專利名稱：含有人臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞的組合物誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化和增殖 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含人臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞的組合物用于誘導(dǎo)神經(jīng) 前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化或增殖為神經(jīng)細(xì)胞的用途。
背景技術(shù)：
中風(fēng)、帕金森病、阿爾茨海默病、皮克氏病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索 硬化、外傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和脊髓損傷疾病涉及由于神經(jīng)細(xì)胞損傷導(dǎo) 致的神經(jīng)機(jī)能障礙，它們通常通過可能嚴(yán)重?fù)p害正常細(xì)胞的藥物和外科手 術(shù)治療。
最近，發(fā)現(xiàn)移植正常細(xì)胞來替代被破壞的或損傷的細(xì)胞的細(xì)胞替代療 法對(duì)于這種疾病是有效的，特別地，能夠分化和增殖為所需組織的神經(jīng)細(xì) 胞正在大力研究中。
干細(xì)胞是非特化細(xì)胞，其可以在非分化階段無限增殖并可以在應(yīng)答特 異性刺激時(shí)分化為多種組織。
可以形成神經(jīng)元和/或神經(jīng)膠質(zhì)如星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或神 經(jīng)膜細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞也是具有自我繁殖能力的未分化細(xì)胞。它們通過神 經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞而分化為神經(jīng)細(xì)胞，例如神經(jīng)元或神經(jīng)膠 質(zhì)。
已知分化為骨、軟骨、脂肪組織、肌肉、腱、韌帶、神經(jīng)組織和其他 的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞替代療法是可行的。間充質(zhì)干細(xì)胞主要自骨髓獲 得，但是這種間充質(zhì)干細(xì)胞由于其有限的分化和增殖能力而僅提供有限的 應(yīng)用。而且，除了發(fā)現(xiàn)與患者具有相同的組織相容性抗原的供體以避免在 骨髓移植中的移植物抗宿主反應(yīng)的問題之外，對(duì)于這種細(xì)胞替代療法還需 進(jìn)行包括數(shù)個(gè)步驟的復(fù)雜、通常痛苦的術(shù)語(yǔ)。
近年來，臍帶血由于其高干細(xì)胞濃度而成為研究者的目標(biāo)。己經(jīng)進(jìn)行 了許多通過移植臍帶血給患者來治療血液病的試驗(yàn)，而且已經(jīng)建立了以冷 凍形式保存臍帶血直至使用的臍帶血庫(kù)以用于自體移植療法。與骨髓不同，臍帶血可以通過簡(jiǎn)單的術(shù)語(yǔ)從臍帶獲得而且其幾乎不引 起移植物抗宿主反應(yīng)。為此，最近進(jìn)行了關(guān)于臍帶血臨床應(yīng)用的世界性研
究o
本發(fā)明人深入研究了臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞并且發(fā)現(xiàn)其能夠誘導(dǎo) 神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖為神經(jīng)細(xì)胞。
發(fā)明簡(jiǎn)述
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供包含臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞的組 合物誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖為神經(jīng)細(xì)胞的用途。
本發(fā)明另一方面提供了誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖為神 經(jīng)細(xì)胞的方法，其包括共同培養(yǎng)臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì) 胞或神經(jīng)干細(xì)胞。
本發(fā)明再一方面通提供了誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖為 神經(jīng)細(xì)胞的組合物，其包含作為活性成分的臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞。
本發(fā)明再一方面通提供了治療神經(jīng)損傷疾病的方法，包括將所述組合 物給予需要治療所述神經(jīng)損傷疾病的對(duì)象的神經(jīng)細(xì)胞損傷區(qū)域。
附圖簡(jiǎn)述
本發(fā)明的上述和其他目的和特征根據(jù)如下發(fā)明描述以及結(jié)合所述附圖
將會(huì)變得清楚，其分別示出


