專利名稱：Tlr配體與抗病毒劑的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及由TLR配體和抗病毒劑構(gòu)成的組合物，及其在諸 如病毒感染治療和篩查分析的方法中的用途。
背景技術(shù)：
Toll樣受體(TLR)是一族識(shí)別與病原體相關(guān)的分子模式(PAMP)的 高度保守的模式識(shí)別受體(PRR)多肽，并且在哺乳動(dòng)物的先天免疫中起 關(guān)鍵作用。目前已經(jīng)鑒定出了至少十個(gè)家族成員，它們被稱為 TLR1-TLR10。各種TLR的細(xì)胞質(zhì)域由Toll-白細(xì)胞介素1受體(TIR)域 來表征。見MedzhitovR等，(1998) Mo/Ce〃2:253-8。 TLR對(duì)微生物侵 襲的識(shí)別引發(fā)在果繩和哺乳動(dòng)物中進(jìn)化保守(evolutionarily conserved) 的信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活。據(jù)報(bào)道，含TIR域的銜接蛋白質(zhì)MyD88與TLRs 結(jié)合，且將白細(xì)胞介素1受體結(jié)合激酶(IRAK)和腫瘤壞死因子(TNF) 受體結(jié)合因子6(TRAF6)補(bǔ)充到所述TLR中。人們認(rèn)為，MyD88依賴 性信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致NF-KB轉(zhuǎn)錄因子和c-Jun NH2末端激酶(Jnk)、促 分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)的激活，這是免疫激活和炎性細(xì)胞因子 產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟。有關(guān)綜述參見Aderem A等，(2000) Atowre 406:782-87 和Akira S等，(2004) 7VW i ev /mww"o/ 4:499-511 。
近來報(bào)道了某些低分子量合成化合物，如咪唑并喹啉咪喹莫特 (imiquimod) (R-837)和瑞喹莫特(resiquimod) (R-848),是TLR7和TLR8 的配體。見HemmiH等，(2002) /mmw"o/3:196-200; JurkM等， (2002)淑/薩歸/ 3:499。
從對(duì)未曱基化的細(xì)菌DNA及其合成類似物(CpGDNA)是TLR9配 體的近期發(fā)現(xiàn)開始(Hemmi H等，(2000) A^wre 408:740-5; Bauer S等， (2001) A^/JcadSc/98， 9237-42)，已有報(bào)道稱某些TLR的配 體包括某些核酸分子。近來，已有報(bào)道稱某些類型的RNA以非序列依 賴性或序列依賴性形式具有免疫刺激性。另外，已有報(bào)道稱這些不同免疫刺激性RNA刺激TLR3、 TLR7或TLR8。此外，報(bào)道了某些低分 子量合成化合物，如咪唑并喹啉咪會(huì)莫特(R-837)和瑞喹莫特(R-848), 是TLR7和TLR8的配體。Hemmi H等，(2002)iVa"mmw"o/ 3:196-200; Jurk M等，(2002) Ato 7mmw"o/ 3:499。近來報(bào)道了源自病毒的雙鏈 RNA(dsRNA)和dsRNA的合成類似物poly I:C是TLR3的配體。 AlexopoulouL等，(2001) A^we 413:732-8。更近一段時(shí)間，Lipford與 同事公開了某些含GU的RNA序列是免疫刺激性的，其通過刺激TLR7 和TLR8起作用。HeilF等，(2004)5We"ce 303:1526-9和美國專利申請(qǐng) 2003/0232074 Al 。
Heil等人報(bào)道了源自HIV-1并與陽離子型脂質(zhì)DOTAP復(fù)合的富含 鳥香和尿苷的硫代磷酸酯ssRNA寡核苷酸刺激樹突細(xì)胞(DC)和巨噬細(xì) 胞以分泌a干擾素(IFN-a)、肺瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素12 (IL-12) 和白細(xì)胞介素6 (IL-6)。 HeilF等，(2004) Scz'e"ce 303:1526-9。據(jù)報(bào)道 小鼠TLR7會(huì)引起富含GU的ssRNA的應(yīng)答，并且據(jù)報(bào)道人類TLR8 會(huì)引起富含GU和富含U的ssRNA的應(yīng)答。雖然測(cè)試了特定的序列， 但是沒有鑒定出模體。/&丄
Diebold等近期報(bào)道了病毒或合成來源的單鏈RNA(ssRNA)激活 TLR7。 DieboldSS等，(2004) Sc/e"ce 303:1529-31。他們報(bào)道了源自流 感病毒的病毒基因組ssRNA以及polyU會(huì)觸發(fā)漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(pDC) 的IFN-a產(chǎn)生。除了 polyU沒有鑒定出序列特異的才莫體。小鼠脾和一 些短ssRNA寡核苷酸(用于制造短干擾dsRNA的類型)也誘導(dǎo)IFN-a。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，提供了用于預(yù)防和/或治療病毒感染的方法和產(chǎn)品。 本發(fā)明的一個(gè)方面是免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒劑的組合物，其中 所述抗病毒劑不是C-8取代的鳥普，并且該抗病毒劑連接至所述免疫 刺激性寡核苷酸。
所述免疫刺激性寡核苷酸可以是RNA寡核苷酸(ORN)或DNA寡 核苷酸(ODN)。所述DNA寡核苷酸在某些實(shí)施方式中是A-類、B-類、 C-類、P-類、T-類或E類寡核苷酸，并且可任選地包括至少一個(gè)未曱基化的CpG二核苷酸。在其它實(shí)施方式中，所述DNA寡核苦酸包括 至少三個(gè)未曱基化的CpG二核苦酸。所述至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)未曱 基化的CpG 二核香酸可包括磷酸二酯或者類磷酸二酯核芬酸間鍵 (linkage),且其中所述寡核苷酸包括至少一個(gè)穩(wěn)定的核苷酸間鍵。在其 他實(shí)施方式中，所述免疫刺激性寡核苦酸包括嵌合的骨架(chimeric backbone)。
根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了免疫刺激性RNA寡核苦酸和抗病 毒劑的組合物，其中所述抗病毒劑與所述免疫刺激性RNA寡核苷酸相 關(guān)聯(lián)。
所述免疫剌激性寡核苷酸可間接或直接連接到所述抗病毒劑。在 一種實(shí)施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒劑是同一分子的 組成部分。所述抗病毒劑可連接至內(nèi)部核苷或末端核苦，任選為3，末 端核苷或5'末端核苷。
所述組合物在免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒劑之間可包括易受核 酸酶作用的4立點(diǎn)。
在某些實(shí)施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸包含至少一個(gè)3，-3， 鍵和/或5'-5'鍵。
所述組合物可包括可藥用栽體。在某些實(shí)施方式中，所述組合物 是無菌的。
所述抗病毒劑可以是，例如一種或多種核苷類似物、洛索立賓 (loxoribine)、艾沙托立賓(isatoribine)、利巴韋林(ribavirin)、瓦洛皮他賓 (valopicitabine)、 BILN2061、 VX-950。
在某些實(shí)施方式中，所述組合物包括與所述免疫刺激性寡核苷酸 一起配制的第二抗病毒劑。所述第二抗病毒劑可連接至所述免疫剌激 性寡核苦酸。在其他實(shí)施方式中，所述組合物包括容納所述免疫刺激 性寡核苷酸和抗病毒劑的微粒或脂質(zhì)體。
在某些實(shí)施方式中，所述抗病毒劑是C-8取代的鳥苷。所述C-8 取代的鳥苷可以結(jié)合在所述RNA寡核苷酸內(nèi)，或者可以連接至所述 RNA。在某些實(shí)施方式中，所述C-8取代的鳥苷位于所述RNA寡核苷 酸的5，末端。在其他實(shí)施方式中，所述C-8取代的鳥苷位于所述RNA 寡核苷酸5，末端的3'側(cè)相距一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)核苷處，。在某些實(shí)施方式中，所述DNA寡核苷酸不是含脫堿基的寡核香 酸或銜接寡核香酸(adapter oligonucleotide)。
在其他方面，本發(fā)明是連接至抗病毒劑的TLR7/8/9配體的組合 物。在某些實(shí)施方式中，所述TLR7/8/9配體是免疫刺激性寡核苦酸。 所述TLR7/8/9配體直接或間接連接至所述抗病毒劑。在某些實(shí)施方式 中，所述組合物在TLR7/8/9配體和抗病毒劑之間包括易受核酸酶作用 的位點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了治療病毒性疾病的方法。所述方 法包括向需要這種治療的受試對(duì)象施用有效治療該病毒性疾病的量的 本文所述的本發(fā)明組合物。在某些實(shí)施方式中，所述病毒性疾病是人 類免疫缺陷性病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)或者乙型肝炎病毒 (HBV)。所述載體可以是緩沖劑。
在某些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象對(duì)非CpG治療無應(yīng)答。在其他 實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象對(duì)采用抗病毒劑的治療無應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了能表達(dá)抑制性病毒蛋白和TLR的 細(xì)胞，以及載體的組合物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞被TLR報(bào)道子構(gòu)建體(construct)所 轉(zhuǎn)染。所述TLR可以是TLR7、 TLR8或TLR9。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞被抑制性病毒蛋白表達(dá)構(gòu)建體所 轉(zhuǎn)染。所述抑制性病毒蛋白可以是例如NS3/4蛋白酶。
在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是來自病毒感染患者的免疫細(xì)胞。
在其他實(shí)施方式中，所述抑制性病毒蛋白由所述細(xì)胞內(nèi)源性地表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了鑒定免疫刺激性抗病毒組合物的 方法。該方法包括使本文所述的細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，并4企測(cè)細(xì)胞 因子產(chǎn)生和抗病毒報(bào)道子的讀數(shù)(readout),其中細(xì)胞因子產(chǎn)生的提高和 抗病毒報(bào)道子讀數(shù)的提高表明所述測(cè)試化合物是免疫刺激性的抗病毒 組合物。
在本發(fā)明的又一方面，提供了鑒定免疫刺激性抗病毒組合物的方 法，包括使本文所述的細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，并檢測(cè)Thl應(yīng)答、類 Th-l應(yīng)答或前炎癥(pro-inflammatory)細(xì)胞因子產(chǎn)生，其中Thl應(yīng)答、
15類Th-l應(yīng)答或前炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的提高表明所迷測(cè)試化合物是免疫 刺激性抗病毒組合物。
在本發(fā)明的又一方面，提供了鑒定免疫刺激性抗病毒組合物的方 法，包括從病毒感染的患者分離免疫細(xì)胞，使該細(xì)胞與測(cè)試化合物接 觸，并檢測(cè)細(xì)胞因子產(chǎn)生和病毒滴定量，其中Thl細(xì)胞因子產(chǎn)生的提 高和病毒滴定量的降低表明所述測(cè)試化合物是免疫刺激性抗病毒組合 物。
在本發(fā)明的其他方面，提供了篩查具有抗病毒活性的包含抗病毒 劑和免疫刺激性寡核苷酸的分子的方法，包括從病毒感染的患者分離 免疫細(xì)胞，使該細(xì)胞與所述分子接觸并檢測(cè)病毒滴定量，其中病毒滴 定量的降低表明所述分子具有抗病毒活性。
在某些實(shí)施方式中，所述外周血單核細(xì)胞包括樹突細(xì)胞。該樹突 細(xì)胞可以是漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞。
所述接觸步驟可以在體外進(jìn)行，并且所述外周血單核細(xì)胞可以是 經(jīng)過培養(yǎng)的。
本發(fā)明的另 一 方面還提供了本發(fā)明組合物用于刺激免疫應(yīng)答的用途。
還提供了制造用于刺激免疫應(yīng)答的本發(fā)明組合物的藥物的方法。
根據(jù)本發(fā)明的某些方面，還提供了治療癌癥的方法。所述方法包 括向患有癌癥的受試對(duì)象施用有效治療癌癥的量的免疫刺激性寡核苷 酸與抗病毒劑的組合物。
在本發(fā)明的其他方面，包括治療細(xì)菌感染的方法，包括向患有細(xì) 菌感染的受試對(duì)象施用有效治療細(xì)菌感染的量的免疫刺激性寡核苷酸 與抗病毒劑的組合物。
在某些實(shí)施方式中，所述抗病毒劑連接至所述免疫刺激性寡核苷 酸。所述抗病毒劑可以是利巴韋林。所述組合物還可包括C-8取代的 鳥苷。
在某些實(shí)施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸是RNA寡核香酸。 在其他實(shí)施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸是DNA寡核苷酸，諸如 A-類、B-類、C-類、P-類、T-類或E類寡核苷酸。所述DNA寡核苷酸 包括至少一個(gè)未曱基化的CpG 二核苷酸。還提供了本文所述的用于治療癌癥、或者病毒或細(xì)菌感染的組合物。
