專利名稱：：一種水產(chǎn)動物snp標記篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中的水產(chǎn)動物分子標記篩選技術(shù)，具體涉及一種水產(chǎn)動物SNP標記篩選的新方法，適合于在水產(chǎn)動物中發(fā)現(xiàn)和篩選SNP分子標記。
背景技術(shù)：
：SNP(單核苷酸多態(tài)性)作為第三代分子標記，具有以下特點SNP為雙等位型標記；SNP在DNA分子上分布不均勻；SNP有很高的密度；SNP具有遺傳穩(wěn)定性；SNP的檢測和分析易實現(xiàn)自動化。SNP在高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、性狀相關(guān)分子標記篩選等方面發(fā)揮著越來越重要的作用。大量基因組序列信息的獲得對于SNP的發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要，所以目前SNP研究主要集中在人類及各種模式生物上，其在非模式生物上的研究受到了極大限制。在水產(chǎn)領(lǐng)域內(nèi)，SNP研究更為罕見，并且所用的方法存在諸多不足，嚴重制約了SNP標記在水產(chǎn)領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。目前，水產(chǎn)動物上SNP的開發(fā)方式主要有兩種一種是基于大量序歹'H言息的歸選方式(Heetal.,2003;Smithetal.，2005;Bradleyetal.，2007),這種方式主要集中在才莫式魚類-斑馬魚及重要經(jīng)濟魚類-鮭魚等種類上。因為這種基于大規(guī)模測序的方法，成本較高，并不適合于所有經(jīng)濟魚類的SNP開發(fā)，所以并沒有得到普及。第二種是針對候選基因的SNP開發(fā)(TaoandBoulding，2003;RyynS腦andPrimmer,2006)，這類方法在經(jīng)濟魚類上有一定的應(yīng)用前景，成本豐交低，但由于需要首先進行基因克隆，其效率較低，而且由于SNP的連鎖性，鄰近的SNP位點往往以單倍型的形式存在，難以得到大量有效的SNP位點。因而，在水產(chǎn)動物上，亟需一種能夠有效開發(fā)大量SNP位點，并且成本較低的方法。我們發(fā)明的這種方法，可以在整個基因組內(nèi)批量尋找SNP位點，具有高效率、低成本的特點，有利于SNP標記在水產(chǎn)動物上的推廣應(yīng)用。為此，本發(fā)明提出了一種全新的SNP標記篩選方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種水產(chǎn)動物SNP標記篩選方法，可以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的效率低、成本高的問題。本發(fā)明的目的是建立一種全新的SNP標記開發(fā)方法，能夠在基因組序列信息較少的情況下，獲得大量的SNP標記，為基因組序列未知的非模式生物及水產(chǎn)經(jīng)濟動物提供篩選大量SNP標記的新方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)一種水產(chǎn)動物SNP標記篩選方法，其特征在于包4舌如下步驟1)基因組DNA提取按照常規(guī)酚氯仿方法分別提取8-12個半滑舌鰨個體的高純度DNA,取少量樣本》欠入研4本中，加少許液氮研磨，直至組織^皮碾成粉末，將粉末轉(zhuǎn)入離心管中并加入DNA提取液TENS,然后再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇溶液,混勻直至形成乳狀液，室溫下離心，取上清，重復(fù)抽才是兩次，向上清液中加入1/10體積的NaAc和2倍體積的冰冷無水乙醇，^f吏DNA沉淀10-30分鐘，70%乙醇漂洗沉淀，TE溶解DNA,測定DNA濃度后，將8-12個個體的DNA等量混合形成DNA池；2)#sel限制性內(nèi)切酶酶切，接頭連"f姿及預(yù)擴增取1-2Pg混合后的基因組總DNA,加入50-100單位內(nèi)切酶進4亍酶切反應(yīng)，65。