圖1:用于共同培養(yǎng)臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的 transwell室(chamber)的示意圖2:示出單獨(dú)培養(yǎng)NG108-15或與臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞共同培 養(yǎng)后4天和7天，用相差顯微鏡(xlOO)觀測(cè)到的NG108-15 (NG108)的分化 增殖圖3:示出單獨(dú)培養(yǎng)NG108-15或與臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞共同培 養(yǎng)后7天神經(jīng)分化的早期標(biāo)記微管蛋白p III的免疫染色結(jié)果圖4:示出在補(bǔ)加cAMP單獨(dú)培養(yǎng)NG108-15細(xì)胞或者與得自兩個(gè)不同 個(gè)體(hUCB-MSC-l和hUCB-MSC-2)的臍帶血^^生的間充質(zhì)干細(xì)胞共同 培養(yǎng)后7天，用相差顯微鏡(xlOO)觀測(cè)到的NG108-15的分化增殖圖5:示出在神經(jīng)干細(xì)胞分別與不同濃度的hUCB-MSC-l和 hUCB-MSC-2共同培養(yǎng)后7天用相差顯微鏡(xlOO)觀測(cè)到的衍生自胎鼠腦皮層的神經(jīng)干細(xì)胞的分化增殖圖6:示出單獨(dú)培養(yǎng)衍生自胎鼠腦皮層的神經(jīng)干細(xì)胞或與臍帶血衍生的 間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)后7天神經(jīng)分化的早期標(biāo)記微管蛋白p III和微管相 關(guān)蛋白2 (MAP2)的免疫染色結(jié)果圖7:示出NG108-15與不同濃度的臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞共同培 養(yǎng)后7天通過臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估的存活細(xì)胞數(shù)的示意圖8:示出衍生自胎鼠腦皮層的神經(jīng)干細(xì)胞與不同濃度的臍帶血衍生的 間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)后7天通過臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估的存活細(xì)胞數(shù)的示意圖。
發(fā)明詳述
本發(fā)明誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖為神經(jīng)細(xì)胞的組合物 特征在于包含作為活性成分的臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"臍帶血"指取自聯(lián)系母親與新生兒的胎盤的臍帶靜 脈的血液。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞"指分離自哺乳動(dòng)物優(yōu) 選人的臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"神經(jīng)損傷疾病"指伴隨由于受損的運(yùn)動(dòng)或感覺神經(jīng) 導(dǎo)致的行為功能障礙的疾病。示例的神經(jīng)損傷疾病包括中風(fēng)、帕金森病、 阿爾茨海默病、皮克氏病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化、外傷性中樞神經(jīng) 系統(tǒng)疾病和脊髓損傷疾病。
術(shù)語(yǔ)"治療"指預(yù)防動(dòng)物、優(yōu)選哺乳動(dòng)物、最優(yōu)選人中尚未確診的疾 病或病癥的表現(xiàn)，動(dòng)物傾向于患有所述疾病或病癥；或者抑制神經(jīng)損傷疾
病的進(jìn)展。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"神經(jīng)細(xì)胞"指中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和/或神 經(jīng)膠質(zhì)如星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或神經(jīng)膜細(xì)胞。
分離包含來自臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞的單核細(xì)胞時(shí)可以使用通常方法
如Ficoll-Hypaque密度梯度方法。特別地，所述方法包括如下步驟在分 娩直至胎盤脫落后自臍帶靜脈采集臍帶血；用Ficoll-Hypaque梯度離心所 述臍帶血以獲得單核細(xì)胞；及從中去除污染物。獲得的單核細(xì)胞可以從中 分離間充質(zhì)干細(xì)胞或者超低溫冷凍以長(zhǎng)期保管直至使用。
可以通過Yang SE et al. (Yang SE et al., C>toAera/ _y, 6(5):476-486， 2004) 的方法從臍帶血衍生的單核細(xì)胞分離間充質(zhì)干細(xì)胞。特別地，單核細(xì)胞懸
5浮在含有5-30重量％、優(yōu)選5-15重量Q/。的胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中，所 述培養(yǎng)基包括常規(guī)培養(yǎng)基如DMEM、 a-DMEM、 Eagle's基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI 1640。然后所述懸浮液中的細(xì)胞被分到具有如上所述相同組成的培養(yǎng)基中 并在5^C02培養(yǎng)箱、37'C培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層時(shí)，觀測(cè)到具有紡 錘形的間充質(zhì)干細(xì)胞。然后將間充質(zhì)干細(xì)胞重復(fù)傳代培養(yǎng)直至細(xì)胞充分?jǐn)U 增。
根據(jù)本發(fā)明，神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化增殖均可 以通過臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞的共同培 養(yǎng)而誘導(dǎo)。即臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干 細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞以及對(duì)于通過增加神經(jīng)細(xì)胞數(shù)來維持和強(qiáng)化這種作用 以增強(qiáng)其治療作用是同時(shí)有效的。