還提供了本文所述的組合物與抗原組合用于制造用于對(duì)受試對(duì)象 進(jìn)行預(yù)防接種的藥物的用途。
本發(fā)明還包括本文所述的組合物用于制造用于治療受試對(duì)象的癌 癥、病毒感染或細(xì)菌感染的藥物的用途。
本發(fā)明的每一條限制可包含本發(fā)明的各種實(shí)施方式。因此，可預(yù) 期的是，涉及任一要素或要素組合的每一條本發(fā)明的限制均能包含在 本發(fā)明的每個(gè)方面之中。本發(fā)明并非將其應(yīng)用局限于在以下描述中闡 述的或者在附圖中描述的各個(gè)部分的構(gòu)造和布局的細(xì)節(jié)之中。本發(fā)明
本文中使用的短語和術(shù)語是出于描述的目的而不應(yīng)當(dāng)被當(dāng)作進(jìn)行限 制。本文中"包括"、"包含"或"具有"、"含有"、"涉及，，，以及其各 種變化方式的使用意指涵蓋其后所羅列的條目及其等效方式以及額外 的條目。


圖1是三幅證實(shí)8-氧代-rG對(duì)ORN-介導(dǎo)的免疫刺激的正影響的示 圖。將8-氧代-rG修飾的ORN (SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:8)引起的 細(xì)胞因子刺激與對(duì)照ORN (SEQ ID NO:ll)進(jìn)行比較。測(cè)量細(xì)胞因子 IFN-a(圖la),IL-12p40(圖lb)和TNF-a(圖lc)。x軸是ORN的濃度(單 位liM)， y軸為細(xì)胞因子濃度(單位pg/ml)。
圖2是證實(shí)8-修飾的G的正影響取決于在RNA序列中的位置的 示圖。在ORN的不同位置具有單個(gè)8-氧代-rG的ORN (SEQ ID NO:l-4) 和未修飾的ORN (SEQ ID NO:8)引起的IFN-a刺激。x軸是ORN的濃 度(單位pM)， y軸為IFN-a濃度(單位pg/ml)。
圖3是證實(shí)在ORN 5'末端的不同的8-修飾的脫氧核苷酸和核糖核 苷酸增強(qiáng)免疫刺激活性的示圖。將ORN的5，末端具有單個(gè)8-氧代 -rG/Dg (SEQ ID NO:l, 5)、 8隱溴-dG (SEQ ID NO:7)或7-硫代-8氧代-鳥 苦(Immunosine)(艾沙托立賓)(SEQ ID NO:6)(具有5，-5'鍵)的ORN引 起的IFN-a刺激與8-溴-dA修飾的ORN (SEQ ID NO:10)、對(duì)照ORNSEQ ID NO: 11和未修飾的ORN (SEQ ID NO:8)進(jìn)行比較(圖3)。 x軸是 ORN的濃度(單位|oM)， y軸為IFN-a濃度(單位pg/ml)。
圖4是一組描述RBV與CpG ODN (SEQ ID No: 14)的組合對(duì)T細(xì) 胞IFN-Y產(chǎn)生的作用(圖4B)，以及不存在CpGODN的情況下RBV對(duì) IFN-Y產(chǎn)生的作用(圖4A)的示圖。
圖5是一組描述不依賴在先ODN/RBV處理的RBV對(duì)CD3-介導(dǎo) 的IFN-y產(chǎn)生的體外(ex vivo)作用的示圖。不依賴在先的體內(nèi)處理的體 外低濃度的RBV提高IFN-y的水平(圖5A)。與CpG ODN (SEQ ID No. 14)的組合的作用顯示在圖5B中。
圖6是證實(shí)RBV減少SEQ ID NO: 14-誘導(dǎo)的IL-10的圖像。
圖7是一組描述使用源自骨髓(BM)的樹突細(xì)胞(DC)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的 示圖。用SEQ ID NO: 14、 RBV(lpM、 5pM、 10|oM、 100pM或120pM) 或者用SEQ ID NO: 14及RBV對(duì)保持在GM-CSF中的源自BM的DC 進(jìn)行處理，并測(cè)試EL-12p40(圖7A)、 IL-12p70(圖7B)。
圖8是描述CpG ODN (SEQ ID NO:14)與RBV的組合在小鼠癌癥 模型中的作用的體內(nèi)研究結(jié)果的示圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及使用抗病毒劑與諸如免疫刺激性寡核苷酸的TLR配體 的組合來治療病毒感染、細(xì)菌感染或癌癥的方法和產(chǎn)品。本發(fā)明還包 括使用所述試劑組合的體外分析。
組合物的聯(lián)合施用可通過將各組分結(jié)合到一個(gè)分子中或者結(jié)合到 輸送載體中來實(shí)現(xiàn)，該輸送載體將它們同時(shí)輸送到靶細(xì)胞。本發(fā)明的 結(jié)合TLR配體和抗病毒劑可用于治療病毒病癥，例如急性病毒感染或 慢性病毒感染。急性病毒感染指可以自我消除(self-resolve)的短期感染， 通常少于6個(gè)月。慢性感染是復(fù)發(fā)或持續(xù)超過6個(gè)月時(shí)間，并且需要 干預(yù)來消除的感染。
病毒是小的傳染性媒介，其通常含有核酸核心和蛋白質(zhì)外殼，但 不是獨(dú)立存活的生物體。病毒也可以采取缺失蛋白的傳染性核酸的形 式。病毒在沒有活體細(xì)胞時(shí)不能存活，其能在活體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。 病毒通過細(xì)胞內(nèi)吞作用或直接注入DNA (噬菌體)而進(jìn)入特定活體細(xì)胞并繁殖，導(dǎo)致疾病。繁殖的病毒隨后能被釋放并感染其它細(xì)胞。 一些
病毒是含有DNA的病毒，其它是含有RNA的病毒。DNA病毒包括痘 病毒(Pox)、皰滲病毒(Herpes)、腺病毒(Adeno)、乳多空病毒(Papova)、 細(xì)小病毒(Parvo)和嗜肝DNA病毒(Hepadna)。 RNA病毒包括微小核糖 核酸病毒(Picorna)、杯狀病毒(Calici)、 Astro、披膜樣病毒(Toga)、黃病 毒(Flavi)、 冠4犬病毒(Corona)、 副粘'液病毒(Paramyxo)、正4'占病毒 (Orthomyxo)、 布尼亞病毒(Bunya)、 沙4立病毒(Arena)、 彈^|犬病毒 (Rhabdo)、絲狀病毒(Filo)、波爾納病毒(Borna)、呼腸孤病毒(Reo)和逆 轉(zhuǎn)錄病毒(Retro)。在一些方面，本發(fā)明也意圖治療其中在病程中牽涉 到朊病毒的疾病諸如例如動(dòng)物中的牛海綿狀腦病(即瘋牛病，BSE)或羊 瘙癢癥，或人類中的克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病。
病毒包括但不限于腸道病毒(包括但不限于小RNA病毒科 0/con7avzWfibe)病毒家族，諸如脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、艾柯病 毒)、輪狀病毒(rotaviruses)、腺病毒和肝炎病毒比如肝炎曱、乙、丙、 丁、戊型病毒。已在人類中發(fā)現(xiàn)的病毒的具體例子包括但不局限于 逆轉(zhuǎn)錄病毒科(/ e raWn'&e)(例如，人類免疫缺陷性病毒，諸如HIV-1 (也稱為HTLV-III、 LAV或HTLV-III/LAV,或HIV-III;以及其它分離 抹，諸如HIV-LP));小RNA病毒科(尸/cwmmW&e)(例如，骨髓灰白 質(zhì)炎病毒、曱肝病毒；腸道病毒，人柯薩奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)； Ca/c/v!W&e (例如，導(dǎo)致胃腸炎的病毒抹)；披蓋病毒科(7bgaWnV/ae)(例 如，馬腦炎病毒、風(fēng)滲病毒)；黃病毒科(Hav/v/n'&e)(例如，登革熱病 毒、腦炎病毒、黃熱病毒)；管狀病毒科(Cbra"avzW&e)(例如，日冕形 病毒)；彈狀病毒科(i /wZ^ovzW^^)(例如，水泡性口膜炎病毒、狂犬病 病毒)；纖絲病毒科(i^/ov/n'^e)(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如， 副流感病毒、腮腺炎病毒、麻瘆病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科 (OAcw_yxov7>7'(^e)(例如,流感病毒)；布尼亞病毒科(5w"yavzW(iae)(例 如，漢坦病毒、布尼亞病毒、phlebo病毒和內(nèi)羅病毒)；沙粒病毒科 G4rewavzWofae)(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(i eoWnWae)(例如，呼腸孑瓜 病毒、orbiviurses和4侖狀病毒)；雙核4唐核酸病毒科(5zy"av/nWae);嗜肝 DNA病毒科(/Ze/^^(3v/n'^e)(乙肝病毒)；孩t細(xì)小病毒科(尸arvov/nWae) (微細(xì)小病毒)；乳多泡病毒科(P^ovavzW必e)(乳頭瘤病毒、多形瘤病
19毒)；腺病毒科(y^fe"ovzW^fe)(最主要是腺病毒)；皰滲病毒科 。/^p^v/n^ae)(單純皰滲病毒(HSV)l和2、水痘帶狀皰滲病毒、巨細(xì) 胞病毒(CMV));痘病毒科(尸oxv/nWae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)； 虹彩病毒科(/n'ctoWnWae)(例如，非洲豬瘟病毒)；及其它病毒急性哮吼 伴隨病毒、a病毒、考波希肉瘤相關(guān)的皰滲皰疹病毒、新城疫病毒、尼 中白病毒(Nipahvirus) 、 i若5夭克病毒(Norwalkvirus)、 豸l頭瘤病毒 (Papillomavirus)、副流感病毒、禽流感、SARs病毒和西尼羅河病毒。
本發(fā)明的方法在一些實(shí)施方式中特別有用于治療人類免疫缺陷性 病毒(HIV)和肝炎病毒。HIV， 一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，也稱為人類T-細(xì)胞淋 巴細(xì)胞病毒III (HTLV III)，其造成導(dǎo)致稱之為AIDS的疾病的惡化。 HIV感染并摧毀T細(xì)胞，擾亂免疫系統(tǒng)的整體平衡，導(dǎo)致患者與其它 感染斗爭(zhēng)的能力，使患者有更大的機(jī)會(huì)患通常為致命的感染。
病毒性肝炎是肝臟的炎癥，其可造成腫脹、觸痛并且有時(shí)候造成 肝臟的永久損傷。如果肝臟的炎癥持續(xù)至少六個(gè)月或者更長(zhǎng)，則稱之 為慢性肝炎。已知存在至少五種不同的病毒導(dǎo)致肝炎，包括曱、乙、 丙、丁、戊型肝炎。曱型肝炎通常通過被人類糞便污染的食物或飲用 水傳染。乙型肝炎通常通過體液諸如血液傳播。例如，可在分娩時(shí)由 母親傳染給嬰兒、通過性接觸、污染的血液輸血和針頭傳播。丙型肝 炎很常見并且類似于乙型肝炎，其通常通過輸血和污染的針頭傳播。 丁型肝炎大多在為與之共同相關(guān)的乙肝病毒攜帶者的IV藥物使用者中 發(fā)現(xiàn)。戊型肝炎與病毒性曱型肝炎相似，通常與較差的衛(wèi)生狀況有關(guān)。
本文所用的術(shù)語"受試對(duì)象"指人或非人的脊推動(dòng)物。非人脊推動(dòng) 物包括家畜動(dòng)物，伴侶動(dòng)物(companionanimals)和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物。非人受 試對(duì)象還特別包括非人的靈長(zhǎng)類以及嚙齒動(dòng)物。非人受試對(duì)象還特別 包括，但不限于，雞、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、豚鼠、倉鼠、貂 和兔。在某些事實(shí)方式中，所述受試對(duì)象是患者。本文所用的"患者" 指接受醫(yī)生、其他保健工作者的護(hù)理的受試對(duì)象，包括咨詢過醫(yī)生或 其他保健工作者，接受其意見或者接受其處方或其他建議的受試對(duì)象。 患者通常是已經(jīng)患有病毒感染，或者有發(fā)生病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì) 象。
"患有病毒感染的受試對(duì)象"是患有病癥或者有患病風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象，該病癥源于傳染性病毒對(duì)所述受試對(duì)象的淺表、局部或全身侵入。 有發(fā)生病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象可以是已知暴露于特定病毒的受試 對(duì)象，例如遷移至已發(fā)現(xiàn)該病毒的地方的那些受試對(duì)象，居住在已發(fā) 現(xiàn)該病毒的地方的那些受試對(duì)象，以及密切接觸已感染病毒的受試對(duì) 象的那些受試對(duì)象。本發(fā)明用于治療患有病毒感染或者有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生病
毒感染的受試對(duì)象的病毒感染的方法包括向需要這類治療的受試對(duì) 象施用有效治療該病毒感染的量的本發(fā)明組合物。
TLR配體-抗病毒劑組合物在某些方面通過同時(shí)誘導(dǎo)固有的和抗原 特異的免疫應(yīng)答來發(fā)揮作用，該免疫應(yīng)答導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的多層 面的攻擊。所述抗病毒劑特異性地攻擊所述病毒，而所述免疫刺激性 寡核苷酸提供長(zhǎng)效的作用。該組合用來減少劑量方案(dosing regimes)、 改善依從性并維持治療、減少緊急狀況并改善生活質(zhì)量。
TLR配體刺激免疫系統(tǒng)來治療病毒感染。由所述寡核苷酸的免疫 刺激能力導(dǎo)致的強(qiáng)烈但平衡的、細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答反映了受試對(duì)象 對(duì)抗入侵病毒的天然防御系統(tǒng)。本文針對(duì)疾病或病況(condition)所用的 術(shù)語"治療"應(yīng)當(dāng)指干預(yù)這類疾病或病況，以防止或減^_所述疾病或病 況的發(fā)展，預(yù)防、抑制或減緩其進(jìn)程，阻止其進(jìn)程，或者消除該疾病 或病況。本文所用的術(shù)語"抑制"應(yīng)當(dāng)指相對(duì)于正常情況減少結(jié)果或作 用。
