專利名稱：：肺炎球菌的抗原及配體管式pcr檢測試劑盒及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，尤其涉及一種肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：早期蛋白質(zhì)檢測是以抗體同特定待檢物蛋白質(zhì)的低解離常數(shù)和一定的特異性為基礎(chǔ)，采用簡易方便的篩選方法——抗體捕捉法。該法是檢測樣品中有無抗原首先將抗原包被于固相支持物，然后用抗體去結(jié)合抗原形成復(fù)合物，沖洗去掉未結(jié)合的抗體，最后用和結(jié)合抗體特異識別的標(biāo)記分子去檢測結(jié)合抗體；也可以抗原、抗體先反應(yīng)形成復(fù)合物后，再結(jié)合到固相支持物上，然后檢測復(fù)合物。許多抗體捕捉法是利用間接法來檢測抗體，如檢測抗體是鼠抗體，則檢測分子可能是帶檢測標(biāo)記的兔抗鼠抗體，所用的傳統(tǒng)檢測標(biāo)記包括放射性同位素、染料和作用于底物產(chǎn)生可檢測分子如色原的酶。酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)是廣為人知的免疫檢測法，傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)似三明治夾心法，即兩抗體共同結(jié)合到某一抗原一一捕捉抗體，將其同樣品中的抗原結(jié)合，再加入同抗原結(jié)合的偶連酶的檢測抗體，然后反應(yīng)形成捕捉抗體一抗原一檢測抗體"三明治"復(fù)合物，最后測偶連酶活性顯示檢測結(jié)果。雖然抗體檢測法具有較大的應(yīng)用價值，但是它的檢測范圍受捕捉抗體和抗原反應(yīng)的解離常數(shù)(Kd)值限制。在實(shí)踐中，檢測低限大約是Kd值的1%，當(dāng)待分析物濃度降低到這個可能檢測極限時，所捕捉到的待分析物抗體百分率將不足以產(chǎn)生相對于信噪比的可檢測信號。因此，用熒光或化學(xué)發(fā)光檢測系的抗體檢測法的檢測下限約lpg/ml(10-4M對平均分子量50，OOO道爾頓的蛋白質(zhì))。隨著基因技術(shù)應(yīng)用的快速發(fā)展，在抗原抗體檢測方面己有較多的基因檢核酸待測物的檢測要求不同于抗體檢測的技術(shù)。在二十世紀(jì)八十年代中期，DNA技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)了通過酶重復(fù)擴(kuò)增過程可擴(kuò)增DNA的方法，后來叫聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR):首先加入兩互補(bǔ)的寡核苷酸序列(叫引物)，它將結(jié)合在所要擴(kuò)增的區(qū)域的兩側(cè)，然后加熱變性，在降溫退火過程中讓引物同互補(bǔ)序列結(jié)合，再加入Klenow片段DNA聚合酶I以延伸引物，通過重復(fù)變性、退火、延伸所希望的片段，目標(biāo)DNA就會以指數(shù)方式擴(kuò)增。PCR曾經(jīng)過許多改進(jìn)，一個重要的變化是耐熱聚合酶(即Taq聚合酶)的應(yīng)用，它產(chǎn)于溫泉中嗜熱菌，具有熱穩(wěn)定性，幾乎不被PCR變性中高溫影響，所以不必像應(yīng)用不耐熱的Klenow聚合酶I，每一次變性后得補(bǔ)加聚合酶。在以PCR作為擴(kuò)增系統(tǒng)的運(yùn)用中，產(chǎn)生了免疫-PCR方法。該法是把特定待測物連接到微孔板上，然后用PCR擴(kuò)增放大能力來檢測——例如小牛血清白蛋白(BSA)被動吸附到一免疫檢測板上，加入對BSA的特異抗體(連有蛋白A鏈親和素融合蛋白及生物素標(biāo)記的報告擴(kuò)增子)，PCR后用瓊脂糖電泳分析報告擴(kuò)增子，可檢測到幾百個BSA分子，但這種方法不能實(shí)現(xiàn)定量檢測，同時因?yàn)槿狈Υ郎y物的特異捕捉分子，也不能用于生物樣品檢測。為此，人們不斷對其進(jìn)行改進(jìn)首先用生物素化第二抗體和一個連接生物素化報告擴(kuò)增子的鏈親和素融合蛋白，然而5種試劑的加入、洗板、擴(kuò)增、檢測很費(fèi)時費(fèi)力，而且解離復(fù)雜；隨后又把報告擴(kuò)增子共價連到第二抗體上，雖然直接連接減少了試劑數(shù)目和解離復(fù)雜性，但仍需要PCR操作，勞動強(qiáng)度和試驗(yàn)室污染的可能性還是無法降低。三明治式免疫-PCR是由傳統(tǒng)ELISA方式的改編而來，即檢測抗體連有DNA標(biāo)記，再運(yùn)用到分析檢測生物樣品。早期的抗體免疫-PCR檢測形式是將初級抗體固定在平板上，然后依次加入樣品，再用生物素化檢測抗體，鏈親和素和生物素化的DNA;后來改進(jìn)為直接連接DNA到抗體上和用標(biāo)記引物產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，而PCR的擴(kuò)增能力可產(chǎn)生大量DNA標(biāo)記，這種DNA標(biāo)記可用典型的凝膠電泳檢測分析。PCR擴(kuò)增抗體攜帶的DNA標(biāo)記可提高對抗原檢測的靈敏度(該法缺少用基因芯片法來檢測)，比傳統(tǒng)ELISA方法的靈敏度還高，但用凝膠電泳純化擴(kuò)增產(chǎn)物需要大量人工操作，因此耗時；而且用于PCR擴(kuò)增的引物在退火時可引起二聚體擴(kuò)增產(chǎn)生副產(chǎn)品；同時它還存在污染核糖或污染也將同樣被擴(kuò)增的情況。