C溫浴1.5-2.5小時，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，用TE溶解，取部分純化的酶切產(chǎn)物與序歹'J為5-TACTCAGGACTCAT-3/5-GACGATGAGTCCTGAG-3的Msel接頭用T4連接酶16°C連接過夜，然后對連接產(chǎn)物進行PCR預(yù)擴增，用以富集DNA產(chǎn)物，PCR預(yù)擴增反應(yīng)混合物中含有稀釋10倍后的5juL酶切-連接產(chǎn)物、終濃度為0.4jLiM、序列為5'一GATGAGTCCTGAGTAAN—3'的Msel—N引物、lxPCR纟爰沖液、0.2pM的dNTP以及1U的TaqDNA聚合酶，反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min,94。C變性30s,53。C退火lmin,72。C延伸1min進4亍20個循環(huán)，最后72。C延伸10min，反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳一僉測，判斷產(chǎn)物分布范圍及產(chǎn)物量，PCR產(chǎn)物應(yīng)該為一分步均勻的彌散帶；3)雜合雙鏈的形成，I酶切及"WDNA聚合酶延伸將預(yù)擴增產(chǎn)物進行變性及復(fù)性，使其形成雜交雙鏈，變性及復(fù)性條件為95。C變性2min，以2。C/秒的速度從95。C降至85°C,然后以0.rC/秒的速度從85。C降到25°C,最后4。C保存。復(fù)性產(chǎn)物用CELI對SNP位點進4亍酶切，酶切條件為10nL復(fù)性產(chǎn)物與20jaL反應(yīng)緩沖液，10mMHEPES7.5,10mMMgS04，0.002%(w/v)TritonX-100,20ng/mL小牛血清蛋白，混合，加入1單位CELI酶，45°C溫浴25-35分鐘，加入5juL0.15MEDTA，pH8，終止反應(yīng)；酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后用于Bst延伸，延伸條件為20mMTris-HCl,pH8.8，10mMKC1,10mM(匪4)2S04,2mMMgS04,0.1%吐溫X-100,20nMdATP,20nMdGTP,20nMdCTP，13nMdTTP,7nMbiotin-dUTP，4單位BstDNA聚合酶，然后置于65。C溫浴1小時；4)含有SNP位點DNA分子的》茲珠分離l-2mg的包被有鏈親和素的磁珠用300juLTEN100(10mmo1/LTris-HC1，lmmol/LEDTA，100mmo1/LNaC1，pH7.5)溶液在室溫下洗滌3次，然后將其與PCR產(chǎn)物-生物素復(fù)合體在室溫下混合雜交25-35分鐘，磁珠吸附完畢后，用磁力架固定磁珠，移去雜交混合液，首先進行3次非嚴謹性洗脫使用400|uL緩沖液TEN1000(10niMTris-HC1,1mMEDTA,1000mMNaCl，pH7.5)于室溫下洗滌PCR產(chǎn)物-磁珠復(fù)合物3次，每次5分鐘；隨后進行3次嚴謹性洗脫使用400jaL0.2xSSC(30mMNaCl，3mM種檬酸鈉，pH7.0)+0.1%SDS于室溫下洗滌3次，每次5分鐘，每次洗滌后都需使用磁力架固定磁珠，棄上清；最后再用lxSSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)洗脫兩次，除去SDS，加入50jaLTE,吹打均勻，于95°C下水浴10分鐘，期間不時攪動或者輕輕吹打均勾，用；茲力架固定石茲珠后，迅速吸出上清液，經(jīng)純化后備用；5)目標DNA的擴增富集及克隆測序?qū)⒓兓蟮?jaLDNA液用于PCR擴增，條件與預(yù)擴增相同，PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單克隆，陽性克隆檢測后，按照常規(guī)方法進行序列分析；6)SNP標記鑒定根據(jù)測序結(jié)果進行引物設(shè)計；將8-12個個體的DNA等量混合后作為PCR模板，然后進行PCR擴增，克隆測序，每條序列需測序10個克隆，驗證SNP位點，將單堿基差異出現(xiàn)頻率在20%及以上的位點定義為SNP標記。本發(fā)明的學(xué)術(shù)思路是采用CELI內(nèi)切酶特異性切割SNP位點，BstDNA聚合酶鏈置換活性及生物素-磁珠分離方法。通過變性和復(fù)性后，舍有SNP的DNA鏈會形成單堿基不匹配的雜交雙鏈，CELI內(nèi)切酶可以特異識別這種位置，并在SNP位點處切割DNA雙鏈中的一條，形成3，-OH末端。