本發(fā)明組合物包括連接至一個(gè)或多個(gè)抗病毒劑的TLR配體。Toll 樣受體(TLR)是在哺乳動(dòng)物的先天免疫性中起關(guān)鍵作用的高度保守的 多肽家族。目前鑒定了 10個(gè)家族成員，命名為TLR1-TLR10。各種TLR 的胞質(zhì)域由Toll-白細(xì)胞介素1 (IL-1)受體(TIR)域來表征。Medzhitov R 等，(1998) Mo/ce//2:253-8。 TLR對(duì)微生物侵襲的識(shí)別引發(fā)在果蠅和哺 乳動(dòng)物中進(jìn)化保守(evolutionarily conserved)的信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活。據(jù)報(bào) 道，含TIR域的銜接蛋白MyD88與TLR結(jié)合，且將白細(xì)胞介素1受 體結(jié)合激酶(IRAK)和腫瘤壞死因子(TNF)受體結(jié)合因子6 (TRAF6)補(bǔ)充 到所述TLR中。人們認(rèn)為，MyD88依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致NF-kB 轉(zhuǎn)錄因子和c-JunNH2端激酶(Jnk)、促分裂素激活的蛋白激酶(MAPK) 的激活，這是免疫激活和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)^l建步驟。有關(guān)綜述參見Aderem A等，(2000) A/aft^e 406:782-87和Akira S等，(2004) Ato i ev 7m應(yīng)wo/4:499-511。
據(jù)認(rèn)為TLR在各種組織和各種類型的免疫細(xì)胞中差別表達(dá)。例如， 據(jù)報(bào)道，人TLR7在胎盤、肺、脾、淋巴結(jié)、扁桃體中，以及在漿細(xì) 胞樣前體樹突細(xì)胞(pDC)上表達(dá)。ChuangT-H等，(2000) Q勿&"e A/^w 11: 372-8); KadowakiN等，(2001)JEx/ MaH94: 863-9。據(jù)報(bào)道， 人TLR8在肺、外周血白細(xì)胞(PBL)、胎盤、脾、淋巴結(jié)中，以及在單 核細(xì)胞上表達(dá)。KadowakiN等，(2001)/五;c/ MW194: 863-9; Chuang T-H等，(2000)五wCyoyb'"eTVe w 11:372-8。據(jù)報(bào)道，人TLR9在脾、 淋巴結(jié)、骨髓、PBL中，以及在pDC和B細(xì)胞上表達(dá)。KadowakiN等， (2001)/￡xpM^ 194:863-9; Bauer S等，(2001)A^/A^sf5W 98:9237-42; Chuang T-H等，(2000) ￡wr Q^oh"e 7Verw 11:372-8。
人和小鼠TLR7的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的。參見，例 如GenBank登記號(hào)AF240467、 AF245702、 NM—016562、 AF334942、 NM—133211;和AAF60188、 AAF78035、 NP—057646、 AAL73191和 AAL73192，本文將它們所有的內(nèi)容引入作為參考。據(jù)報(bào)道，人TLR7 為1049個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。據(jù)報(bào)道，小鼠TLR7為1050個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。 TLR7多肽包括具有富含亮氨酸的重復(fù)區(qū)的胞外域、跨膜域和包括TIR 域的胞內(nèi)域。
人和小鼠TLR8的核苷酸和氨基酸序列是已知的。參見，例如 GenBank登記號(hào)AF246971、 AF245703、 NM—016610、 XM—045706、 AY035890、 NM—133212;和AAF64061 、 AAF78036、 NP_057694, XP—045706, AAK62677和NP—573475，本文將它們所有的內(nèi)容引入作 為參考。據(jù)報(bào)道，人TLR8存在至少兩種同工型， 一種為1041個(gè)氨基 酸長(zhǎng)度，而另一種為1059個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。小鼠TLR8為1032個(gè)氨基 酸長(zhǎng)度。TLR8多肽包括具有富含亮氨酸的重復(fù)區(qū)的胞外域、跨膜域和 包括TIR域的胞內(nèi)域。
人和小鼠TLR9的核苷酸和氨基酸序列是已知的。參見，例如 GenBank登記號(hào)NM—017442、 AF259262、 AB045180、 AF245704、 AB045181 、 AF348140、 AF314224、畫—031178;和NP—059138、 AAF72189、 BAB19259、 AAF78037、 BAB19260、 AAK29625 、 AAK28488和NP—112455，本文將它們所有的內(nèi)容引入作為參考。據(jù)報(bào)道，人TLR9 存在至少兩種同工型， 一種為1032個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，而另一種為1055 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。小鼠TLR9為1032個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。TLR9多肽類包括 具有富含亮氨酸的重復(fù)區(qū)的胞外域、跨膜域和包括TIR域的胞內(nèi)域。
本文所用的術(shù)語"TLR信號(hào)傳導(dǎo)"指與通過TLR的信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的 任何方面的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。本文所用的術(shù)語"TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答"指 與TLR信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的免疫應(yīng)答。
TLR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是與TLR7信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的應(yīng)答。TLR7介 導(dǎo)的免疫應(yīng)答的特征通常在于IFN-a和IFN可誘導(dǎo)細(xì)胞因子諸如IP-10 和I-TAC的誘導(dǎo)。在TLR7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中被誘導(dǎo)的細(xì)胞因子 IL-la/p、 IL-6、 IL-8、 MIP-la/卩和MlP-3a/卩的水平低于在TLR8介導(dǎo) 的免疫應(yīng)答中被誘導(dǎo)的水平。
TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是與TLR8信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的應(yīng)答。該應(yīng)答進(jìn) 一步的特征在于促炎性細(xì)胞因子如IFN-y、 IL-12p40/70、 TNF-a、 IL-la/卩、IL-6、 IL隱8、 MIP-la/卩和MlP-3a/卩的誘導(dǎo)。
TLR9介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是與TLR9信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的應(yīng)答。該應(yīng)答進(jìn) 一步的特征至少在于IFN-y和IL-12的產(chǎn)生/分泌，不過在水平上低于 通過TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答獲得的水平。
本文所用的"TLR7/8配體"或"TLR7/8激動(dòng)劑"泛指任何能夠增強(qiáng) TLR7和/或TLR8信號(hào)傳導(dǎo)的試劑(即TLR7和/或TLR8的激動(dòng)劑)。某 些TLR7/8配體僅誘導(dǎo)TLR7信號(hào)傳導(dǎo)(例如，TLR7特異性配體)，某些 僅誘導(dǎo)TLR8信號(hào)傳導(dǎo)(例如，TLR8特異性配體)，而其它同時(shí)誘導(dǎo)TLR7 和TLR8信號(hào)傳導(dǎo)。
本文所用的術(shù)語"TLR7配體"或"TLR7激動(dòng)劑"指任何能夠增強(qiáng) TLR7信號(hào)傳導(dǎo)的試劑(即TLR7的激動(dòng)劑)。在這方面，TLR7信號(hào)傳導(dǎo) 水平可以被增強(qiáng)超過預(yù)先存在的信號(hào)傳導(dǎo)水平，或其可以被誘導(dǎo)超過
信號(hào)傳導(dǎo)的本底水平(background level)。 TLR7配體包括，但不限于， 鳥苷類似物諸如C8-取代的鳥苷，主要由G和U構(gòu)成的核糖核苷的混 合物，鳥苷核苷酸和RNA或類RNA分子((PCT/US03/10406),以及基 于腺苷的化合物(例如6-氨基-9-千基-2-(3-羥基-丙氧基)-9H-噤呤-8-醇 和Sumitomo制造的類似化合物(如CL-029))。 TLR7配體還公開在Gorden等，J/附mw"o/. 2005, 174:1259-1268中(例如，3M-001, iV-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基-]甲磺酰胺； C17H23N502S; mw361)。
本文所用的術(shù)語"鳥苷類似物"指具有涉及鳥噪呤^喊基、鳥苷核苷 糖、或同時(shí)涉及鳥噪呤堿基及鳥苷核苷糖的化學(xué)修飾的類鳥苷核苷酸 (不包括鳥苷)。鳥苷類似物具體包括，但不限于，7-脫氮-鳥香。
鳥香類似物還包括C8-取代的鳥苷，諸如7-硫代-8-氧代鳥苷 (immunosine)、 8-巰基鳥苷、8-溴鳥苷、8-曱基鳥苷、8-氧代-7,8-二氫鳥 苷、C8-芳氨基-2，-脫氧鳥苷、C8-丙炔基-鳥苷，C8-和N7-取代的鳥嘌 呤核糖核苷，如7-烯丙基-8-氧代鳥苷(洛索立賓)和7-曱基-8-氧代鳥苷、 8-氨基鳥苷、8-羥基-2，，脫氧鳥苷、8-羥基烏苷和7-脫氮-8-取代的鳥苷。
本文所用的術(shù)語"TLR8配體"或"TLR8激動(dòng)劑"指任何能夠增強(qiáng) TLR8信號(hào)傳導(dǎo)的試劑(即TLR8的激動(dòng)劑)。在這方面，TLR8信號(hào)傳導(dǎo) 水平可以被增強(qiáng)超過預(yù)先存在的信號(hào)傳導(dǎo)水平，或者其可以被誘導(dǎo)超 過信號(hào)傳導(dǎo)的本底水平。TLR8配體包括主要由G和U構(gòu)成的核糖核 苷混合物，鳥苷核苦酸和RNA或類RNA分子(PCT/US03/10406)。其 他TLR8配體還公開在Gorden等， / /wmw"o/. 2005， 174:1259-1268中。
一些TLR7/8配體同時(shí)是TLR7和TLR8的配體。它們包括咪唑并 喹啉，主要由G和U構(gòu)成的核糖核苷混合物，鳥苷核苷酸和RNA或 類RNA分子(PCT/US03/10406)。其他TLR7/8配體還公開在Gorden等， / /www"o/. 2005， 174:1259-1268中(例如，3M-003, 4-氨基-2-(乙氧基曱 基)-a,a-二曱基-6，7,8,9-四氫-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-乙醇水合物； C17H26N402; mw318)。
咪唑并喹啉是免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，其被認(rèn)為誘導(dǎo)幾種細(xì)胞因子的表 達(dá)，包括干擾素(例如，IFN-a)、 TNF-a和某些白細(xì)胞介素(例如，IL-1、 IL-6和IL-12)。咪唑并喹啉能夠刺激Thl免疫應(yīng)答，正如其誘導(dǎo)IgG2a 水平提高的能力能部分證實(shí)。據(jù)報(bào)道，咪唑并會(huì)啉試劑還能夠抑制Th2 細(xì)胞因子諸如IL-4、 IL-5和IL-13的產(chǎn)生。咪唑并喹啉i秀導(dǎo)的某些細(xì)胞 因子由巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道，咪唑并喹啉的某些種類能 增加NK細(xì)胞的胞解活性，并且刺激B細(xì)胞增殖和分化，從而誘導(dǎo)抗 體產(chǎn)生和分泌。本文所用的咪唑并會(huì)啉試劑包括咪唑并喹啉胺，咪唑并吡啶胺，
6,7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺類和1,2橋連的咪唑并會(huì)啉胺類。在美 國專利4689338、 4929624、 5238944、 5266575、 5268376、 5346905、 5352784、 5389640、 5395937、 5494916、 5482936、 5525612、 6039969 和6110929中描述了這些化合物。咪唑并喹啉試劑的具體種類包括 R-848 (S-28463); 4-氨基-2-乙氧基曱基-a, a-二曱基-lH-咪唑并[4， 5-c] 喹啉-l-乙醇；l-(2-曱基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(R-837或咪喹 莫特)和S-27609。咪喹莫特目前用于疣的局部治療，如生殖器和肛門 疣，并且還在基底細(xì)胞癌的局部治療中進(jìn)行了測(cè)試.