因此，本發(fā)明提供了臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞或包含所述細(xì)胞的組 合物用于誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞以及增殖所得神 經(jīng)細(xì)胞的用途。
臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞或包含所述細(xì)胞的組合物可以用于患有神 經(jīng)損傷疾病例如中風(fēng)、帕金森病、阿爾茨海默病、皮克氏病、亨廷頓病、 肌萎縮側(cè)索硬化、外傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和脊髓損傷疾病、優(yōu)選中風(fēng)和 脊髓損傷疾病的患者的細(xì)胞療法。
本發(fā)明的組合物還可包含藥物可接受的添加劑。
可以根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法使用本發(fā)明的組合物制備單位劑量形式的 藥物制劑。優(yōu)選用于胃腸外施用的制劑例如注射或局部劑量形式。本發(fā)明 的藥物制劑還可包括藥物可接受的添加劑，例如填充劑、膨脹劑、粘合劑、 濕潤(rùn)劑、崩解劑、稀釋劑如表面活性劑和其他賦形劑。
本發(fā)明的藥物制劑可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法胃腸外施用，例如通過注 射進(jìn)入損傷區(qū)域以及注射進(jìn)入腦脊液例如腰椎穿剌術(shù)和實(shí)質(zhì)注射 (parenchymal injection)、靜脈或動(dòng)脈。優(yōu)選地，其可以通過直接注射進(jìn)腦 或脊髓損傷區(qū)域的周圍或相對(duì)區(qū)域而施用。另外，可以使用Douglas Kondziolka (Douglas Kondziolka， Pittsburgh, 1998)的臨床方法將本發(fā)明的藥 物制劑施用給損傷區(qū)域。特別地，將對(duì)象的顱骨切開一個(gè)直徑lcm的孔， 將于HBSS (Hank's平衡鹽溶液)中的間充質(zhì)干細(xì)胞的懸浮液通過長(zhǎng)針注 射器和立體定位架而注射進(jìn)該孔。
間充質(zhì)千細(xì)胞的典型劑量范圍從lxi()S到lxl(f細(xì)胞/kg體重勝射，優(yōu)選從5xl()S到5xl(^細(xì)胞/kg體重/注射，其可以單劑量或分份劑量施用。另 外，應(yīng)理解實(shí)際施用給某個(gè)患者的有效成分的量應(yīng)根據(jù)多種相關(guān)因素包括 被分化增殖的神經(jīng)細(xì)胞的量、選擇的施用途徑和個(gè)體患者的體重、年齡和 性別確定。
本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖為神經(jīng)細(xì)胞 的方法，其包括共同培養(yǎng)臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞或神 經(jīng)干細(xì)胞?？梢酝ㄟ^基于細(xì)胞數(shù)以1:0.1至1:10、優(yōu)選1:1至1:2的比率混 合臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞并 且在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基如DMEM、 a-DMEM、 a-MEM、 Eagle's基礎(chǔ)培養(yǎng)基和 RPMI 1640中剪切所述細(xì)胞混合物而進(jìn)行所述共同培養(yǎng)。所述培養(yǎng)基還可 包含抗生素，例如慶大霉素，和/或5到15重量％的FBS。培養(yǎng)時(shí)間從5 到10天。
本發(fā)明還提供了治療神經(jīng)損傷疾病的方法，所述方法包括將臍帶血衍 生的間充質(zhì)干細(xì)胞或包含其的組合物施用給需要治療所述神經(jīng)損傷疾病的 對(duì)象的神經(jīng)細(xì)胞損傷區(qū)域。所述對(duì)象可以是哺乳動(dòng)物，包括人。
當(dāng)以治療有效量施用時(shí)，臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞不但包括中樞或 周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化，還包括所 得神經(jīng)細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致神經(jīng)功能的恢復(fù)以及治療這種神經(jīng)損傷疾病。 臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞的治療作用通過其增殖再生的神經(jīng)細(xì)胞的能力 而大大增強(qiáng)并且長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)。
給出以下實(shí)施例和測(cè)試?yán)齼H為說明目的，不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1:分離和培養(yǎng)臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞 (步驟1)獲得臍帶血(UCB)
獲得分娩婦女的同意，UCB樣品得自分娩婦女的臍靜脈。特別地，將 含有44 m纟的CPDA-1抗凝劑的UCB收集袋(GREEN CROSS)的16-號(hào)針插 入臍靜脈以使UCB流入袋中。在48小時(shí)內(nèi)處理收集的血液，細(xì)胞存活率 高于卯％。
(步驟2)分離和擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞
步驟1中獲得的UCB使用Ficoll-Hypaque梯度(密度1.077 g/m^ Sigma)離心以獲得單核細(xì)胞。然后單核細(xì)胞洗滌幾次以除去雜質(zhì)并懸浮在 含有5-15重量％ FBS(HyClone)極限基礎(chǔ)培養(yǎng)基(a-MEM， Gibco BRL)中。隨后，將預(yù)定量的所述懸浮液加入與上述相同的培養(yǎng)基中并在5。/。C02培養(yǎng)箱 在37"C培養(yǎng)，每周兩次用新鮮批次的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞形 成單層時(shí)，通過顯微鏡證實(shí)產(chǎn)生具有紡錘形的間充質(zhì)干細(xì)胞。將如此形成 的間充質(zhì)干細(xì)胞重復(fù)傳代培養(yǎng)直至細(xì)胞被充分?jǐn)U增(Yang SE et al., C聲/^卿，6(5):476-486， 2004)。
