀察區(qū)域到達(dá)所述第二觀察區(qū)域。43.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述基板表面是平面的。44.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述基板表面是結(jié)構(gòu)化的。45.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述屏障還包括設(shè)置在所述基板表面中的至少第一和第二納米級(jí)孔，其中，所述第一和第二觀察區(qū)域分別位于所述第一和第二納米級(jí)孔內(nèi)。46.—種使期望的分子優(yōu)先定位到設(shè)置在基板上的光限制區(qū)內(nèi)的方法，所述方法包括將所述期望的分子沉積到所述基板表面上；和從不在所述光限制區(qū)內(nèi)的基板表面選擇性地去除期望分子。47.如權(quán)利要求46所述方法，其特征在于，所述基板包括不透明層和透明層，所述光限制區(qū)包括設(shè)置成穿過所述不透明層至所述透明層的零模式波導(dǎo)。48.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，從不在所述光限制區(qū)內(nèi)的所述基板表面選擇性地去除期望分子包括使所述基板與偶聯(lián)與于排他性組分的滅活組分相接觸，所述排他性組分至少部分地被排斥而不能進(jìn)入所述光限制區(qū)。49.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述滅活組分包括酶。50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述酶選自蛋白酶、核酶和糖酶。51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述酶是位點(diǎn)特異性蛋白酶。52.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述排他性組分是大顆粒或大分子。53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述排他性組分包括小珠。54.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述排他性組分包括剛性或半剛性的長(zhǎng)形聚合物。55.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述排他性組分包括雙鏈核酸分子。56.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述滅活組分是蛋白酶，所述排他性組分是雙鏈DNA分子。57.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述期望的分子是酶。58.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述期望的分子包括結(jié)合部分。59.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述期望的分子是生物素分子。60.—種將分子定位在設(shè)置于基板上的光限制區(qū)內(nèi)的方法，所述方法包括在所述基板表面上，包括所述光限制區(qū)內(nèi)，提供光活化的偶聯(lián)基團(tuán)；將活化輻射導(dǎo)向所述基板，其中，所述光限制區(qū)使活化輻射僅在所述光限制區(qū)內(nèi)入射；和使所述分子與所述光活化偶聯(lián)基團(tuán)偶聯(lián)。61.—種將感興趣的分子選擇性固定到基板上的方法，所述方法包括-.提供基板，基板包括第一表面組分和第二表面組分，所述第一和第二表面組分具有不同的表面特征；和基于所述第一表面組分的表面特征與所述第二表面組分的表面特征之間的差異，將所述感興趣的分子選擇性地偶聯(lián)于所述第一表面組分。62.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述第一表面組分包括Si02，所述第二表面組分包括金屬或金屬氧化物。63.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述不同的表面特征包括表面電荷。64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述第一表面組分具有負(fù)表面電荷，所述第二表面組分具有正表面電荷。65.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述基板包括位于所述第一表面組分層上的第二表面組分層，所述基板包括設(shè)置成穿過所述第二表面組分層到達(dá)所述第一表面組分層的零模式波導(dǎo)。66.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述感興趣的分子優(yōu)先與第一表面組分締合。67.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述基板與第一組合物接觸，基于所述第一和第二表面組分的表面特征之間的差異，所述第一組合物選擇性地與所述第一表面組分締合。68.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述第一組合物包括第一偶聯(lián)基團(tuán)，將感興趣的分子選擇性地偶聯(lián)于所述第一表面組分包括使感興趣的分子與所述第一偶聯(lián)基團(tuán)偶聯(lián)。69.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述第一偶聯(lián)基團(tuán)包括生物素。70.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述第一組合物包括硅焼。71.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述第一組合物包括生物素-PEG-硅垸。72.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述第一組合物包括磷脂。73.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述第一組合物包括聚(L-賴氨酸)-聚(乙二醇)或聚(L-賴氨酸)-聚(乙二醇)-生物素。74.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述方法包括使所述基板與第二組合物相接觸，基于所述第一和第二表面組分的表面特征之間的差異，所述第二組合物選擇性地與所述第二表面組分締合。75.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述第二組合物包括聚電解質(zhì)。76.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述第二組合物包括聚電解質(zhì)-PEG-共聚物。77.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述方法包括使聚電解質(zhì)多層沉積到所述第二表面組分上。78.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述第二組合物包括含有一種或多種膦酸基團(tuán)的化合物。79.如權(quán)利要求78所述的方法，其特征在于，所述第二組合物是聚乙烯80.如權(quán)利要求78所述的方法，其特征在于，所述第二組合物選自下組:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>;或81.如權(quán)利要求78所述的方法，其特征在于，所述第二組合物選自下組2-羧乙基膦酸；氨基三(亞甲基膦酸)；l-羥基亞乙基-l，l-二膦酸；六亞甲基二胺四(亞甲基膦酸)；二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)；乙二胺四(亞甲基膦酸)；二(六亞甲基三胺五(亞甲基膦酸))；2-膦酰基丁垸-1,2，4-三羧酸；和單乙醇胺二膦酸酯。82.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述第二組合物包括含有一種或多種磷酸鹽/酯基團(tuán)的化合物。83.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述第二組合物包括磷酸烷基酯或膦酸烷基酯。84.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述第二組合物選自下組辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、十六垸基膦酸、十八烷基膦酸、二十二烷基膦酸、羥基-十二烷基膦酸、羥基-十一烷基-膦酸、癸二基二(膦酸)、十二垸基磷酸酯或羥基-十二垸基磷酸酯。85.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述第二組合物包括第二偶聯(lián)基團(tuán)。86.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述使感興趣分子選擇性地偶聯(lián)于所述第一表面組分包括使所述基板與能選擇性地和所述第一表面組分締合的第一組合物接觸，并使所述感興趣的分子與所述第一組合物偶聯(lián)；所述方法還包括使所述基板與能選擇性和所述第二表面組分締合的第二組合物接觸。87.—種將感興趣的分子選擇性沉積到基板的選定區(qū)域上的方法，所述方法包括提供具有第一和第二組分的基板，所述第一組分包括導(dǎo)電材料，所述第二組分包括絕緣體；和對(duì)所述第一組分施加電勢(shì)以提高或降低感興趣的分子與所述第一組分表面的締合。全文摘要制備具有選定的活性化學(xué)區(qū)域的基板的方法，該方法包括采用有助于活性化學(xué)基團(tuán)定位在基板期望區(qū)域中的基板元件。該方法可包括用于對(duì)選定區(qū)域中的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行沉積、去除、激活和/或滅活的光學(xué)、化學(xué)和/或機(jī)械過程，以提供選擇的基板活性區(qū)域。文檔編號(hào)C12N11/00GK101426910SQ200780012053公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2007年3月29日優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日發(fā)明者D·R·蘭克,D·羅伊特曼,G·奧托,J·科拉奇,J·萊爾,J·韋格納,P·佩魯索,S·特納,躍許申請(qǐng)人:加利福尼亞太平洋生物科學(xué)股份有限公司