本文所用的術(shù)語"TLR9配體"或"TLR9激動(dòng)劑"意指任何能夠增強(qiáng) TLR9信號(hào)傳導(dǎo)的試劑(即TLR9的激動(dòng)劑)。TLR9配體具體包括，但不 限于，免疫刺激性核酸，特別是CpG免疫刺激性核酸。
本文所用的術(shù)語"免疫刺激性CpG核酸"或"免疫剌激性CpG寡核 苦酸"指任何能夠活化免疫細(xì)胞的含CpG的核酸。至少所述CpG 二核 香酸中的C通常但并非必須是未曱基化的。在許多授權(quán)專利和公布的 專利申請(qǐng)中均描述了免疫刺激性CpG核酸，包括美國專利6,194,388; 6,207,646; 6,218,371; 6,239,116; 6，339，068; 6,406,705和6,429,199。
在某些實(shí)施方式中，所述TLR配體是免疫刺激性寡核苷酸。本文 所用的"免疫刺激性寡核苷酸"是任何包含能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫刺激 性模體或骨架的核酸(DNA或RNA)。誘導(dǎo)免疫應(yīng)答指免疫細(xì)胞的數(shù)量 或活性的提升，或者免疫因子(如細(xì)胞因子)的表達(dá)或絕對(duì)水平的提高。 免疫細(xì)胞包括但不限于NK細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、'CD8+T淋巴細(xì)胞、 B細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞。細(xì)胞因子包括但 不限于白細(xì)胞介素類、TNF-a、 IFN-a、卩和y、 Flt-配體和共同刺激 (co-stimulatory)分子。
免疫刺激性模體包括但不限于CpG模體和富含T的模體。免疫刺 激性骨架包括但不限于磷酸酯修飾的骨架，例如硫代磷酸酯骨架。免 疫刺激性寡核苷酸在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有廣泛描述，并且以下給出了這 些核酸的概述。
術(shù)語"寡核苷酸"和"核酸，，可以互換使用，指多核苷酸(即包含有連 接至磷酸酯基團(tuán)和連接至可交換有積^成基的糖的分子(例如核糖或脫氧核糖))，所述有才;u成基為取代的嘧咬(例如，胞嘧啶(c)，胸苦(T)或尿嘧
啶(U))或取代的噪呤(例如，腺噪呤((A)或鳥噪呤((G))。因此，該術(shù)語同 時(shí)涵蓋了 DNA和RNA寡核苷酸。該術(shù)語還應(yīng)包括多核苷 (polynucleosides)(即除去磷酸酯的多核苦酸)和任何其它含堿基的聚合 物。寡核苷酸可以獲自現(xiàn)有的核酸源(例如，基因組或cDNA)，但優(yōu)選 為合成的(例如，通過核酸合成制得)。
所述寡核苷酸可以是雙鏈或單鏈的。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)所述 寡核苷酸為單鏈時(shí)，它能夠形成形成二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(例如，通過其自 身折疊(folding back),或者通過自身雜交(或者貫穿其整體或者沿其長(zhǎng) 度在選定的片段處)。因此，盡管這類寡核苷酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)可以是單鏈 的，但其高級(jí)結(jié)構(gòu)可以是雙鏈或三鏈的。
免疫刺激性寡核苷酸可具有免疫刺激性模體，例如未曱基化的 CpG模體和非-CpG模體如富含T的模體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，某 些免疫刺激性模體優(yōu)于其它模體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，所述 免疫刺激性寡核苷酸不含poly-G模體。在某些實(shí)施方式中，任何核酸， 不管其是否具有可識(shí)別的模體，均可與抗病毒劑結(jié)合。免疫刺激性寡 核苦酸還包括具有修飾的骨架的核酸，例如硫代磷酸酯修飾的骨架。 在具體的實(shí)施方式中，所述具有硫代磷酸酯修飾的骨架的免疫刺激性 寡核苷酸同樣不具有可識(shí)別的模體，然而其仍是免疫刺激性的。
雖然在人DNA中相對(duì)稀少，但是CpG序列廣泛發(fā)現(xiàn)于諸如細(xì)菌 的傳染性生物體的DNA中。人體免疫系統(tǒng)已經(jīng)明顯發(fā)展到識(shí)別CpG 序列作為感染的早期警告信號(hào)，并且啟動(dòng)即刻且強(qiáng)力的對(duì)抗入侵病原 體的免疫應(yīng)答，而不會(huì)引起使用其他免疫刺激試劑時(shí)經(jīng)常見到的不利 反應(yīng)。因此，依賴這種固有的免疫防御機(jī)制，含CpG的核酸可利用獨(dú) 特的天然途徑進(jìn)行免疫治療。CpG核酸對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用已經(jīng)在美國 專利 6,194,388和公開的專利申請(qǐng)如PCT/US95/01570 、 PCT/US97/19791 、 PCT/US98/03678 ; PCT/US98/10408 ; PCT/US98/04703; PCT/US99/07335和PCT/US99/09863中做了廣泛描 述。
"CpG寡核苷酸"是包括至少一個(gè)未曱基化的CpG 二核苷酸的核 酸。在某些實(shí)施方式中，所述核酸包括三個(gè)或更多個(gè)未曱基化的CpG
26二核普酸。包含至少一個(gè)"未曱基化的CpG 二核苷酸"的核酸是在胞嘧 啶-鳥噪呤二核苷酸序'列中包含未曱基化的胞嘧啶(即"CpG DNA"或者 包含5，胞嘧啶以及隨后的3'鳥噤呤并通過磷酸酯鍵連接的DNA),并 且激活免疫系統(tǒng)的核酸分子。
為了促進(jìn)攝取進(jìn)入細(xì)胞中，所述免疫刺激性的寡核苷酸的長(zhǎng)度優(yōu) 選為6-100個(gè)堿基。然而，如果存在足夠的免疫刺激性模體，超過6 核苷的任意尺寸的核酸(甚至幾kb長(zhǎng))均能夠根據(jù)本發(fā)明誘導(dǎo)免疫應(yīng) 答。優(yōu)選地，所述免疫刺激性核酸的尺寸為8-100個(gè)核苷，在某些實(shí)施 方式中為8-50或8-30個(gè)核香。
所述免疫刺激性寡核苷酸可包含回文結(jié)構(gòu)(palindrome)或反向重復(fù) 序歹'J(即諸如ABCDEE，D，C，B，A，的序列，其中A和A，是能夠形成常規(guī) Watson-Crick堿基對(duì)的堿基)。在體內(nèi)，這種序列可形成雙鏈結(jié)構(gòu)。在 一實(shí)施方式中，所述CpG核酸包含回文序列。本文中所用的回文序列 指CpG構(gòu)成該回文一部分的回文，并且優(yōu)選是該回文的中心。在另一 實(shí)施方式中，所述CpG核酸不含六聚(hexameric)回文。不含六聚回文 的免疫刺激性核酸是CpG二核苷酸不構(gòu)成長(zhǎng)度至少為6核苷的回文的 一部分的核酸。這類寡核苷酸可包括回文，其中所述CpG不在該回文 中。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，使用非-CpG免疫刺激性核酸。非 -CpG免疫刺激性核酸是序列中不具有CpG模體的核酸，而不管該二核 苦酸的C殘基是曱基化的還是未曱基化的。根據(jù)其序列、輸送模式和 施用劑量，非-CpG免疫刺激性寡核苷酸可誘導(dǎo)Thl或Th2免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的所選方面，所述非-CpG免疫刺激性寡核苷酸可以是富 含T的核酸。富含T的核酸是具有富含T的模體的核酸。在Krieg等 人于2000年9月25遞交的美國專利申請(qǐng)第09/669,187號(hào)中描述了富 含T的模體和具有這類模體的核酸，本文將其全部?jī)?nèi)容引入作為參考。 本發(fā)明采用的其他非-CpG核酸如2001年1月22日遞交的美國專利申 請(qǐng)第09/768,012號(hào)中所述，本文將其內(nèi)容全文引入作為參考。
在某些實(shí)施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸具有修飾的骨架， 例如硫代磷酸酯修飾的骨架。授權(quán)給Hutcherson等人的美國專利第 5,723,335和5,663,153號(hào)和相關(guān)PCT公開WO95/26204描述了使用硫代磷酸酯寡核香酸類似物的免疫刺激。這些專利描述了硫代磷酸酯骨 架以非序列特異方式刺激免疫應(yīng)答的能力。因此，本發(fā)明的某些實(shí)施
方式依賴于缺少曱基化和未曱基化CpG模體和富含T模體的磷酸酯骨 架寡核苦酸的使用。
本發(fā)明方法還包括使用前述類型的免疫刺激性寡核苷酸，包括 ODN類型如A類、B類、C類、E類、T類和P類。在本發(fā)明的某些 實(shí)施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸包括為"CpG 二核苷酸"的免疫 刺激性模體。CpG 二核苷酸可以是曱基化的或者未曱基化的。含有至 少一個(gè)未甲基化CpG 二核苷酸的免疫刺激性核酸是包含未曱基化的胞 嘧啶-鳥噪呤二核苷酸序列(即未曱基化的5'胞嘧啶之后是3'鳥嘌呤并 且通過磷酸酯^t連接)，并且能激活免疫系統(tǒng)的核酸分子；這類免疫刺 激性核酸是CpG核酸。在眾多授權(quán)專利、公開的專利申請(qǐng)和其他公開 文獻(xiàn)中描述了 CpG核酸，包括美國專利第6,194,388; 6，207，646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116和6,339,068號(hào)。包含至少一個(gè)曱基化 的CpG 二核苦酸的免疫刺激性核酸是包含曱基化的胞嘧啶-鳥噪呤二 核香酸序列(即曱基化的5'胞嘧啶之后是3，鳥噪呤并且通過磷酸酯鍵連 接)，并且能激活免疫系統(tǒng)的核酸分子。在其他實(shí)施方式中，所述免疫 刺激性寡核苷酸不含CpG 二核苷酸。這些不含CpG 二核苷酸的寡核苷 酸稱為非-CpG寡核苷酸，并且它們具有非-CpG的免疫刺激性模體。 優(yōu)選地，這些是富含T的ODN，如具有至少80% T的ODN。
"B類，，ODN能有效激活B細(xì)胞，但是在誘導(dǎo)IFN-a和NK細(xì)胞活 化方面相對(duì)較弱。所述B類CpG核酸通常是完全穩(wěn)定的，并且在某些 優(yōu)選的石成基內(nèi)容中包括未曱基化的CpG二核苷酸。參見，例如美國專 利第6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116和6,339,068 號(hào)。另 一類能有效地誘導(dǎo)IFN-a和NK細(xì)胞活化，但是在刺激B細(xì)胞 方面相對(duì)較弱；這一類被定義為"A類"。A類CpG核酸通常在5'和3' 末端具有穩(wěn)定的poly-G序列，并且具有包含至少6個(gè)核苷酸的含磷酸 二酯CpG 二核苦酸的回文序列。參見，例如7>開的專利申讀-PCT/US00/26527 (WO 01/22990)。另 一類CpG核酸激活B細(xì)胞和NK 細(xì)胞并誘導(dǎo)IFN-a;這一類被定義為C-類。包含至少兩個(gè)不同模體的"C類，，免疫刺激性核酸對(duì)免疫系統(tǒng)的細(xì)
胞具有獨(dú)特的和所需要的刺激作用。這些ODN中有些同時(shí)具有常規(guī)"刺 激性"CpG序列和"富含GC"或"B-細(xì)胞中和"模體。這些組合才莫體核酸 具有免疫刺激作用，該刺激作用一定程度上介于與作為B細(xì)胞活化和 樹突細(xì)胞(DC)活化的強(qiáng)誘導(dǎo)劑的常規(guī)"B類"CpG ODN相關(guān)的作用以及 與一類最近描述的作為IFN-a和自然殺傷(NK)細(xì)胞活化的強(qiáng)誘導(dǎo)劑但 相對(duì)較弱的B-細(xì)胞核DC活化誘導(dǎo)劑的免疫刺激性核酸("A類"CpG ODN)相關(guān)的作用之間。KriegAM等，(1995) A^we 374:546-9; Ballas ZK等，(1996)J7mm朋o/ 157:1840-5; Yamamoto S等，(1992)J7mmw2。/ 148:4072- 6。雖然優(yōu)選的B類CpG ODN通常具有石危代磷酸酯骨架，而 優(yōu)選的A類CpG ODN具有混合的或嵌合的骨架，C類組合;f莫體免疫 刺激核酸可具有穩(wěn)定的如硫代磷酸酯、嵌合或磷酸二酯骨架，并且在 某些優(yōu)選實(shí)施方式中，它們具有半軟(semi-soft)的骨架。這一類在2002 年8月19日遞交的美國專利申請(qǐng)US 10/224,523中進(jìn)^f亍了描述，本文 將其內(nèi)容全文引入作為參考。
