Cephaloziellins H在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及化合物Ce地aloziellinsH的新用途，具體設(shè)及Ce地aloziellinsH 在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Rui-化anLi等人首次分離純化出化合物Ce地aloziellinsH，并將成果發(fā)表在 著名天然產(chǎn)物雜志Journalof化 1:uralProduct上（SecondaryMet油olitesfromthe ChineseLiverwortCephaloziellakiaeri，J.Nat.Prod.，2013,76,1700-1708)。
[0003]目前尚未有該化合物關(guān)于治療前列腺癌的活性報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種Ce地aloziellinsH的醫(yī)藥用途。
[0005] 上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006]CephaloziellinsH在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用，所述Ce地aloziellinsH 化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下，
[0007]
[0008] 進(jìn)一步地，所述前列腺癌為前列腺癌PC3和DU145。
【附圖說明】
[0009] 圖1 :不同濃度Ce地aloziellinsH作用7化后PC3和DU145存活率；
[0010] 圖2 :10.Omg/LC巧haloziellinsH作用不同時間后PC3和DU145存活率。
【具體實施方式】
[0011] 下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容。
[0012] 實施例1 :Ce地aloziellinsH的分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[001引CephaloziellinsH的制備方法同文獻(xiàn)報道的制備方法（SecondaryMet油olites fromtheChineseLiverwortCephaloziellakiaeri，J.Nat.Prod. ,2013,76， 1700-1708)。
[0014]結(jié)構(gòu)確證：無色結(jié)晶（甲醇），烙點150~153°C。根據(jù)HR-ESI-MS可知分子式 為〔2化2〇7,不飽和度為10。核磁共振氨譜數(shù)據(jù)5h(卵m，DMS0-de，600MHz) m)， H-1 (1. 65,m)，H-2 (2. 23, 2H，m)，H-3 (6. 74,dd，J= 3.6, 3. 0)，H-6(4. 62,dd，J= 10. 2，6.6)，H-7 (1. 95,dd，J= 13.8,6.6)，H-7 (2. 08,dd，J= 13.8,10. 2)，H-9 (2. 48,dd，J= 9. 0, 7. 2)，H-11 (2. 53,dt，J= 13. 0, 7. 2)，H-11 (2. 19,ddd，J= 13. 0,9. 0,6. 0)，H-12 巧.36， dd，J= 7. 2,6. 0)，H-14 化.27,br，s)，H-15 (7. 33,br，s)，H-16 (7. 35,br，s)，H-17 (1. 42， s)，H-19(1.26，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù) 5c(卵m，DMS0-de，150Hz) :33. 3(邸2，1-〇,24.7(邸2， 2-C)，135. 1 (畑，3-C)，132. 0 (C，4-C)，43. 1 (C，5-C)，78. 5 (CH，6-C)，34. 4 (細(xì)2, 7-C)， 74.6(C，8-C)，49. 7 (CH，9-C)，97. 3 (C，10-C)，31. 1 (邸2,11-C)，72. 2 (CH，12-C)，124.6(C， 13-C)，108. 1 (CH，14-C)，144. 0 (CH，15-C)，139. 2 (CH，16-C)，25. 3 (邸3,17-C)，168. 9 (C， 18-C)，22. 1 (CH3,19-C)，174. 4 (C，20-C)。結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致，因此可W確定本 發(fā)明制備的化合物即為文獻(xiàn)報道的Ce地aloziellinsH。
[0015] 實施例2:CephaloziellinsH的藥理作用試驗
[0016] -、材料和儀器
[0017] 前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3(ArCC-C化-1435)、前列腺癌細(xì)胞株DU145(ATCC-HTB-81)。 Ce地aloziellinsH自制，HPLC歸一化純度大于98%，用二甲基亞抓值MS0)配制成濃度 為1.Og/L的儲存液備用。CCK-8試劑盒為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品。RPMI-1640培養(yǎng)基 購自Gibco公司。胎牛血清（FB巧購自Hyelone公司。青/鏈霉素為上海先鋒藥業(yè)產(chǎn)品。 膜蛋白酶購自華美生物工程公司。二甲基亞諷值MS0)購自上海華舜生物工程公司。瓊脂 (Agarose)、二硫蘇糖醇值TT)、苯甲基橫獻(xiàn)氣（PMSF)、四甲基乙二胺燈EMED)為Sigma公司 產(chǎn)品。十二烷基橫酸鋼（SDs)、S氯甲基烷基甲燒（T;ris)T;ris-Hcl、T;ritonx-100為Promega 公司產(chǎn)品。丙締獻(xiàn)胺、過硫酸錢（A巧購于蘇州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。