BstDNA聚合酶具有鏈置換活性，可以以CELI酶切后的一條鏈為模板，而以帶有3，-OH末端的一條鏈為引物進行DNA延伸反應(yīng)。在DNA延伸過程中，可以將Biotin標記的dUTP滲入到DNA鏈中。生物素與鏈親和素可以特異結(jié)合，因此，含有SNP位點的DNA可以與鏈親和素包被的磁珠特異結(jié)合，從而起到SNP的分離作用。本發(fā)明的方法是將8-12個個體DNA混合形成DNA池；經(jīng)/化el限制性內(nèi)切酶酶切，接頭連接及預(yù)擴增獲得大量DNA;通過變性和復(fù)性形成雜合雙鏈，CELI酶切SNP位點及BstDNA聚合酶滲入生物素；通過生物素-磁珠分離方法特異分離含有SNP位點的DNA;將分離得到的DNA進4亍克隆測序；最后通過多個個體序列的比對一瞼證SNP位點。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是本發(fā)明建立了一種分離SNP位點的新方法。目前已有的SNP分離方法主要有兩種，一種是隨機測序或全基因組測序，成本較高且分離效率較低；第二種是候選基因或候選基因組區(qū)域的SNP分離，這種方法必須事先知道基因的序列，而且僅僅局限在同源區(qū)域，操作比較繁瑣，不利于大規(guī)模SNP發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用。本發(fā)明的SNP標記分離新方法，可以在基因組信息未知的情況下，高效、大批量地隨機分離SNP，有利于大量SNP的開發(fā)及其后續(xù)利用。圖1是水產(chǎn)動物SNP標記篩選方法的技術(shù)路線示意圖2是序列1的SNP篩選結(jié)果；圖3是序列2的SNP篩選結(jié)果；圖4是序列3的SNP篩選結(jié)果；圖5是序列4的SNP篩選結(jié)果；圖6是序列5的SNP篩選結(jié)果；圖7是序列6的SNP篩選結(jié)果；圖8是序列7的SNP篩選結(jié)果；圖9是序列8的SNP篩選結(jié)果；1圖10是序列9的SNP篩選結(jié)果；其中上述序列1-9是含有SNP位點的9條序列，是從分離的DNA序列中隨機選取了10條序列用于SNP位點鑒定，每個片段測IO個克隆，其中單堿基差異出現(xiàn)頻率為20%及以上的位點定義為SNP位點，最終有9條序列含有SNP位點，大寫字母代表相同的堿基，小寫字母代表SNP位點及堿基；點(…)表示空位；橫線(一-)表示堿基相同。具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。實施例1下面以半滑舌鰨為例，結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進行詳細闡述如圖1所示，包括六個步驟l)基因組DNA提取；2)Msel限制性內(nèi)切酶酶切，接頭連接及預(yù)擴增；3)雜合雙鏈的形成，CELI酶切及BstDNA聚合酶延伸；4)含有SNP位點DNA分子的^茲^朱分離；5)目標DNA的擴增富集及克隆測序；6)SNP標記鑒定。其中，l)基因組DNA提取利用酚氯仿方法分別提取10個半滑舌鰨個體的DNA。取10-20mg肝組織放入研缽，加少許液氮研磨，直至組織被碾成粉末。加入lmlDNA提取液TENS(10mMTris-HClpH8.0,lOOmMNaCl,25mMEDTA,0.5°/。SDS)勻漿。在裂解液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:l)溶液，封嚴離心管蓋，反復(fù)輕柔的轉(zhuǎn)動離心管，形成乳狀液，室溫下離心12000rpm，20min,重復(fù)抽提兩次。將上清液分裝在1.5ml的離心管中，每個離心管加入1/10體積的NaAc(3M)和2倍體積的冰冷無水乙醇，混勻，置冰上10—30min,使DNA沉淀。70°/。乙醇漂洗;咒;定，TE(10mMTris—HC1pH8.0，lmMEDTA)溶解DNA。定量觀寸定DNA濃度后，將10個個體的DNA等量混合后形成DNA池。2)Msel限制性內(nèi)切酶酶切，接頭連接及預(yù)擴增取1000ng混合后的基因組總DNA，加入50U的內(nèi)切酶Msel進行酶切反應(yīng)。酶切總體積為250nL,65。C溫浴2小時。酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Qiagen)純化后，用50julTE溶解。取15jiL的酶切產(chǎn)物與Msel接頭(5-TACTCAGGACTCAT-3/5-GACGATGAGTCCTGAG-3)用T4連接酶連接，16。C過夜。PCR預(yù)擴增反應(yīng)混合物中含有稀釋10倍后的5jjL酶切-連^妄產(chǎn)物、終濃度為0.4uM的Msel-N引物(5，-GATGAGTCCTGAGTAAN-3')、1xPCR緩沖液(含Mg2+)、0.2jaM的dNTP以及1U的TaqDNA聚合酶。反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5min，然后94。C變性30s,53。C退火1min，72。C延伸1min進行20個循環(huán)，最后72。C延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測，判斷產(chǎn)物分布范圍及產(chǎn)物量。3)雜合雙鏈的形成，CELI酶切及BstDNA聚合酶延伸將預(yù)擴增產(chǎn)物進行變性及復(fù)性，條件為95°C2min，95°C到85°C(-2°C/s),85。C到25°C(-0.1°C/s)，4。C保存。復(fù)性產(chǎn)物用CELI酶切，酶切條件為10yL復(fù)性產(chǎn)物與20|uL反應(yīng)緩沖液(10mMHEPES7.5,10mMMgS04，0.002%(w/v)TritonX-100,20ng/mL小牛血清蛋白)混合，加入1單位CELI酶，45°C溫浴25-35分鐘。加入5juL0.15MEDTA(pH8)終止反應(yīng)。CELI酶可以采用商品化產(chǎn)品，也可自行制備，制備方法參考相關(guān)文獻進行，操作步驟為取約500g芽菜莖，4"C下勻漿，將溶液調(diào)節(jié)至0.1MTris-HCl，pH7.7，100|uMPMSF，2600g離心10分鐘，去除雜質(zhì)；將上清調(diào)節(jié)至25%飽和石克酸4妄，4'C下混勻30分鐘，16000g，4'C離心40分鐘；將上清調(diào)節(jié)至80y。飽和^e充酸銨，4。C下混勻30分鐘，16000g、4°C離心90分鐘；沉淀用十分之一起始體積的0.1MTris-HC10.5MKCLpH7.7，100mMPMSF溶液重懸，將其裝入透析袋中并在相同的溶液中透析4小時，每小時更換一次透析液；最后將其分裝并-2(TC保存。CELI酶活力單位定義為45。C溫浴30分鐘可以有效切割含有已知SNP位點(突變型與野生型比例為1:1)DNA鏈的最少劑量。酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Qiagen)純化后用于Bst延伸，延伸條件為20mMTris-HCl(pH8.8),10mMKCl，10mM(NH4)2S04,2mMMgS04,0.1%吐溫X-100，20nMdATP，20nMdGTP，20nMdCTP,13nMdTTP,7nMbiotin-dUTP,4單位BstDNA聚合酶。然后置于65。C溫浴1小時。BstDNA聚合酶具有鏈替換活性，可以以酶切后的一條鏈為引物而另一條鏈為模板進行DNA鏈的延伸，在延伸過程中可以使biotin-dUTP滲入到含有SNP位點的DNA鏈中。4)含有SNP位點DNA分子的f茲珠分離1-2mg的包3皮有鏈親和霉素的i茲珠用300TEN100(lOmmol/LTris-HCl,lmmol/LEDTA,1OOmmo1/LNaC1，pH7.5)在室溫下洗滌3次，然后與PCR產(chǎn)物-生物素復(fù)合體在室溫下混合雜交25-35min,其間需要不時的輕輕攪動和吹打，以避免；茲珠沉淀。f茲珠吸附完畢后，用磁力架固定磁珠，移去雜交混合液。首先進行3次非嚴謹性洗脫使用400|uL緩沖液TEN1000(10mMTris-HCi,1mMEDTA，1000mMNaCl,pH7.5)于室溫下洗滌PCR產(chǎn)物-磁珠復(fù)合物3次，每次5分鐘，不時的攪動或輕輕吹打。然后緊接著進行3次嚴謹性洗脫使用400)aL0.2xSSC(30mMNaCl，3mM斗1M蒙酸鈉，pH7.0)+0.1%303于室溫下洗滌3次，每次5分鐘，不時的攪動或輕輕吹打。每次洗滌后都需使用磁力架固定磁珠，棄上清。最后再用1xSSC(150mMNaCl,15mM杵檬酸鈉，pH7.0)洗脫兩次，除去SDS。