實(shí)施例2:培養(yǎng)NG108-15 (NG108)
具有與神經(jīng)前體細(xì)胞相似的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的小鼠腦衍生的細(xì)胞 NG108-15(神經(jīng)母細(xì)胞瘤X神經(jīng)膠質(zhì)瘤雜種)(ATCC， Cat. No. ATCC-CRL-HB-12317)在DMEM (Dulbecco，s modified Eagle's medium) (4mM/L谷氨酰胺，4.5g/L葡萄糖、4.0mg/L吡哆醇-HCl 、 O.lmM 次黃嘌呤-鳥嘌呤、400nM氨基蝶呤、0.016 mM胸苷、5-15重量。/qFBS)中 培養(yǎng)。
實(shí)施例3:培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞
衍生自胎鼠腦皮層的神經(jīng)干細(xì)胞(Chemicon， Cat. No. SCR029)在神經(jīng)干 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(20ng/mA FGF-2, 20ng/n^ EGF和2mg/n^肝素)。
實(shí)施例4:共同培養(yǎng)臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞和NG108-15 m
將實(shí)施例1的人臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)與實(shí)施例2 的NG108-15(hUCB-MSCs : NG108-15- l:l)使用transwdl室(圖l)和實(shí)施例 2的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。作為對(duì)照組，NG108-15單獨(dú)在實(shí)施例2的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)。如圖1所示，transwdl室由被具有l(wèi)pm-孔的微孔膜彼此分開的下室 (lower compartment)禾口上室(upper compartment)纟且成。hUCB-MSC置于 上室，NG108-15在下室中。
在4天和7天用相差顯微鏡(xl00)觀測(cè)NG108-15的分化。如圖2所示， 與hUCB-MSC共同培養(yǎng)的NG108-15分化為典型的成熟神經(jīng)元樣細(xì)胞的形 式，其中細(xì)胞伸展出長(zhǎng)分支并且分化具有紡錘形。
在7天使用神經(jīng)發(fā)育的早期標(biāo)記微管蛋白p III的免疫染色進(jìn)一步證實(shí) 分化的細(xì)胞是神經(jīng)元樣細(xì)胞。特別地，hUCB-MSCs、 NG108-15及其混合 物分別在蓋片上培養(yǎng)，通過將其在室溫加入含有0 3°/。的Triton X-100的10% 正常山羊血清中1小時(shí)而封閉。免疫染色中使用的第一抗體與藻紅蛋白綴合的抗微管蛋白f3 III小鼠單克隆抗體(Chemicon)用山羊血清稀釋100倍并加入其中。然后將所述混合物在4'C保持過夜，所得混合物用0.01M PBS洗滌3次(每次5分鐘)。
如圖3所示，與實(shí)施例1的間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)的NG108-15對(duì)于微管蛋白(HII的免疫染色顯示獨(dú)特應(yīng)答，證實(shí)分化的是神經(jīng)元樣細(xì)胞。
實(shí)施例5:共同培養(yǎng)臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞和NG108-15 (II)
從兩個(gè)不同個(gè)體通過實(shí)施例1的方法獲得人臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs-l和hUCB-MSCs-2)。實(shí)施例2的NG108-15單獨(dú)培養(yǎng)或者與hUCB-MSCs-l或者h(yuǎn)UCB-MSCs-2根據(jù)實(shí)施例4的方法共同培養(yǎng)7天。用相差顯微鏡(xlOO)觀測(cè)細(xì)胞的分化增殖。
作為比較組，lmM的誘導(dǎo)NG108-15分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的cAMP(iVwmRwoW9， 1261-1265, 1998)加入NG108-15培養(yǎng)基中。
如圖4所示，與間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)的NG108-15分化為成熟的神經(jīng)元樣細(xì)胞的形式。hUCB-MSCs-l和hUCB-MSCs-2在分化誘導(dǎo)活性上沒有顯著差異。
實(shí)施例6:共同培養(yǎng)臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞(D
實(shí)施例3的神經(jīng)干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)(對(duì)照組)或與實(shí)施例5的hUCB-MSCs-l或hUCB-MSCs-2使用transwell室共同培養(yǎng)在實(shí)施例3的培養(yǎng)基中。hUCB-MSCs置于上室，神經(jīng)干細(xì)胞在下室中。
hUCB-MSCs-l和hUCB-MSCs-2分別以500、 1000、 2000、 4000和6000細(xì)胞/cnf的濃度加入培養(yǎng)基中，神經(jīng)干細(xì)胞以2000細(xì)胞/ciif的濃度共同培養(yǎng)。在7天用相差顯微鏡(xlOO)觀測(cè)細(xì)胞的分化增殖(圖5)。
