專利名稱：一種大米蛋白抗氧化活性肽的制備方法
一種大米蛋白抗氧化活性肽的制備方法技術(shù)領(lǐng)域一種大米蛋白抗氧化活性肽的制備方法，屬于大米蛋白深加工技術(shù)領(lǐng)域， 用于研制開發(fā)保健品和功能食品的基料。
技術(shù)背景大米在中國乃至世界上都是最重要的植物之一，大米蛋白是發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn) 味精、乳酸、檸檬酸及其它生化藥品后大量存在的副產(chǎn)物，干基蛋白質(zhì)含量在50%以上，屬于優(yōu)質(zhì)谷物蛋白，有良好的氨基酸組成配比，含人體必需的八種氨 基酸，有極其重要的利用價值，是一種潛在的植物蛋白資源。從經(jīng)濟的角度來看， 從大米及其加工副產(chǎn)品中開發(fā)出抗氧化食品，原料來源容易，成本低，消費者 容易接受。以前往往將其隨廢液排走造成浪費和污染，現(xiàn)在多將其干燥后用作 動物飼料，或者只進行了部分未確定的酶法改性，但工業(yè)附加值低。因此將大米 蛋白酶解而得到生物活性肽不失為進一步開發(fā)利用大米蛋白的途徑，是大米深 加工產(chǎn)品的發(fā)展方向。國內(nèi)外尚未有大米蛋白抗氧化肽的報道，本發(fā)明產(chǎn)品分 子量分布范圍在392 1367Da，能夠清除自由基，抑制亞油酸過氧化活性，螯 合金屬離子，是一種具有抗氧化活性的大米蛋白肽，具有營養(yǎng)和保健兩方面的 優(yōu)越性。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供大米蛋白抗氧化活性肽的制備方法，所得產(chǎn)品能夠清 除自由基，抑制亞油酸過氧化，螯合金屬離子，能有效地起到抗氧化作用，具 有營養(yǎng)和保健兩方面的優(yōu)越性，方法簡便，成本低廉，易得，無毒，安全。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種大米蛋白抗氧化活性肽的制備方法，通過粉碎大 米，加水，堿性環(huán)境下溶解大米蛋白，離心分離收集上清液，調(diào)節(jié)上清液pH值 等電點沉淀，洗滌沉淀至中性，加水均質(zhì)，再添加精制中性蛋白酶進行水解反 應，滅酶冷卻，離心分離所得上清液，真空濃縮，冷凍干燥得到大米蛋白抗氧 化活性肽；(1) 原料粉碎大米粉碎至過40目篩網(wǎng)；(2) 堿性環(huán)境溶解大米蛋白稱取(1)所得原料大米粉，加水，大米粉與水質(zhì)量比為1:12，并調(diào)節(jié)提取液pH值至12.75~12.85， 20 。C、 600 800 r/min 攪拌反應2 h;(3) 離心分離將(2)所得反應料液3000 4000 r/min、離心分離15 20 min 收集上清液；(4) 上清液處理調(diào)節(jié)(3)所得上清液pH值至5.45-5.55，沉淀45~90 min;(5) 洗滌沉淀采用去離子水反復洗滌沉淀至中性；(6) 沉淀加水均質(zhì)按沉淀與水的質(zhì)量比為1:20 1:30，向(5)所得沉淀 中加去離子水混勻并均質(zhì)；(7) 蛋白酶解調(diào)節(jié)(6)均質(zhì)后的溶液pH值至6.90 7.10，溫度35 40。C， 按[E/S] =1.33 %~ 1.55%的比例添加精制中性蛋白酶，保持pH值、溫度不變， 水解2.5 3.5h，所用精制中性蛋白酶酶活為130,000 U/g;(8) 滅酶冷卻(7)所述水解反應結(jié)束后升溫至60 'C滅酶10min，快速 冷卻反應液；(9) 離心分離將(8)所述反應液離心分離，2500-3500 r/min、離心8-12 min， 收集上清液；(10) 真空濃縮將(9)所得上清液在真空度0.09 MPa、溫度為45~50°C 進行真空濃縮，濃縮至固形物達60%以上；(11) 冷凍干燥冷凍干燥(10)所得濃縮液至粉末狀，冷凍干燥真空度 為10 30Pa，凍干溫度低于-3(TC，干燥時間20 24h，水分含量在5%以下，干 燥后的產(chǎn)品即為大米蛋白抗氧化活性肽。