[0018]C〇2細(xì)胞培養(yǎng)箱（化ellL油），倒置相差顯微鏡（Wkon)，超凈工作臺（蘇州凈化 設(shè)備廠），流式細(xì)胞儀度D)，F(xiàn)039300A型酶標(biāo)儀（Sunrise),高壓蒸汽滅菌器化irayama HA-300MD)，低溫超速離屯、機(jī)（Kubota3740)，萬向搖床（江蘇牒麟醫(yī)用儀器廠TS-92)，電泳 儀（Gibco公司），LXJ-II型離屯、機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠），DK600型電熱恒溫水浴箱（上 海精密試驗設(shè)備公司），電子天平（METTLERTOLEDO)，臺式干燥箱（上海森信實驗儀器有限 公司），紫外分光光度儀度eckman)。
[001引二、試驗方法 [0020] 1、細(xì)胞培養(yǎng)與養(yǎng)護(hù)
[00川 1.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0022] 細(xì)胞株培養(yǎng)于腫瘤醫(yī)院中屯、實驗室。培養(yǎng)于含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基 中，另添加谷氨獻(xiàn)胺（2mmol/L)和抗生素（100U/青霉素和lOOmg/L鏈霉素），置37°C、飽和 濕度、含5%C〇2氣體的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[002引 1. 2細(xì)胞傳代
[0024] ①于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞長滿貼壁，即可傳代。傳代前用75%酒精擦拭經(jīng) 過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。②用吸管吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，用PBS清洗3次。 ③加入0. 02%邸TA-0. 25%膜蛋白酶液2mL進(jìn)行消化，靜置約5分鐘，并不時在倒置相差顯 微鏡下觀察，當(dāng)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片時，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止膜 蛋白酶的作用。④用滴管將已經(jīng)消化的細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液，吸入lOmL離屯、管中平衡離屯、 (1000轉(zhuǎn)/分）5分鐘。⑥棄去上清液，加入2mL培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸 液，1:2~3分裝入新培養(yǎng)瓶，添加培養(yǎng)液適量于解箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[00巧]2、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
[0026] 倒置顯微鏡觀察：將對數(shù)生長期PC3和DU145細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24h 后加入10.Omg?L1，Ce地aloziellinsH處理24,48, 7化后分別在倒置相差顯微鏡下觀察 細(xì)胞形態(tài)改變并記錄。
[0027] 3、細(xì)胞毒試驗（CCK-8法）
[0028] ①培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后按照3X104個細(xì)胞/孔接種 于96孔板，每孔加0.ImL培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于37°C、含5%C〇2氣體的培養(yǎng)箱中。②試驗 分組：設(shè)陰性對照組（有細(xì)胞但不加藥，0. 1 %DMS0)，空白對照組（無細(xì)胞僅有培養(yǎng)液）， C巧haloziellinsH分別 2.5mg/l，5.Omg/l，10.Omg/L和 20.Omg/L共 6 組。③ 24 小時后觀 察細(xì)胞貼壁生長良好，分別按上述試驗分組向96孔板內(nèi)加藥，每組設(shè)6-8個重復(fù)孔。④加 藥后將96孔板移入37°C、含5% %氣體的培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48和72小時。⑥每 組試驗結(jié)束時每孔加入CCK-810yL37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時后酶標(biāo)儀檢測450每孔 的吸光度（0D)值，測定波長為450nm，參考波長為600nm。⑧按照W下公式計算出細(xì)胞存活 率（cellVi油ility)，然后繪制成圖表，存活率為50%時的值即為ICs。。細(xì)胞存活率（％) =[(As-Ab)/(Ac-Ab)]X100%。其中As為試驗孔，Ac為對照孔，Ab為空白孔。
[002引 4、集落形成試驗