"P類"免疫刺激性寡聚核苷酸具有若干域，這些域包括5'TLR 活化域、2雙鏈形成區(qū)域和選擇性的間隔子及3'尾部。與C類相比， 這類寡聚核苷酸在一些情況下具有誘導(dǎo)更高水平的IFN-a分泌的能力。 P類寡聚核苷酸具有在體外和/或體內(nèi)自發(fā)地自組裝為串聯(lián)體的能力。 不希望受任何關(guān)于這些分子的作用方法的具體理論的約束， 一種可能 的假設(shè)是該性質(zhì)使P類寡聚核苷酸與先前描述的CpG寡聚核苷酸類別 相比具有在某些免疫細(xì)胞中更大程度地交聯(lián)TLR9、誘導(dǎo)獨(dú)特的免疫活 化模式的能力。TLR9受體的交聯(lián)可通過漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞中的I型 IFNR反饋回路來誘導(dǎo)更強(qiáng)的IFN-a活化。P類寡聚核苷酸至少在美國 專利11/706,561中描述。
當(dāng)沒有如同本發(fā)明的ODN —樣進(jìn)行修飾時(shí)，與B類和C類寡聚 核苷酸相比，"T類"寡聚核苷酸誘導(dǎo)較低水平的IFN-a分泌和IFN-相 關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子，但同時(shí)保留了與B類寡聚核苷酸相似的 IL-10誘導(dǎo)水平。T類寡聚核苷酸至少在美國專利申請(qǐng)11/099,683中有 所描述，上述專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容在此以引用的方式引入。"E類"寡核苷酸具有增強(qiáng)的誘導(dǎo)IFN-a分泌的能力。這些ODN具 有YGZ模體的親脂性的取代的核苷類似物5，和/或3，。E類通式的化合 物可以是例如任意的以下親脂性取代的核苷類似物取代的嘧啶、取 代的尿嗜，定、疏水的T類似物、取代的曱苯、取代的咪唑或吡唑、取 代的三唑、5-氯-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-乙基-尿嘧啶、 5-丙基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嗜啶、(E)-5-(2-溴乙烯基)-尿嘧啶或者2,4-二氟-曱苯。至少在臨時(shí)專利申請(qǐng)US 60/847,811中描述了 E類寡核苷 酸。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸是寡核糖 核苷酸(ORN)。免疫刺激性O(shè)RNs包括例如那些刺激TLR7/8模體的 ORN。 TLR7/8刺激性O(shè)RN可包括例如，諸如5，-C/U-U-G/U-U-3，、 5'畫R-U-R-G-Y-3， 、 5，-G-U-U畫G-B-3， 、5，-G-U-G-U國G/U-3，或 5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3'的核糖核苷酸序列。C/U是胞嘧啶(C)或尿 嘧啶(U)， G/U是鳥噪呤或U， R是噤呤，Y是嘧啶，B是U、 G或C， G/C是G或C，且A/C是腺噤呤(A)或C。所述5'-C/U-U-G/U-U-3，可 以是CUGU、 CUUU、 UUGU或UUUU。在各種實(shí)施方式中， 5'陽R-U-R-G畫Y-3，是GUAGU、 GUAGC、 GUGGU、 GUGGC、 AUAGU、 AUAGC、 AUGGU或AUGGC。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述堿模體列是 GUAGUGU。在各種實(shí)施方式中，5'-G-U-U-G-B-3，是GUUGU、 GUUGG 或GUUGC。在各種實(shí)施方式中，5，-G-U-G-U-G/U-3，是GUGUG或 GUGUU。在一實(shí)施方式中，所述石i^莫體列是GUGUUUAC。在各種其 它實(shí)施方式中，5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3，是GUAGGCAC 、 GUCGGCAC、 CUAGGCAC或CUCGGCAC。
在某些實(shí)施方式中，所述寡核苷酸不是銜接寡核苦酸或脫堿基寡 核芬酸。
銜接寡核苷酸包含式5，Xa-TTTTT-Xb 3，，其中Xa和Xb獨(dú)立為任何 核苷酸，并且可以存在也可以不存在。Xa和Xb可以表示一個(gè)或多個(gè)核 苷酸(例如，1-100個(gè)核苦酸)。寡核苷酸的長(zhǎng)度可以是7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23個(gè)或更多個(gè) 核苷酸。寡核苦酸可以包括6、 7個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的T。優(yōu)選地，所述 銜接寡核苷酸為dT均聚物(即具有本文所述長(zhǎng)度的寡dT)。更優(yōu)選地，
30所述銜接寡核苷酸為胸苷(dT)均聚物，長(zhǎng)度17個(gè)核苷酸。最優(yōu)選地， 它包含至少一個(gè)硫代磷酸化核苷酸間鍵(直到并且包括完整的硫代磷酸 化骨架)。
根據(jù)實(shí)施方式的不同，所述銜接寡核苷酸可以由100%T、 99%T、 98%T、 97% T、 96% T、 95% T、 94% T、 93% T、 92% T、 91%T、 9 0% T、 85% T、 80% T、 75% T、 7 0o/oT、 65% T、 60% T、 55% T、 50% T、 45%丁或更少的T組成。
另一類銜接寡核苷酸包含式5，Xa-UUUUU-Xb3，，其中Xa和Xb獨(dú)
立地為任何核苷酸，并且可以存在也可以不存在。Xa和Xb可以表示一
個(gè)或多個(gè)核苦酸(例如，1-100個(gè)核苷酸)。所述寡核苷酸的長(zhǎng)度可以是 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23個(gè)或更多個(gè)核苷酸。所述寡核苷酸可以包括6、 7個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的 U。在一種重要的實(shí)施方式中，所述寡核苷酸為dU均聚物，其優(yōu)選為 17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并且具有至少一個(gè)硫代磷酸化的核苷酸間鍵(直到并 且包括完整的硫代磷酸化骨架).
根據(jù)實(shí)施方式的不同，所述銜接寡核苷酸可以由100% U、 99% U、 98% U、 97% U、 96% U、 95% U、 94% U、 93% U、 92% U、 91%U、 90% U、 85% U、 80% U、 75% U、 70% U、 65% U、 60% U、 55% U、 50% U、 45% U或更少的U組成。
另一類銜接寡核苷酸包含式5，Xa-AAAAA-Xb3，，其中Xa和Xb獨(dú)
立地為任意核苷酸，并且可以存在也可以不存在。X3和Xb可以表示一
個(gè)或多個(gè)核苦酸(例如，1-100個(gè)核苷酸)。所述寡核苷酸的長(zhǎng)度可以為 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23個(gè)或更多個(gè)核苷酸。所述寡核苷酸可以包括6、 7或更多個(gè)連續(xù)的A。 在一種重要的實(shí)施方式中，所述寡核苦酸為dA均聚物，其優(yōu)選為17 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并且具有至少一個(gè)硫代磷酸化核苷酸間鍵(直到并且包 括完整的硫代磷酸化骨架)。
根據(jù)實(shí)施方式的不同，所述銜接寡核苷酸可以由100%A、 99%A、 98% A、 97% A、 96% A、 95%A、 94% A、 93% A、 92% A、 91% A、 90% A、 85% A、 80% A、 75%A、 70% A、 65% A、 60% A、 55% A、 50% A、 45% A或更少的A組成。另一類銜接寡核苷酸包含式5， Cn-Tm-Cp 3，，其中n為0-100的整 數(shù)(例如，3-7), P為0-100的整數(shù)(例如，4-8)，且m為0-100的整數(shù)(例 如，2-10)。優(yōu)選地，n與P之和等于或低于m的值，使得C含量低于 60%、低于55%、低于50%、低于45%、低于40%、低于35%、低于 30%、低于25%、低于20%、低于15%、低于10%、低于5°/?；蚋汀?在某些實(shí)施方式中，n為3-7， m為2-10且p為4-8,前提是滿足上述 百分比。
脫堿基寡核香酸類似DNA或RNA分子的骨架，其中不含所述核 堿基(如腺噤呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶和鳥噪呤)且任選地不含 糖殘基。因此，所述脫堿基寡核苷酸是由含磷酸酯的鍵連接的單元的 聚合物。所述聚合脫堿基寡核苷酸的每一單元均包括共價(jià)連接至包含 至少三個(gè)碳原子的有機(jī)殘基的磷酸基，或其硫代衍生物。所述有機(jī)殘 基包括可以是鏈狀或環(huán)狀、飽和或不飽和的烷基，其可包含O、 N和S 雜原子，并且還可以包括含有C、 H、 N、 O、 S、卣原子及其任意組合 的取代基。
所述有機(jī)殘基優(yōu)選衍生自丙烷-l,3-二醇或糖殘基，例如p-D-脫氧 呋喃核糖或P-D-呋喃核糖。其他殘基包括丁烷-l，4-二醇、三乙二醇單 元、或六乙二醇單元((OCH2CH2)pO，其中p為3或6)，羥基-烷基-氨 基連接子如C3、 C6、 C12氨基連接子、以及烷硫基連接子如C3或C6 巰基連接子。所述糖衍生物還可包含環(huán)擴(kuò)展，如吡喃糖。
所述脫堿基寡核芬酸還可包含雙倍體(Doubler)或三倍體(Trebler) 單元(Glen Research, Sterling, VA)，特別是包含3，3，-鍵。由多個(gè)雙倍體、 三倍體或其他多倍體單元形成寡核苷酸分枝導(dǎo)致形成樹狀聚合物 (dendrimers),它們是本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式。
一種單元可以是如下所示的脫石咸基脫氧核糖核苷酸<formula>formula see original document page 33</formula>其中R代表氧、硫、曱基或O-烷基。 一種單元可以是如下所示的脫;成基核糖核苷酸:<formula>formula see original document page 33</formula>
其中R代表氧、硫、曱基或O-烷基。 一種單元可以是如下所示的C3間隔基/磷酸酯:
<formula>formula see original document page 33</formula>其中R代表氧、硫、甲基或O-烷基。所述脫堿基寡核苷酸可以是脫堿基脫氧核糖核酸的均聚物
(poly-D)。在這種實(shí)施方式中，每一單元包括脫堿基2，-脫氧核糖的糖 殘基和5，磷酸基。在另一實(shí)施方式中，所述脫堿基寡核苷酸是脫堿基 核糖核酸的均聚物。在這種實(shí)施方式中，每一單元包括脫堿基2，-羥基 核糖的糖殘基和5，磷酸基。在另一實(shí)施方式中，所述脫堿基寡核苷酸 是脫堿基核糖核酸和脫堿基脫氧核糖核酸的雜聚物。
本發(fā)明的有用的免疫刺激性寡核苷酸可具有^f，務(wù)飾的骨架。例如， 它們可包含至少一個(gè)非磷酸二酯鍵的核苷酸間鍵。這類鍵可以是硫代 磷酸酯鍵。在某些實(shí)施方式中，所述寡核苷酸可具有嵌合骨架(即骨架 由至少兩種不同類型的核苦酸間鏈接構(gòu)成)。
本文所用的術(shù)語"硫代磷酸酯骨架"指其中至少 一個(gè)核苷酸間鍵中 的非橋連磷酸酯氧被;琉所替代的寡核苷酸的穩(wěn)定糖磷酸酯骨架。在一 種實(shí)施方式中，每一個(gè)并且所有核苷酸間鍵中的非橋連磷酸酯氧均被 硫替代。
相比天然RNA和DNA，本發(fā)明的寡核苷酸可以包括各種化學(xué)修 飾和取代，涉及磷酸二酯核苷間橋，P-D-核糖單元和/或天然核普堿基 (腺噤呤，鳥噪呤，胞嘧啶，胞嘧啶，尿嘧咬)?；瘜W(xué)修飾的例子是本領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的，并且在下列文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述，例如Uhlma皿E 等，(1990) Ozem i ev 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques ， S. Agrawal， Ed， Humana Press, Totowa， USA 1993; Crooke ST等，(1996) ^畫及ev尸/^應(yīng)co/ 7hx/co/ 36:107-29;和Hunziker J等，(1995) Mod 5y"A Md/zoA 7: 331-417。相比構(gòu)成天然DNA或RNA的相同序列的寡 核苷酸，本發(fā)明的寡核苷酸可以具有一個(gè)或多個(gè)修飾，其中每一個(gè)修 飾位于特定的磷酸二酯核苷間橋處和/或特定的P-D-核糖單元處和/或 特定的天然核苷堿基位置處。
例如，所述寡核苦酸可以包括一個(gè)或多個(gè)修飾，并且其中每一修 飾獨(dú)立地選自
a) 在核苷酸的3'和/或5'端由經(jīng)修飾的核苷酸間橋替代磷酸二酯核 香酸間橋，