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明所用原料來源廣泛，成本低廉，方法簡便，無 毒安全，所得產(chǎn)品大米蛋白抗氧化活性肽能夠清除自由基，抑制亞油酸過氧化 活性，螯合金屬離子，具有營養(yǎng)和保健兩方面的優(yōu)越性。本發(fā)明技術(shù)設計科學 合理，對實現(xiàn)大米蛋白的綜合利用和提高其附加值具有重要的意義。


圖1產(chǎn)品的DPPH清除能力。圖2產(chǎn)品在亞油酸體系中抗氧化能力。圖3產(chǎn)品的金屬離子螯合能力。圖4大米蛋白抗氧化活性肽制備工藝流程示意圖。
具體實施方式
實施例1稱取經(jīng)過粉碎、過40目篩的3kg大米粉，加入水36L攪拌混勻，調(diào)節(jié)pH 值至12.80， 20 。C下攪拌(800r/min) 2h后，離心分離(3500 r/min,15 min)， 所得上清液pH值調(diào)至5.5，將所得懸濁液置于4 。C下沉淀1 h后，離心分離GOOO r/min， 10 min)得沉淀，采用去離子水反復洗滌沉淀至中性，之后按1:25的比 例在沉淀中加水混勻并均質(zhì)，pH值調(diào)至7.00，溫度37。C后，按E/S二1.33。/。 的比例添加精制中性蛋白酶(酶活為130,000 U/g)作用3 h;結(jié)束后60 °C、 10min 滅酶，酶解液冷卻至室溫后離心分離(3500 r/min， 10 min)，真空濃縮(真空度 0.09 MPa，溫度為48。C)，最后真空度為20Pa， -30 。C對酶解液進行冷凍干燥20 h，得到大米蛋白抗氧化活性肽。DPPH (l,l-二苯基苦基苯肼)自由基清除能力測定將干燥的水解產(chǎn)物分別溶解在4 mL蒸餾水中，制得濃度為0%， 0.04%， 0.08%, 0.12%， 0.16%, 0.2%和0.24% (m/v)蛋白質(zhì)溶液。在各樣品溶液中添加l mL 的40pMDPPH自由基的乙醇溶液。25 。C下靜置30min，于517nm測定吸收值。 根據(jù)以下公式計算不同濃度樣品中清除的自由基清除DPPH自由基能力(％) =[1— (A樣品/A空白)]xlOOA空e指1 mL的40 )iMDPPH自由基的乙醇溶液加入到濃度為0%的4 mL蒸 餾水中測得的吸收值；A樣品指1 mL的40 )iMDPPH自由基的乙醇溶液分別加入 到其余濃度的4 mL樣品溶液中測得的吸收值。產(chǎn)品在亞油酸體系中抗氧化能力測定一硫氰酸鐵法比較水解產(chǎn)物、a-生育酚、TBHQ (叔丁基對苯二酚)的抗氧化能力將10 mg水解產(chǎn)物、10 mg a-生育酚、10 mg TBHQ分別溶解于10 mL的50 mM (pH7.0)的磷酸鹽緩沖液中，各加入0.15mL亞油酸和10mL99.5。/。乙醇。 最后用蒸餾水定容至25 mL，稱之為亞油酸混合液。之后密閉放在暗處4(TC恒 溫?？瞻讓φ找猿兯娲鷺悠?、(x-生育酚、TBHQ。過氧化值的測定采用硫氰酸鐵法:取0.1 mL亞油酸混合液，依次加入4.7 mL 75%的乙醇和0.1 mL 30%的硫氰酸銨，再加入0.1 mL 0.02 M己經(jīng)溶解于3.5% 鹽酸中的氯化亞鐵，快速混勻，準確反應3 min后，在500 nm測定吸光度。0 時刻測定值為Ao，以后每隔24h測定一次，計為At。樣品的抗氧化能力以144h 時的氧化抑制率表示，抑制率按下式計算空白管A， (t=144h) 一樣品管A，(t=144h)抑制率=-X 100空白管A， (t=i44 h)—樣品營A， (—0 h)圖2顯示，酶解產(chǎn)物具有明顯的抗氧化能力，其抗氧化能力接近于a-生育 酚，比TBHQ的抗氧化能力稍差，但是TBHQ屬于化學合成的抗氧化劑，TBHQ 適用范圍會受到限制。