加入50pLTE(pH=8.0)，吹打均勻，然后于95'C下水浴10分鐘。期間不時攪動或者輕輕吹打均勻。用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Qiagen)純化后，用于PCR擴增或凍存于-2(TC冰箱備用5)目標DNA的擴增富集及克隆測序?qū)⒓兓蟮?|liLDNA洗脫液用于PCR擴增，具體條件與預(yù)擴增相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Qiagen)純化后與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單克隆，陽性克隆檢測后測序(具體克隆步驟參考《分子克隆》第三版進行)。6)snp標記鑒定根據(jù)測序結(jié)果，利用常規(guī)引物設(shè)計軟件和人工校正相結(jié)合的方法進行引物設(shè)計，設(shè)計的基本原則有GC含量在40%-60%之間；引物長度在22bp-25bp之間；一對引物的退火溫度相差不超過2度；避免引物3'端發(fā)卡結(jié)構(gòu)及引物間的二聚體結(jié)構(gòu)。按照以上原則及方法，共設(shè)計引物23對(表1)，其中15對引物有特異性擴增產(chǎn)物(表1)，將其中的IO對用于SNP位點鑒定；將IO個個體的DNA等量混合后作為PCR模板，然后進行PCR擴增(PCR擴增反應(yīng)混合物中含有模板DNA5Ong、序歹'J特異引物lOpmol、1xpcr《爰沖液(含Mg2+)、0.2mM的dNTP以及1U的TaqDNA聚合酶。反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5min，然后94。C變性3Gs，56°C-65°C退火30s,72。C延伸lmin進行35個循環(huán)，最后72。C延伸10min),克隆測序(具體克隆步驟參考《分子克隆》第三版進行)。每條序列需測序10個克隆，驗證SNP標記5為了防止PCR和測序中的誤差，將單堿基差異出現(xiàn)頻率在20%及以上的位點定義為SNP標記。我們從分離得到的10條序列中，發(fā)現(xiàn)有9條序列含有共35個SNP標記，如圖2-圖10所示，僅有一條序列不含有SNP標記。表1:用于SNP標記鑒定的23對引物序列<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。權(quán)利要求1、一種水產(chǎn)動物SNP標記篩選方法，其特征在于包括如下步驟1)基因組DNA提取按照常規(guī)酚氯仿方法分別提取8-12個半滑舌鰨個體組織DNA，取少量組織放入研缽中，加少許液氮研磨，直至組織被碾成粉末，將粉末轉(zhuǎn)入離心管中并加入DNA提取液TENS，然后再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇溶液，混勻直至形成乳狀液，室溫下離心，取上清，重復(fù)抽提兩次，向上清液中加入1/10體積的NaAc和2倍體積的冰冷無水乙醇，使DNA沉淀10-30分鐘，70％乙醇漂洗沉淀，TE溶解DNA，測定DNA濃度后，將8-12個個體的DNA等量混合形成DNA池；2)MseI限制性內(nèi)切酶酶切，接頭連接及預(yù)擴增取1-2μg混合后的基因組總DNA，加入50-100單位內(nèi)切酶MseI進行酶切反應(yīng)，65℃溫浴1.5-2.5小時，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，用TE溶解，取部分純化的酶切產(chǎn)物與序列為5-TACTCAGGACTCAT-3/5-GACGATGAGTCCTGAG-3的MseI接頭用T4連接酶16℃連接過夜，然后對連接產(chǎn)物進行PCR預(yù)擴增，用以富集DNA產(chǎn)物，PCR預(yù)擴增反應(yīng)混合物中含有稀釋10倍后的5μL酶切-連接產(chǎn)物、終濃度為0.4μM、序列為5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’的MseI-N引物、1×PCR緩沖液、0.2μM的dNTP以及1U的TaqDNA聚合酶，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，53℃退火1min，72℃延伸1min進行20個循環(huán