[0030] ①取對數(shù)生長期細(xì)胞，計數(shù)后W3X1〇2個接種于6孔板，每孔加2mL培養(yǎng)基，常規(guī) 培養(yǎng)于37°C、含5%C〇2氣體的培養(yǎng)箱中。②24h后觀察細(xì)胞貼壁生長良好，分別加入不同 濃度（0,2. 5,5. 0,10. 0,20. 0mg/L)Ce地aloziellinsH處理，每組設(shè)3個重復(fù)孔。③加藥后 將6孔板移入37°C、含5%C〇2氣體的培養(yǎng)箱中繼續(xù)14天。④10%甲醇固定，Giemsa染色， 計算每孔集落數(shù)50個細(xì)胞的計為一個集落）。⑥計算集落形成率：集落總數(shù)/接種細(xì) 胞數(shù)X100%。
[0031]S、結(jié)果及結(jié)論
[0032] l、Ce地aloziellinsH氣對PC3和DU145細(xì)胞形態(tài)的影響
[0033] 鏡下見對照組細(xì)胞貼壁生長，相鄰細(xì)胞融合成片，細(xì)胞呈類圓形或梭形，體積較 大，排列緊密，邊緣光滑，胞質(zhì)飽滿，核膜、核仁等結(jié)構(gòu)輪廓明顯，細(xì)胞生長迅速；經(jīng)10.Omg/L Ce地aloziellinsH處理后，細(xì)胞密度逐漸降低，生長速度明顯減慢至幾乎停滯，細(xì)胞逐漸 脫落并漂浮于培養(yǎng)液中。細(xì)胞體積縮小，胞膜皺縮，成小圓形或不規(guī)則形態(tài)，胞內(nèi)多見小顆 粒狀物質(zhì)。藥物作用時間越長，細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變越明顯。
[0034] 2、細(xì)胞毒試驗
[003引不同濃度Ce地aloziellins H對前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145的生長均有抑 制作用。2. 5,5. 0,10. 0,20.0 mg/LCe地aloziellins H作用兩種細(xì)胞24,48和7化后的 存活率如下表所示（表1及表2)。其中，lO.Omg/LCe地aloziellins H作用于PC3和 DU145細(xì)胞24,45,7化后的細(xì)胞存活率分別為56. 2%，42. 5%，24. 3%和50. 8%，32. 6%， 20. 7%;2. 5,5. 0,10. 0,20.0 mg/l，Ce地aloziellins H作用兩種細(xì)胞7化后的存活率分 別為54. 3 %，37. 7%，24. 3 %，13. 2% 和52. 4%，32. 8%，20. 7%，11. 2% (見圖1及圖2)。 兩因素方差分析示不同濃度與不同時間處理組之間差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0. 05)，提示 Ce地aloziellins H對PC3和DU145的生長抑制作用呈時間濃度依賴。
[003引 3、集落形成試驗
[0037] 試驗顯示，對照組PC3和DU145的集落形成率分別為67. 7和64%，而2. 5,5. 0， 10. 0,20.Omg/LC巧haloziellinsH處理組分別為60. 7%，51. 3,39. 3%，27. 0%和49. 7%， 34. 0%，27. 7%，15. 7% (見表 3)。運進(jìn)一步證實了Ce地aloziellinsH對PC3 和DU145 細(xì) 胞具有增殖抑制作用。
[0038] 結(jié)論，本試驗中通過CCK-8法和集落形成試驗來驗證Ce地aloziellinsH對 前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145的作用，且抑制作用具有濃度一一時間依賴性關(guān)系。 Ce地aloziellinsH可能成為晚期前列腺癌治療中的一個具有潛力的選擇。
[0039] 表1不同濃度Ce地aloziellinsH作用于PC3后的細(xì)胞存活率
[0040]
[00川表2不同濃度Ce地aloziellinsH作用于DU145后的細(xì)胞存活率
[0042]
[0043] 表3不同濃度Ce地aloziellinsH作用下PC3和DU145的集落形成率
[0044]
【主權(quán)項】
1. Cephaloziellins H在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用，所述Cephaloziellins H化 學(xué)結(jié)構(gòu)式如下，2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cephaloziellins H在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用，其 特征在于：所述前列腺癌為前列腺癌PC3和DU145。
【專利摘要】本發(fā)明公開了Cephaloziellins？H在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用，屬于藥物領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)Cephaloziellins？H對前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145有抑制作用，且抑制作用具有濃度——時間依賴性關(guān)系，可以進(jìn)一步研究開發(fā)成制備治療前列腺癌的藥物。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/365, C07D493/04
【公開號】CN105147668
【申請?zhí)枴緾N201510654943
【發(fā)明人】劉高志
【申請人】劉高志
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年10月12日