如圖5所示，與間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元的形式。hUCB-MSCs-l和hUCB-MSCs-2在分化誘導(dǎo)活性上沒有顯著差異。另外，神經(jīng)干細(xì)胞的分化增殖程度與共同培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度成正比。
實(shí)施例7:共同培養(yǎng)臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞ai)實(shí)施例3的神經(jīng)干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)(對(duì)照組)或者與實(shí)施例1的hUCB-MSCs使用transwell室共同培養(yǎng)(hUCB-MSCs:神經(jīng)干細(xì)胞-l:l)在實(shí)施例3的培養(yǎng)基中。hUCB-MSCs置于上室，神經(jīng)干細(xì)胞于下室中。
在4天和7天使用實(shí)施例4的方法對(duì)神經(jīng)元發(fā)育的早期標(biāo)記微管蛋白p
III和微管相關(guān)蛋白2(MAP2)進(jìn)行免疫染色，以便證實(shí)分化的是神經(jīng)元。如圖6所示，與實(shí)施例1的間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)于
微管蛋白pIII和MAP2的免疫染色顯示獨(dú)特的應(yīng)答，證實(shí)分化的是神經(jīng)元。
實(shí)施例8:共同培養(yǎng)臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞
根據(jù)實(shí)施例4和6的方法，分別將實(shí)施例2的NG108-15單獨(dú)培養(yǎng)(對(duì)照組)或與實(shí)施例1的hUCB-MSCs共同培養(yǎng)及將實(shí)施例3的神經(jīng)干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)(對(duì)照組)或與實(shí)施例5的hUCB-MSCs-l或hUCB-MSCs-2共同培養(yǎng)。使用臺(tái)盼藍(lán)染色在7天計(jì)數(shù)存活細(xì)胞數(shù)(圖7和8)。
如圖7和8所示，增加的NG108-15和神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)目和與之共同培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度成比例，表示臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞可以同時(shí)有效地誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞以及通過增加神經(jīng)細(xì)胞數(shù)來維持和強(qiáng)化這種作用。
盡管本發(fā)明根據(jù)上述特異實(shí)施方案進(jìn)行了描述，應(yīng)知道本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行不同的修改和變化，這也落在由所附的權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
權(quán)利要求
1.包含臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞的組合物用于誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖為神經(jīng)細(xì)胞的用途。
2. 誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖為神經(jīng)細(xì)胞的方法，包括共同培養(yǎng)臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中使用的臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞與神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞的比例為1:0.1至1:10。
4. 治療神經(jīng)損傷疾病的方法，包括將UCB-MSC施用給需要治療所述神經(jīng)損傷疾病的對(duì)象的神經(jīng)細(xì)胞損傷區(qū)域。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述神經(jīng)損傷疾病是中風(fēng)、帕金森病、阿爾茨海默病、皮克氏病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化、外傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或脊髓損傷疾病。
6. 權(quán)利要求4的方法，其中所述對(duì)象是人。
7. 誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖為神經(jīng)細(xì)胞的組合物，包含作為活性成分的臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞的組合物用于誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖為神經(jīng)細(xì)胞的用途，所述組合物對(duì)于治療神經(jīng)損傷性疾病是有效的。
文檔編號(hào)C12N5/0797GK101541954SQ200780044097
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2007年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者吳元一, 崔秀真, 梁允瑄, 蔣鐘旭, 金珠淵 申請(qǐng)人:Medipost株式會(huì)社