b) 在核芬酸的3'和/或5'端由脫磷橋替代磷酸二酯核苷酸間橋，C)由另 一個(gè)單元替代來自糖磷酸酯骨架的糖磷酸酯單元，
d) 由經(jīng)修飾的糖單元替代P-D-核糖單元，和
e) 由經(jīng)修飾的核芬酸堿基替代天然核苷酸堿基。 寡核苷酸化學(xué)修飾的更具體的實(shí)例如下。
寡核苷酸可以包括經(jīng)修飾的核苷酸間鍵，例如以上(a)或(b)中所述 的那些。這些經(jīng)修飾的鍵可以部分耐受降解(例如穩(wěn)定化的)。"穩(wěn)定化 的寡核芬酸"應(yīng)當(dāng)指由這種修飾導(dǎo)致相對(duì)耐受體內(nèi)降解(例如通過核酸 外切酶或核酸內(nèi)切酶)的寡核苦酸。在某些實(shí)施方式中，具有^U戈磷酸 酯鍵的寡核苷酸可以提供最大的活性，并且保護(hù)所述寡核苷酸免于細(xì) 胞內(nèi)核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶的降解。
位于核苷的3，和/或5'末端處的磷酸二酯核苷間橋可以被經(jīng)修飾的 核苷間橋替代，其中所述修飾的核苷間橋選自，例如硫代磷酸酯、二 硫代磷酸酯、NRA、氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、 a-羥
基爺基膦酸酯、磷酸-(d-C2!)-0-烷基酯、磷酸-[(C6-d2)芳基-(CrC2!)-0
烷基]S旨、(d-C8)烷基膦酸酯和/或(CVC,2)芳基膦酸酯橋、(C7-C12)-aj5 曱基-芳基(例如,WO 95/01363中公開的)，其中(C6-C,2)芳基、(C6-C20) 芳基和(Q-d4)芳基任選被卣素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，并 且其中R1和R2相互獨(dú)立地為氫、(Q-ds)-烷基、(C6-C2o)-芳基、(C6-C14)-芳基-(C廣C8)-烷基，優(yōu)選氫、(Q-C8)-烷基，優(yōu)選(C廣C4)-烷基和/或曱氧 基乙基，或者R'和I^與攜帶它們的氮一起構(gòu)成5-6-元雜環(huán)，該雜環(huán)可 另外包含選自O(shè)、 S和N的其它雜原子。
位于核苦的3'和/或5，末端處的磷酸二酯橋可以被脫磷橋替代(脫 石粦橋7>開在，例如Uhlmann E和Peyman A的"Methods inMolecular Biology", Vol. 20， "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowal993, Chapter 16, pp. 355 ff中)， 其中脫磷橋例如選自脫磷橋縮甲醛(formacetal)、 3，-硫代縮曱醛、甲基 羥基胺、肟、亞甲基二曱基-肼?lián)?、二亞甲基砜?或曱硅烷基。
來自糖磷酸酯骨架(即由糖磷酸酯單元組成的糖磷酸酯骨架)的糖 磷酸酯單元(即一起構(gòu)成糖磷酸酯單元的P-D-核糖和磷酸二酯核苷間橋) 可以被其它單元替代，其中所述其它單元例如適合于構(gòu)成"嗎琳代-衍生 物，，寡聚體(例如，如StirchakEP等，(1989) A^c/e/c ^c/Ai ^ 17:6129-41中所述)，即例如被嗎啉代-衍生物單元替代；或者構(gòu)成聚酰胺核酸 ("PNA";例如，如Nielsen PE等，(19 94)所ocow/wg Ozem 5:3-7中所述)， 即例如被PNA骨架單元替代，例如被2-氨基乙基甘氨酸替代。所述寡 核苷酸可以具有其它碳水化合物骨架修飾和替代，例如具有磷酸基的 肽核酸(PHONA)，鎖定核酸(LNA)和具有帶烷基連接子或氨基連接子的 骨架部分的寡核苷酸。所述烷基連接子可以是支鏈的或無支鏈的，取 代或未取代的，以及手性純或外消旋混合物。
卩-核糖單元或P-D-2，-脫氧核糖單元可以被經(jīng)修飾的糖單元替代， 其中所述經(jīng)修飾的糖單元例如選自P-D-核糖、a-D-2，-脫氧核糖、L-2，-脫氧核糖、2'-F-2，-脫氧核糖、2'-F-阿拉伯糖、2'-0-(C廣C6)烷基-核糖、 2，-0-曱基核糖、2'-0-(C2-C6)鏈烯基-核糖、2'-
-核糖、2'-NH2-2，-脫氧核糖、(3-D-呋喃木糖、a-阿拉伯呋喃糖、2，4-雙脫氧-卩-D-赤型-吡喃己糖和碳環(huán)(例如，在Froehler (1992) //i附C/zew 5bc 1M:8320中所述的)和/或開鏈糖類似物(例如，在Vandendriessche 等，(1993) r"ra/2e^w7 49:7223中所述的)和/或雙環(huán)糖類似物(例如，在 Tarkov M等，(1993) /fe/v C/z/m76: 481中所述的)。在某些實(shí)施方 式中，所述經(jīng)修飾的糖為2'修飾的核糖。
在某些實(shí)施方式中，所述糖為2'-0-曱基核糖，尤其是由磷酸二酯 或類磷酸二酯核香間鍵所連接的核苷酸中的一個(gè)或兩個(gè)。
核酸還包括取代的噤呤和嘧啶，如C-5丙炔嘧啶和7-脫氮-7-取代 的嘌呤修飾的堿基。Wagner RW等，(1996) 所ofec/z"o/ 14:840-4。 噪呤和嘧啶包括但不限于腺噤呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嗜啶，以及 其它天然和非天然存在的核堿基(nucleobases),取代和未取代的芳族部 分。
經(jīng)修飾的堿基是與通常在DNA和RNA中發(fā)現(xiàn)的諸如T、 C、 G、 A和U之類的天然堿基化學(xué)上不同但與這些天然堿基共用基本化學(xué)結(jié) 構(gòu)的任何堿基。經(jīng)修飾的核香堿基可以例如選自次黃嘌呤、尿嘧咬、 二氫尿嘧咬、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、 5-(CrC6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基尿嘧啶、5-(CrQ)-炔基尿嘧啶、 5-(羥曱基)尿嗜啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧
啶、5-(CpC6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞
36嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N、二曱基鳥嘌呤、2,4-二氨基-嘌呤、8-氮雜嘌呤、取代的7-脫氮嘌呤，優(yōu)選7-脫氮-7-取代的 和/或7-脫氮-8-取代的噤呤、5-羥曱基胞嘧啶、N4-烷基胞嗜。定如N4-乙基胞嘧啶、5-羥基脫氧胞苷、5-羥曱基脫氧胞苷、N4-烷基脫氧胞苷 如N4-乙基脫氧胞苦、6-硫代脫氧鳥苦和硝基吡咯的脫氧核糖核苦、C5-丙炔基嗜啶和二氨基嘌呤如2,6-二氨基噪呤、肌苷、5-曱基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯噪呤、次黃嘌呤或天然核苷堿基的其它修飾物。 該列表僅為示例性的，并不應(yīng)解釋為限定性的。
在本文所述的具體結(jié)構(gòu)式中，可以引入經(jīng)修飾的石威基。例如，胞 嘧咬可以被經(jīng)修飾的胞嘧啶替代。本文所用的經(jīng)修飾的胞嘧咬為胞嘧 啶的天然存在的或非天然存在的嘧咬堿基類似物，其可以替代該堿基 而不會(huì)損及所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修飾的胞嘧啶包括但不限 于5-取代的胞嗜啶(例如，5-曱基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、 5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-羥曱基-胞嘧啶、5-二氟 甲基-胞嘧啶和未取代的或取代的5-炔基-胞嘧啶)、6-取代的胞嘧啶、 N4-取代的胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮雜-胞嘧啶、2-巰基-胞嘧 啶、異胞嘧啶、假-異胞嘧啶、具有縮合環(huán)系的胞嘧啶類似物(例如N，N，-丙烯胞嗜啶或吩噁溱)，以及尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫-尿嘧啶、5-羥基-尿嘧啶、5-丙炔 基-尿嘧啶)。 一些優(yōu)選的胞嘧啶包括5-曱基-胞嘧啶、5-氟-胞嗜啶、5-羥基-胞嘧咬、5-羥曱基-胞嘧啶和N4-乙基-胞嘧啶。在本發(fā)明的另 一實(shí) 施方式中，所述胞嘧咬石威基^皮通用(universal)堿基(例如，3-硝基吡咯， P-堿基)，芳族環(huán)系(例如，氟苯或二氟苯)或氫原子(dSpacer)所替代。
鳥噪呤可以被經(jīng)修飾的鳥嘌呤堿基替代。本文所用的經(jīng)修飾的鳥 嘌呤為鳥嘌呤的天然存在或非天然存在的嘌呤堿基類似物，它可以替 代該堿基而不會(huì)損及所述寡核苷酸的免疫刺激活性。經(jīng)修飾的鳥噪呤 包括但不限于7-脫氮鳥噪呤、7-脫氮-7-取代的鳥噪呤(如7-脫氮-7-(C2-C6)炔基鳥噪呤)、7-脫氮-8-取代的鳥嘌呤、次黃嘌呤、N2-取代的鳥 嘌呤(例如N2-曱基-鳥嘌呤)、5-氨基-3-曱基-3H，6H-噻唑并[4， 5-d]嘧咬 -2,7-二酮、2,6-二氨基嗓呤、2-氨基噪呤、嘌呤、p引咮、腺嘌呤、取代 的腺噤呤(例如N6-曱基-腺噪呤、8-氧代-腺噪呤)、8-取代的鳥。票呤(例如8-羥基鳥噤呤和8-溴鳥噪呤)，以及6-硫代鳥嘌呤。在本發(fā)明的另一 實(shí)施方式中，所述鳥噪呤堿基被通用堿基(例如，4-曱基H哚、5-硝基-。引哚和K-堿基)，芳族環(huán)系(例如苯并咪唑或二氯苯并咪唑、l-曱基-lH-[1，2,4]三唑-3-羧酰胺)或氫原子(dSpacer)所替代。
就本發(fā)明中的應(yīng)用而言，可以使用本領(lǐng)域公知的諸多方法中的任 何方法從頭開始合成本發(fā)明的寡核苷酸，例如(3-氰乙基亞磷酰胺法 (Beaucage SL等，(1981) re ra/^dra"丄e" 22: 1859);或核苷H-膦酸酯 法(Garegg等，(1986) r"ra/z^/ra"丄幼27: 4051-4; FroehlerBC等，(1986) iVwc/e/c爿c/(i A&s 14:5399-407; Garegg等，(1986)r"ra/2^raw 27:4055-8; Gaffnhey等，(1988) re/ra/zWra"丄故29:2619-22)。這些化 學(xué)方法可以通過各種市售的自動(dòng)化核酸合成儀來進(jìn)行。這些寡核苷酸 稱為合成寡核苷酸。分離的寡核苷酸通常指從通常與其天然結(jié)合的成 分中分離出的寡核苷酸。作為實(shí)例，分離的寡核苷酸可以為乂人細(xì)胞、 細(xì)胞核、線粒體或染色質(zhì)中分離的寡核苷酸。
可使用采用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化學(xué)的自動(dòng)化技術(shù)來合成經(jīng)修 飾的骨架如硫代磷酸酯。例如，可以如美國專利4,469,863中所述制備 芳基-和烷基-膦酸酯；并且可以使用市售的試劑通過自動(dòng)化固相合成來 制備烷基磷酸三酯(其中對(duì)帶電荷的氧部分進(jìn)行如美國專利5,023,243 和歐洲專利092,574中所述的烷基化)。制備其它DNA骨架修飾和取代 的方法已有記載(例如，Uhlmann E等，(1990) C7zem Aev 90:544; Goodchild J (1990) 5z.oco"j.wgafe CTzem 1:165)。
在某些實(shí)施方式中，所述寡核苷酸可以是軟或半軟的寡核苷酸。 軟寡核苷酸是具有部分穩(wěn)定的骨架的免疫刺激性寡核苷酸，其中磷酸 二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵僅出現(xiàn)在至少一個(gè)內(nèi)部嘧啶-噪呤二核普 酸(YZ)之內(nèi)，并且緊鄰至少一個(gè)內(nèi)部嗜啶-噪呤二核苷酸(YZ)。優(yōu)選地， YZ是YG，嘧啶-鳥噪呤(YG)二核苷酸。所述至少一個(gè)內(nèi)部YZ二核苷 酸本身具有磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵。緊鄰所述至少一個(gè)內(nèi) 部YZ 二核苷酸出現(xiàn)的磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵對(duì)于所述至 少一個(gè)內(nèi)部YZ二核苷酸而言可以是5'、 3'或者既有5'又有3，。
具體地，磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵插入"內(nèi)部二核苷酸"。 內(nèi)部二核芬酸通常應(yīng)當(dāng)指通過核香酸間鍵所連接的任何相鄰核香酸對(duì)，其中該核苷酸對(duì)中的任一核苷酸都不是末端核苷酸，即該核苷酸