)，最后72℃延伸10min，反應(yīng)產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳檢測，判斷產(chǎn)物分布范圍及產(chǎn)物量，PCR產(chǎn)物應(yīng)該為一分步均勻的彌散帶；3)雜合雙鏈的形成，CELI酶切及BstDNA聚合酶延伸將預(yù)擴增產(chǎn)物進行變性及復(fù)性，使其形成雜交雙鏈，變性及復(fù)性條件為95℃2min，在5秒內(nèi)將其從溫度95℃降到85℃，速度為-2℃/秒，然后從85℃降到25℃，速率為-0.1℃/秒，4℃保存，復(fù)性產(chǎn)物用CELI對SNP位點進行酶切，酶切條件為10μL復(fù)性產(chǎn)物與20μL反應(yīng)緩沖液，10mMHEPES7.5，10mMMgSO4，0.002％(w/v)TritonX-100，20ng/mL小牛血清蛋白，混合，加入1單位CELI酶，45℃溫浴25-35分鐘，加入5μL0.15MEDTA，pH8，終止反應(yīng)；酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后用于Bst延伸，延伸條件為20mMTris-HCl，pH8.8，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％吐溫X-100，20nMdATP，20nMdGTP，20nMdCTP，13nMdTTP，7nMbiotin-dUTP，4單位BstDNA聚合酶，然后置于65℃溫浴1小時；4)含有SNP位點DNA分子的磁珠分離1-2mg的包被有鏈親和素的磁珠用300μLTEN100溶液在室溫下洗滌3次，然后將其與PCR產(chǎn)物-生物素復(fù)合體在室溫下混合雜交25-35分鐘，磁珠吸附完畢后，用磁力架固定磁珠，移去雜交混合液，首先進行3次非嚴謹性洗脫使用400μL緩沖液TEN1000于室溫下洗滌PCR產(chǎn)物-磁珠復(fù)合物3次，每次5分鐘；隨后進行3次嚴謹性洗脫使用400μL0.2×SSC+0.1％SDS于室溫下洗滌3次，每次5分鐘，每次洗滌后都需使用磁力架固定磁珠，棄上清；最后再用1×SSC洗脫兩次，除去SDS，加入50μLTE，吹打均勻，于95℃下水浴10分鐘，期間不時攪動或者輕輕吹打均勻，用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，經(jīng)純化后備用；5)目標DNA的擴增富集及克隆測序?qū)⒓兓蟮?μLDNA液用于PCR擴增，條件與預(yù)擴增相同，PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單克隆，陽性克隆檢測后，按照常規(guī)方法讓測序公司進行序列分析；6)SNP標記鑒定根據(jù)測序結(jié)果進行引物設(shè)計；將8-12個個體的DNA等量混合后作為PCR模板，然后進行PCR擴增，克隆測序，每條序列需測序10個克隆，驗證SNP位點，將單堿基差異出現(xiàn)頻率在20％及以上的位點定義為SNP標記。全文摘要本發(fā)明建立了一種水產(chǎn)動物SNP標記篩選方法，可以解決現(xiàn)有SNP標記篩選技術(shù)中存在的效率低、成本高的問題。所采用的技術(shù)方案包括如下步驟1)基因組DNA提??；2)MseI限制性內(nèi)切酶酶切，接頭連接及預(yù)擴增；3)雜合雙鏈的形成，CELI酶切及BstDNA聚合酶延伸；4)含有SNP位點DNA分子的磁珠分離；5)目標DNA的擴增富集及克隆測序；6)SNP位點鑒定。本發(fā)明的SNP標記分離新方法，可以在基因組信息未知的情況下，高效、大批量地隨機分離SNP，有利于大量SNP的開發(fā)及其后續(xù)利用，在水產(chǎn)動物SNP標記篩選、種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性評價和分子育種等方面具有重大應(yīng)用價值和推廣前景。文檔編號C12Q1/68GK101343667SQ20081013828公開日2009年1月14日申請日期2008年7月11日優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日發(fā)明者徐建勇,陳松林申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所