金屬離子螯合能力測定酶解樣品與EDTA (乙二胺四乙酸)金屬離子螯合能力比較 用超純水配置濃度分別為0.1 mg/mL、 0.2mg/mL、 0.3 mg/mL、 0.4mg/mL、 0.5 mg/mL的酶解產(chǎn)物樣品溶液，以及相應濃度的EDTA溶液，取1 mL樣品液， 加入0.05 mL 2 mM FeCl2溶液和1.85 mL超純水，混合均勻，再加入O.lmL 5 mM ferrozine (SIGMA公司)溶液，劇烈震蕩均勻，室溫下靜置10min，測定562nm 的吸光值A(chǔ)g,取1 mL超純水代替樣品測定Aw所有測定值均為三次平均值。 螯合率按下式計算螯合率(％) = (A -A縣)/A娜x 100 圖3顯示，酶解產(chǎn)物具有明顯的金屬離子螯合能力，其金屬離子螯合能力 比EDTA稍差一些。
權(quán)利要求
1、一種大米蛋白抗氧化活性肽的制備方法，其特征是粉碎大米，加水，堿性環(huán)境下溶解大米蛋白，離心分離收集上清液，調(diào)節(jié)上清液pH值等電點沉淀，洗滌沉淀至中性，加水均質(zhì)，再添加精制中性蛋白酶進行水解反應，滅酶冷卻，離心分離所得上清液，真空濃縮，冷凍干燥得到大米蛋白抗氧化活性肽；(1)原料粉碎大米粉碎至過40目篩網(wǎng)；(2)堿性環(huán)境溶解大米蛋白稱取(1)所得原料大米粉，加水，大米粉與水質(zhì)量比為1∶12，并調(diào)節(jié)提取液pH值至12.75～12.85，20℃、600～800r/min攪拌反應2h；(3)離心分離將(2)所得反應料液3000～4000r/min、離心分離15～20min收集上清液；(4)上清液處理調(diào)節(jié)(3)所得上清液pH值至5.45～5.55，沉淀45～90min；(5)洗滌沉淀采用去離子水反復洗滌沉淀至中性；(6)沉淀加水均質(zhì)按沉淀與水的質(zhì)量比為1∶20～1∶30，向(5)所得沉淀中加去離子水混勻并均質(zhì)；(7)蛋白酶解調(diào)節(jié)(6)均質(zhì)后的溶液pH值至6.90～7.10，溫度35～40℃，按[E/S]＝1.33％～1.55％的比例添加精制中性蛋白酶，保持pH值、溫度不變，水解2.5～3.5h，所用精制中性蛋白酶酶活為130,000U/g；(8)滅酶冷卻(7)所述水解反應結(jié)束后升溫至60℃滅酶10min，快速冷卻反應液；(9)離心分離將(8)所述反應液離心分離，2500～3500r/min、離心8-12min，收集上清液；(10)真空濃縮將(9)所得上清液在真空度0.09MPa、溫度為45～50℃進行真空濃縮，濃縮至固形物達60％以上；(11)冷凍干燥冷凍干燥(10)所得濃縮液至粉末狀，冷凍干燥真空度為10～30Pa，凍干溫度低于-30℃，干燥時間20～24h，水分含量在5％以下，干燥后的產(chǎn)品即為大米蛋白抗氧化活性肽。
全文摘要
一種大米蛋白抗氧化活性肽的制備方法，屬于大米蛋白精深加工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以大米為原料，經(jīng)粉碎、堿溶酸沉、離心分離、上清液等電點沉淀、沉淀洗滌、加水均質(zhì)后再經(jīng)精制中性蛋白酶水解、離心分離、上清液經(jīng)冷凍干燥得到了分子量分布范圍在392～1367Da，具有抗氧化活性的大米蛋白肽。該產(chǎn)品所用原料來源廣泛，成本低廉，方法簡便，無毒安全，所得產(chǎn)品能夠清除自由基，抑制亞油酸過氧化活性，螯合金屬離子，具有營養(yǎng)和保健兩方面的優(yōu)越性。本發(fā)明技術(shù)設計科學合理，對實現(xiàn)大米蛋白的綜合利用和提高其附加值具有重要的意義。
文檔編號A23J3/14GK101253925SQ200810023519
公開日2008年9月3日 申請日期2008年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月1日
發(fā)明者姚惠源, 暉 張, 張君慧, 立 王, 郭曉娜 申請人:江南大學