對(duì)中的任一核苷酸都不是界定所述寡核苷酸的5，或3'末端的核苷酸。 因此，n個(gè)核苦酸長(zhǎng)的線性寡核苷酸總共具有n-l個(gè)二核苷酸，但僅有 n-3個(gè)內(nèi)部二核苦酸。每一內(nèi)部二核苷酸內(nèi)的核苦酸間鍵是內(nèi)部核苷酸 間鍵。因此，n個(gè)核苦酸長(zhǎng)的線性寡核苷酸具有總共n-l個(gè)核苷酸間鍵， 但僅有n-3個(gè)內(nèi)部核香酸間鍵。因此，按策略放置的磷酸二酯或類磷酸 二酯核香酸間鍵指位于核酸序列中任意核香酸對(duì)之間的磷酸二酯或類 磷酸二酯核苷酸間鍵。在某些實(shí)施方式中，所述磷酸二酯或類磷酸二 酯核苷酸間鍵不位于任一緊鄰5，或3'末端的核苷酸對(duì)之間。
優(yōu)選地，緊鄰所述至少一個(gè)內(nèi)部YZ二核苦酸出現(xiàn)的磷酸二酯或類 磷酸二酯核苷酸間鍵本身是內(nèi)部核苷酸間鍵。因此，對(duì)于每一 N,和 N2相互獨(dú)立地為任意單核苦酸的序列N, YZ N2，所述YZ 二核芬酸具 有磷酸二酯或類磷酸二酯核苦酸間鍵，并且(a)當(dāng)N,是內(nèi)部核苷酸時(shí)， Nj和Y被磷酸二酯或類磷酸二酯核苦酸間鍵所連接，(b)當(dāng)N2是內(nèi)部 核苷酸時(shí)，Z和N2被磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵所連接，或者 (c)當(dāng)K是內(nèi)部核苷酸時(shí)]^和Y被磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵 所連接，并且當(dāng)N2是內(nèi)部核苷酸時(shí)Z和N2被磷酸二酯或類磷酸二酯 核苷酸間鍵所連接。
與完全穩(wěn)定的寡聚核香酸相比，本發(fā)明的軟寡聚核苷酸被認(rèn)為相 對(duì)更易被核酸酶切割。不希望受具體理論或機(jī)制的約束，相對(duì)于全長(zhǎng) 軟寡聚核苷酸而言，認(rèn)為本發(fā)明的軟寡聚核苷酸可被切割為具有相對(duì) 降低的免疫刺激活性或不具有免疫刺激活性的片段。加入至少一個(gè)對(duì) 核酸酶敏感的內(nèi)部核苦酸間鍵，尤其靠近寡聚核苷酸中部，則被認(rèn)為 提供了"關(guān)閉開關(guān)，，，其將改變寡聚核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)，從而縮短寡 聚核苷酸的最大免疫刺激活性的持續(xù)時(shí)間。這在諸如腎之類的其中需 要避免與慢性局部發(fā)炎或免疫剌激相關(guān)的損傷的組織和臨床應(yīng)用中特 別有價(jià)值。
半軟寡聚核苷酸是具有部分穩(wěn)定骨架的免疫刺激性寡聚核苷酸， 其中磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵僅出現(xiàn)在至少一個(gè)內(nèi)部嘧咬-噪 呤(YZ)二核苷酸內(nèi)。與相應(yīng)的完全穩(wěn)定的免疫刺激性寡聚核苦酸相比， 半軟寡聚核苷酸通常具有提高的免疫刺激效力。由于半軟寡聚核苷酸的更大的效力，在一些情況下，半軟寡聚核苷酸可以以較低的有效濃 度使用，并且與傳統(tǒng)的完全穩(wěn)定的免疫刺激性寡聚核苷酸相比以更小 的有效劑量獲得所希望的生物效果。
人們認(rèn)為上述半軟寡聚核苷酸的性質(zhì)通常隨著牽涉到內(nèi)部YZ 二 核苷酸的磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵的"劑量，，的增加而提高。 因此，可認(rèn)為，例如通常對(duì)于具有五個(gè)內(nèi)部YZ二核香酸的給定寡聚核 芬酸序列而言，具有五個(gè)內(nèi)部磷酸二酯或類磷酸二酯YZ核苷酸間鍵的 寡聚核苷酸的免疫刺激性比具有四個(gè)內(nèi)部磷酸二酯或類磷酸二酯YG 核普酸間鍵的寡聚核苦酸的免疫刺激性更強(qiáng)，后者的免疫刺激性又比 具有三個(gè)內(nèi)部磷酸二酯或類磷酸二酯YZ核苷酸間鍵的寡聚核普酸的 免疫刺激性更強(qiáng)，后者的免疫刺激性又比具有兩個(gè)內(nèi)部磷酸二酯或類 磷酸二酯YZ核苷酸間鍵的寡聚核苷酸的免疫刺激性更強(qiáng)，后者的免疫 刺激性又比具有一個(gè)內(nèi)部磷酸二酯或類磷酸二酯YZ核苦酸間鍵的寡 聚核苦酸的免疫刺激性更強(qiáng)。重要的是，即使包括一個(gè)內(nèi)部磷酸二酯 或類磷酸二酯YZ核苷酸間鍵也被認(rèn)為比沒有內(nèi)部磷酸二酯或類磷酸 二酯YZ核苷酸間鍵更加有利。除磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵的 數(shù)目之外，沿核酸長(zhǎng)度方向的位置也可影響效力。
除位于優(yōu)選內(nèi)部位置的磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵之外， 所述軟或半軟寡聚核苷酸通常包括耐降解的5'和3'端。這些耐降解末 端可包括使其與相應(yīng)的未經(jīng)修飾的末端相比具有提高的外切核酸酶消 化耐受性的任何合適的修飾。例如，5'和3'端可通過加入骨架的至少一 個(gè)磷酸酯修飾而穩(wěn)定。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在骨架的每個(gè)末端處的至 少一個(gè)磷酸酯修飾獨(dú)立地是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯 或曱基硫代磷酸酯核芬酸間鍵。在另一個(gè)實(shí)施方式中，耐降解末端包 括在3'端通過肽鍵或酰胺4建相連的一個(gè)或多個(gè)核苷酸單元。
磷酸二酯核香酸間鍵是在自然界中發(fā)現(xiàn)的核酸的特征鍵類型。如 圖20所示，磷酸二酯核苷酸間鍵包括與兩個(gè)橋接氧原子側(cè)面相連并與 另外兩個(gè)氧原子(一個(gè)帶有電荷而另一個(gè)不帶有電荷)相連的磷原子。當(dāng) 縮短寡聚核芬酸的組織半衰期非常重要時(shí)，特別優(yōu)選磷酸二酯核苷酸 間鍵。
類磷酸二酯核芬酸間鍵是含有磷的橋接基團(tuán)，其與磷酸二酯化學(xué)地和/或非對(duì)映地相似。與磷酸二酯的相似性的量度包括對(duì)核酸酶消化
的易受性和活化RNAseH的能力。因此，例如磷酸二酯(而不是^5危代磷 酸酉旨)寡聚核芬酸易被核酸酶消化，盡管磷酸二酯和硫代磷酸酯寡聚核 苷酸均活化RNAseH。在優(yōu)選實(shí)施方式中，類磷酸二酯核苷酸間鍵是 硼代磷酸酯(或者相當(dāng)于硼代磷酸酯)鍵。見美國專利5,177,198;美國 專利5,859,231;美國專利6,160,109;美國專利6,207,819; Sergueev等， (1998>/Ozem. Soc. 120:9417-27。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，類磷 酸二酯核香酸間鍵是非對(duì)映的純Rp硫代磷酸酯。據(jù)認(rèn)為非對(duì)映的純Rp 硫代磷酸酯與混合的或非對(duì)映的純Sp疏代磷酸酯更容易被核酸酶消化 并能更好地活化RNAse H。 CpG寡聚核苷酸的立體異構(gòu)體是1999年6 月27日提交的共同未決的美國專利申請(qǐng)09/361,575和已公開的PCT 申請(qǐng)PCT/US"/17100 (WO 00/06588)的主題。應(yīng)當(dāng)注意到出于本發(fā)明 的目的，術(shù)語"類磷酸二酯核普酸間鍵"特意排除了二硫代磷酸酯和曱 基磷酸酯核苷酸間鍵。
如上所述，本發(fā)明的軟和半軟寡聚核苦酸可以在C和G之間具有 類磷酸二酯鍵。類磷酸二酯鍵的一個(gè)例子是Rp構(gòu)象的硫代磷酸酯鍵。 根據(jù)活性測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)，寡聚核普酸p-手性對(duì)CpG寡聚核芬酸的免疫 活性有明顯的相反作用。在早期40分鐘時(shí)間點(diǎn)，硫代磷酸酯CpG寡 聚核苷酸的Rp而不是Sp立體異構(gòu)體誘導(dǎo)了小鼠脾細(xì)胞中的JNK磷酰 化。相反，當(dāng)在較晚的44小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，Sp而并非Rp立體異構(gòu)體在刺 激脾細(xì)胞增殖中起作用。Rp和Sp立體異構(gòu)體的動(dòng)力學(xué)和生物活性的差 異并非源自于任何細(xì)胞攝取的差異，而最可能是由于p-手性的兩種相 反的生物角色。首先，在早期時(shí)間點(diǎn)Rp立體異構(gòu)體相比Sp而言增強(qiáng)的 刺激免疫細(xì)胞的活性表明Rp可更有效地與CpG受體TLR9相互作用， 或者誘導(dǎo)下游信號(hào)途徑。另一方面，與Sp相比，Rp PS-寡聚核苷酸的 更快速降解導(dǎo)致了短得多的信號(hào)持續(xù)時(shí)間，因此當(dāng)在較后期時(shí)間點(diǎn)， Sp PS-寡聚核苷酸似乎更具生物活性。
由CpG二核芬酸自身的p-手性實(shí)現(xiàn)了令人驚奇的強(qiáng)烈作用。與立 體隨機(jī)的CpG寡聚核苷酸相比，其中單一 CpG 二核苷酸以Rp連接的 同類物的活性稍微高一些，而含有Sp鍵的同類物對(duì)于誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖 幾乎沒有活性。
41在本發(fā)明前述的每一方面中，所述組合物還可包括可藥用載體，
從而本發(fā)明還提供了本發(fā)明的包含TLR配體和抗病毒劑的藥物組合 物。本發(fā)明組合物還可用于制備用于治療受試對(duì)象的病毒性病況的藥 物。本發(fā)明這一方面的用途包括將有效劑量的本發(fā)明組合物置于可藥 用載體內(nèi)的步驟。
在某些實(shí)施方式中，所述TLR配體和抗病毒劑是分離的(isolated)。
通常與其同時(shí):找到的物質(zhì)):程度達(dá)到能實(shí)際應(yīng):用且i合于其目標(biāo)用 途的分子。具體地，所述試劑足夠純并且基本不含細(xì)胞的其它生物成 分，從而可用于例如生產(chǎn)藥物制劑。因?yàn)楸景l(fā)明的分離試劑可與可藥 用載體混合在藥物制劑中，所以該試劑可以僅占制劑重量的小百分比。 盡管如此，對(duì)所述試劑進(jìn)行分離，使其基本上與它在活體系統(tǒng)中所結(jié) 合的物質(zhì)分離。
抗病毒劑是能防止細(xì)胞被病毒感染或細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制的化合物。 相比抗細(xì)菌劑藥物，抗病毒藥物少很多，這是因?yàn)椴《緩?fù)制的過程與 宿主細(xì)胞中的DNA復(fù)制緊密相關(guān)，而非特異性抗病毒劑通常對(duì)宿主也 是有毒的。病毒感染過程中存在多個(gè)階段可被抗病毒劑阻斷或抑制。 這些階段包括病毒附著于宿主細(xì)胞(免疫球蛋白或結(jié)合肽)、病毒脫殼 (例如金剛烷胺)、病毒mRNA的合成或翻譯(例如干擾素)、病毒RNA 或DNA的復(fù)制(例如核芬酸類似物)、新病毒蛋白的成熟(例如蛋白酶抑 制劑)和病毒出芽和釋放。
核苷酸類似物是與核苦酸相似但具有不完整的或異常的脫氧核糖 或核糖基團(tuán)的合成化合物。 一旦核苷酸類似物在細(xì)胞中，它們被磷酰 化，形成與正常核苷酸竟?fàn)庍M(jìn)入病毒DNA或RNA的三磷酸酯形式。 一旦核香酸類似物的三磷酸酯形式進(jìn)入生長(zhǎng)中的核酸鏈，它導(dǎo)致與病 毒聚合酶的不可逆結(jié)合從而造成鏈終止。核苷酸類似物包括但不限于 阿昔洛韋(acyclovir)(用于單純皰滲病毒和水痘帶狀皰滲病毒的治療)、 更昔洛韋(gancyclovir)(用于巨細(xì)胞病毒的治療)、碘苷(idoxuridine)、利 巴韋林(ribavirin)(用于呼吸道合胞病毒的治療)、二脫氧肌苷、二脫氧 月包苦和齊多夫定(zidovudine)(疊氮胸苷(azidothymidine))。
干擾素是由病毒感染細(xì)胞以及免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。干擾素通過與感染細(xì)胞相鄰的細(xì)胞上的特異性受體相結(jié)合而發(fā)揮作用，從而
導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生變化以保護(hù)其免受病毒感染。a和卩-干擾素也誘導(dǎo)感染細(xì) 胞表面上I類和II類MHC分子的表達(dá)，導(dǎo)致更多的抗原呈現(xiàn)以供宿主 免疫細(xì)胞識(shí)別。a和(3-干擾素以重組形式提供并用于慢性乙肝和丙肝感 染的治療。以有效進(jìn)行抗病毒治療的劑量，干擾素有嚴(yán)重的副作用， 諸如發(fā)熱、不適和體重降低。
多篇美國專利都描述了抗病毒化合物。例如，美國專利7,094,768 描述了用于治療HCV的-羥氨基-或6-烷氧氨基-7-脫氮噤呤-呋喃核糖 衍生物；美國專利7，041，698描述了用于治療HCV的三肽化合物、組 合物及方法；美國專利6,995,174描述了 HCV抑制劑；美國專利 7,022,736描述了作為病毒抑制劑的二酮酸(Diketoacid);美國專利 6,909,000描述了橋接的雙環(huán)HCV NS3-NS4A絲氨酸蛋白酶抑制劑；美 國專利6,867,185描述了 HCV的大環(huán)抑制劑；美國專利6,869,964描述 了雜環(huán)磺胺HCV抑制劑；美國專利6,846,810描述了抗病毒核苦衍生 物；以及公開了 PCT申請(qǐng)WO 0248157描述了作為HCV NS3蛋白酶 抑制劑的咪唑烷酮類及其相關(guān)衍生物。
已經(jīng)有或者正在開發(fā)多種藥物阻斷病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。這些藥物 包括三環(huán)癸胺和金剛乙胺(rimantadine)，它們用于對(duì)抗流行感冒；用于 治療鼻病毒、腸道病毒、腦膜炎、結(jié)膜炎和腦炎的普來可那立 (pleconaril)。
如上所述，核苷或核苷類似物是一類靶向病毒侵入細(xì)胞后的病毒 組分合成過程的藥物。阿昔洛維是有效對(duì)抗皰滲病毒感染的核香類似 物。用于治療fflV的齊多夫定(AZT)也是核苷類似物。拉米夫定 (lamivudine)被用于治療利用逆轉(zhuǎn)錄酶作為其復(fù)制過程一部分的乙型肝 炎。
開發(fā)中的其他抗病毒劑包括Rnase H和整合酶的靶標(biāo)、基于核糖 酶的化合物、蛋白酶抑制劑和干擾病毒從宿主細(xì)胞的釋放的藥物，如 用于治療流感的扎那米韋(zanamivir)和奧塞米韋(oseltamivir)。
目前使用的抗病毒劑的例子包括
拉米夫定(2',3，-雙脫氧-3，-硫代胞苷(thiacytidine)， 3TC),用于 HIV和慢性乙型肝炎的治療，是GlaxoSmithKline以商標(biāo)Epivir⑧和Epivir-HBV⑧上市的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。其也稱為3TC。它是胞苷的類似 物。
阿巴卡韋(abacavir) (ABC)是用于治療fflV和AIDS的核苷類似物 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NARTI)。其可以商標(biāo)Ziagen (GlaxoSmithKline)和復(fù) 方藥TrizivirTM(阿巴卡韋、齊多呋定和拉米夫定)以及 Kivexa⑧/EpzicomTM(阿巴卡韋和拉米夫定)獲得。ABC是鳥苷的類似物 (嘌呤)。其靶標(biāo)是病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶。
阿昔洛維(INN")或無環(huán)鳥苷(USAN),化學(xué)名羥乙氧曱鳥噪呤， 是一種鳥喋呤類似物抗病毒劑，用于治療例如I型單純皰滲病毒 (HSV-I)、 1I型單純皰滲病毒種(HSV-2)、水痘帶狀皰瘆病毒(VZV)、埃 -巴二氏病毒(EBV)和細(xì)胞巨化病毒(CMV)。它是最常用的抗病毒劑之 一，并且是通常以商標(biāo)Zovirax (GSK)上市。阿昔洛維不同于前述核苷 類似物之處在于它僅包含部分核香結(jié)構(gòu)-糖環(huán)被開環(huán)結(jié)構(gòu)所替代。 Aciclo-GTP是非常強(qiáng)力的病毒DNA聚合酶抑制劑。
三環(huán)癸胺(l-氨基金剛烷，以Symmetrel⑧銷售)是用于治療流感病 毒A的抗病毒藥。
地達(dá)諾新(didanosine)(2，-3，-雙脫氧肌苦，ddl)以商標(biāo)Videx⑧和 VidexEC⑧銷售。它是一種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，有效^"抗HIV，并與其他 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療聯(lián)合使用作為高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療 (HAART)的一部分。地達(dá)諾新(ddl)是腺苷的核苷類似物，具有連接至 糖環(huán)的次黃噤呤。
恩曲他濱(emtricitabine)(FTC)，商標(biāo)Emtriva (原先的Coviracil), 是一種用于治療成人HIV感染的核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)。恩曲他 濱是胞苷類似物。
恩夫韋地(enfUvirtide)(INN)是HIV融合抑制劑，以商標(biāo)Fuzeon (Roche)上市。
恩替卡韋是用于治療乙型肝炎感染的口服抗病毒藥，以商標(biāo) Baraclude (BMS)上市。恩替卡韋是抑制病毒復(fù)制過程的所有三個(gè)步驟 的鳥噤呤類似物。
甘昔洛(ganciclovir)是用于治療或預(yù)防細(xì)胞巨化病毒(CMV)感染的 抗病毒藥。甘昔洛是2，-脫氧鳥苷的合成類似物。奈韋拉平(nevirapine), 也是商標(biāo)Viramune (Boehringer Ingelheim) 上市，是用于治療fflV-I感染和AIDS的非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 (NNRTI)，其為蛋白酶抑制劑。
奧塞米韋是用于治療和預(yù)防流感病毒A和流感病毒B的抗病毒 藥。它是作為流感神經(jīng)氨酸酶的過渡態(tài)(transition-state)類似物抑制劑 的神經(jīng)氨酸酶抑制劑，預(yù)防從感染的細(xì)胞出現(xiàn)新的病毒。奧塞米韋適 用于治療由流感A和B病毒引起的感染，以及對(duì)抗犬細(xì)小病毒、貓泛 白細(xì)胞減少癥、稱為"犬舍咳(kennel cough)"的犬呼吸到綜合癥和稱為 "犬流行性感冒(canine flu)"的新疾病(emerging disease)。
利巴韋林(Copegus ; Rebetol ; Ribasphere ; Vilona ; Virazole ,也屬于Sandoz， Teva, Warrick)是對(duì)眾多DNA和RNA病毒 都具有活性的抗病毒藥。它是一種干擾病毒遺傳材料復(fù)制的核苦抗代 謝藥。利巴韋林具有廣鐠活性，包括重要的對(duì)抗流行性感冒、黃熱病 病毒的活性，并且是許多病毒性出血熱丙型肝炎、呼吸道合胞病毒-相 關(guān)疾病和流行性感冒的藥劑。在一實(shí)施方式中，利巴韋林與諸如CpG ODN或ORN的TLR7、 8、 9配體一同施用，相對(duì)于作為TLR配體的 結(jié)果產(chǎn)生的IFN-a降低了 IL-10的量。
AICA-核糖戒是類似利巴韋林的抗病毒藥。在一實(shí)施方式中， AICA-核糖武與諸如CpGODNs或ORNs的TLR7、8、9配體一同施用， 相對(duì)于作為TLR配體的結(jié)果產(chǎn)生的IFN-a降低了 IL-10的量。
金剛乙胺， 商標(biāo)Flumadine ,是用于治療(以及極少情況用于預(yù)防) 流感病毒A感染的口服給藥的藥物。
司他夫定(stavudine) (2，-3，-雙脫氫-2，-3，-雙脫氧胸苷，d4T,商標(biāo) Zerit⑧)是一種對(duì)HIV有活性的核苦類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NARTI)。 司他夫定是胸苷類似物。
纈昔洛韋(valaciclovir) (INN)或伐昔洛韋(USAN)用于控制單純性 皰滲和帶狀皰滲(shingles)的抗病毒藥。
阿糖腺苷(vidarabine)是對(duì)單純性皰滲和水痘帶狀皰滲病毒具有活 性的抗病毒藥。阿糖腺苷(9-P-D-呋喃核糖腺嘌吟)是腺苷的類似物，其 中D-核糖被D-樹膠醛醣替代。扎西他濱(zalcitabine)(2，-3，-雙脫氧胞苷，ddC)，也稱為雙脫氧胞苷， 是一種核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NARTI),以商標(biāo)Hivid⑧銷售。扎 西他濱是嘧啶類似物。
在本發(fā)明的某些方面，在寡核苷酸的合成過程中，可將諸如核苷 類似物的抗病毒劑引入免疫刺激性寡核苷酸分子上的一個(gè)或多個(gè)位 置，例如3，或5，末端。這也可以包括在核苷類似物側(cè)引入易受核酸酶 作用的位點(diǎn)，使得施用后可進(jìn)行抗病毒化合物的酶切，使得其抗病毒 活性不依賴于所述免疫刺激性寡核苷酸。所述抗病毒劑也可通過其他 鏈接(如3，-3')或連接子(非核苷酸連接子)連接至免疫刺激性O(shè)N。
此外，將不同TLR的配體結(jié)合入一個(gè)分子可能會(huì)導(dǎo)致受體的多聚， 這會(huì)導(dǎo)致免疫刺激增強(qiáng)，或者與由任一這類配體所產(chǎn)生的免疫刺激特 征(profile)不同的特征。
本發(fā)明提供了包括連接至抗病毒劑的TLR配體的組合物。本文所 用的術(shù)語"連接"指通過任意的物理化學(xué)相互作用，直接或間接連接在 一起的兩個(gè)或更多個(gè)組成部分的任意組合。在一實(shí)施方式中，所述鍵 是通過共價(jià)鍵合直接或間接連接到 一起的兩個(gè)或更多個(gè)組成部分的組 合。因此，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的TLR配體可與抗病毒劑一起 施用，但與其是物理分離的。然而，在其他實(shí)施方式中，可以預(yù)期配 體-抗病毒劑輒合物。
所述連接子可以連接到寡核苷酸上的任何反應(yīng)部分上，包括但不 限于骨架磷酸基團(tuán)或糖羥基。例如，它們可以通過磷酸二酯、硫代磷 酸酯、曱基膦酸酯和/或酰胺鍵引入?？赏ㄟ^現(xiàn)有方法合成不同的分子， 并且在固相合成過程中將這些分子在線連接到一起?？蛇x擇地，可以 在各部分序列合成之后將它們連接在一起。所述連接子本質(zhì)上可以為 非核苦酸。非核苷酸連接子有例如脫堿基殘基(dSpacer)、寡聚乙二醇 如三乙二醇(間隔基9)或六乙二醇(間隔基18)或烷-二醇如丁二醇。所述 間隔子單元優(yōu)選通過磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵連接。所迷連接子單元 在分子中可以只出現(xiàn)一次，或者可以引入多次，例如通過磷酸二酯、 硫代磷酸酯、曱基膦酸酯或酰胺鍵。其它優(yōu)選的連接子是烷氨基連接
子，如Q、 C6、 C,2氨基連接子，以及烷硫基連接子如C3或C6巰基連
接子。所述寡核苷酸還可以通過芳香殘基連接，該殘基可被烷基或取代烷基進(jìn)一步取代。寡核苷酸還可以包含雙倍體或三倍體單元，這使 得可將一種或不同類型的多個(gè)配體與寡核苷酸結(jié)合。所述寡核苷酸還 可以包含由肽修飾試劑或寡核苦酸修飾試劑產(chǎn)生的連接子
(www.glenres.com)。此外，它可以包含一種或多種通過肽(酰胺)鏈接所 連接的天然或非天然的氨基酸殘基。不同類型的連接子也可以合并成 新的連接子?？梢酝ㄟ^現(xiàn)有方法合成不同的寡核苷酸，并且在固相合 成過程中在線連接到一起?？蛇x擇地，可以在各部分序列合成之后將 它們連接到一起。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，將TLR配體與抗病毒劑連接在一起， 使得他們構(gòu)成同一分子的組成部分。TLR配體可直接或者通過非核苷 酸連接子與抗病毒劑連接。如果TLR配體共價(jià)結(jié)合至所述寡核苷酸而 沒有中間結(jié)構(gòu)，那么該TLR配體是"直接連接"的。如果它通過連接子 連接至寡核苷酸，那么該寡核苷酸稱作"間接連接"的。
連接所述寡核苷酸與抗病毒劑的連接子可以包含易受核酸酶作用 的位點(diǎn)。本文所用的"易受核酸酶作用的位點(diǎn)"指被稱為核酸酶的一類 酶中的成員所識(shí)別和酶切的DNA或RNA序列。在某些實(shí)施方式中， 所述易受核酸酶作用的位點(diǎn)被靶細(xì)胞中天然存在的核酸酶所識(shí)別和酶 切。
在某些實(shí)施方式中，所述抗病毒劑或連接子結(jié)合到所述免疫刺激 性寡核苷酸的內(nèi)部核苷酸上。本文所用的"內(nèi)部核苷酸"指不在核酸聚 合物的最3，或5'末端的核苷酸。因此，"末端核苷酸，，指在核酸聚合物 的3，或5'末端的核苦酸。在某些實(shí)施方式中，所述抗病毒劑或連接子 結(jié)合至末端核苷酸。本文所用的"3，末端核苷酸"指寡核苷酸聚合物的最 3'末端的核香酸殘基。類似地，"5，末端核苦酸"指在寡核苷酸聚合物的 最5'末端的核苷酸殘基。在某些實(shí)施方式中，所述免疫刺激性寡核苷 酸可包括內(nèi)部3，-3，鏈接or5，-5，鏈接。在這種情況下，所述免疫刺 激性寡核苷酸分別具有兩個(gè)5，或3'鏈接。如果所述抗病毒劑是核苷酸 或寡核香酸，那么所述抗病毒劑也可通過3，-5，， 3，-3，或5，-5，鏈接結(jié) 合至免疫刺激性寡核苷酸。
在本發(fā)明的某些方面，所述TLR配體和抗病毒劑并未連接，而是 以微顆粒的形式一同施用。本文所用的"微顆粒"是生物相容的微顆粒，或者適用于植入或給予哺乳動(dòng)物受體的植入物。在標(biāo)題為"聚合物基因
輸送系統(tǒng)，，的PCT國際申請(qǐng)PCT/US/03307 (
發(fā)明者喬格·沃爾默, 哈拉爾德·德貝拉克, 尤金·烏爾曼, 瑪麗昂·朱爾克, 羅伯特·L·布拉茨勒, 阿蘭·維卡里 申請(qǐng)人:科勒制藥集團(tuán)股份有限公司;科勒制藥有限責(zé)任公司;科勒制藥集團(tuán)有限公司