免疫PCR方法是采用一個捕捉抗體，類似于直接ELISA三明治夾心法，不同點(diǎn)在于選擇檢測方法。該方法己被成功用于檢測腫瘤壞死因子、P-半乳糖甘酶、人甲狀腺刺激激素、鼠可溶T-細(xì)胞受體、重組乙肝表面抗原、不同6的人心鈉素、e-葡糖苷激酶、絨毛膜促性腺激素等物質(zhì)，有的敏感度達(dá)10—15摩爾水平。在免疫PCR方法中，抗原濃度通常由PCR后產(chǎn)物分析決定，可以是凝膠電泳分析，也可以是PCR-ELISA分析。定量分析PCR終點(diǎn)產(chǎn)物的DNA標(biāo)記易產(chǎn)生錯誤結(jié)果，因?yàn)楫a(chǎn)物形成率在幾個對數(shù)增長循環(huán)后即下降，再者PCR樣品處理可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室污染；另外，這些實(shí)驗(yàn)由于步驟多且需沖洗，因此在這個過程中抗原抗體復(fù)合物可能會出現(xiàn)解離。實(shí)時定量PCR是更先進(jìn)的PCR技術(shù)，已用于核酸分析。在實(shí)時PCR中，PCR擴(kuò)增DNA是在非線性標(biāo)記、雙熒光雜交探針存在條件下進(jìn)行，其中一種熒光染料用作報告分子，它的發(fā)射光譜被第二種熒光染料淬滅;該實(shí)時PCR在鏈延伸時，報告染料位于雜交探針5'端(FAM)，淬滅染料位于3'端(TAMRA)，此探針和PCR擴(kuò)增的特殊耙序列結(jié)合，當(dāng)未結(jié)合時，5'端FAM發(fā)射的熒光被3'TAMRA淬滅，但隨著PCR循環(huán)增加，擴(kuò)增子增多，雜交探針被Taq多聚酶5'-3'核酸活性切割，結(jié)果使報告熒光染料從淬滅染料中釋放出來，致報告分子發(fā)射峰值增加。序列檢測系統(tǒng)用氬原子激光激活熒光(488nm)，激光裝置照相機(jī)監(jiān)控PCR反應(yīng)，收集從所有96孔發(fā)出的500nm-660nm熒光，然后利用相應(yīng)原理、設(shè)立內(nèi)參照，直接通過一定的軟件分析定量。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)整個反應(yīng)實(shí)時監(jiān)控，同時也可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-PCR。由于序列檢測系統(tǒng)用96孔熱循環(huán)儀可連續(xù)檢測每孔中PCR反應(yīng)時的熒光譜，因此，可排除復(fù)制子試驗(yàn)室污染。Gold等在1995年(GoldL，etal.A腿RevBiochem(生物化學(xué)年報)，64:763-797)應(yīng)用SELEX篩選出的系統(tǒng)性紅斑狼瘡特異抗體的RNA和ssDNA配基，不僅對系統(tǒng)性紅斑狼瘡進(jìn)行診斷，而且可以進(jìn)行病情監(jiān)測和療效檢驗(yàn)；Gold等又在1999年(GoldL，etal.DiagnDec(診斷);4(4):381-8)在配基微陣分子診斷應(yīng)用研究中，對配基微陣分辨率進(jìn)行了研究。上述研究均顯示出核酸配基檢測具有巨大的應(yīng)用前景，但是目前的配基檢測都是采用直接對配基PCR擴(kuò)增放大檢測，這種檢測操作復(fù)雜，不但需要將配體和配基分離，而且由于配體和配基分離后，配基純度及殘留配體和配基的再結(jié)合可以阻斷DNA復(fù)制，因此導(dǎo)致檢測靈敏度低和準(zhǔn)確性差。核酸與蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)相互作用是普遍現(xiàn)象，核酸能折疊形成二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，這對其與蛋白質(zhì)相互結(jié)合作用非常重要，通過使核苷酸序列多樣化而使體外檢測核酸蛋白質(zhì)相互作用方法成熟。指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,SELEX)被用來分離所選靶目標(biāo)的核苷酸配體，這些配體被稱為配基或適配體，意即核酸可以形成一定結(jié)構(gòu)并適配入靶分子的口袋，SELEX技術(shù)就是利用該原理篩選耙分子配基的方法。利用SELEX技術(shù)，許多靶標(biāo)的核苷酸配基已被篩選出，尤其是已知能和核酸結(jié)合的許多蛋白質(zhì)可作為SELEX技術(shù)的較合適靶標(biāo)，如T4DNA聚合酶、噬菌體R17被膜蛋白、大腸桿菌rho因子、大腸桿菌核糖體蛋白Sl、苯丙氨酸-tRNA合成酶、識別RNA的自身免疫抗體、E2F轉(zhuǎn)錄因子及不同的肺炎球菌相關(guān)蛋白。SELEX技術(shù)可篩選出許多不同蛋白配基的事實(shí)引發(fā)了配基應(yīng)用的拓展，這些配基可作為單抗和多抗產(chǎn)品的替代品應(yīng)用于診斷和治療，如DNA聚合酶的配基已被用于熱啟動PCR來診斷低拷貝的復(fù)制子，提高PCR敏感性和保真性；同時配基也被用于促進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，如中性彈性蛋白的酶配體熒光標(biāo)記用于流式細(xì)胞儀檢測彈性酶濃度，中性彈性蛋白酶配基用于鼠肺炎癥診斷模型體內(nèi)診斷。在酶聯(lián)寡核苷酸方法中，一個或多個抗體被對抗原有高親和力、高特異性的配基取代，這樣的配基可通過SELEX技術(shù)體外篩選獲得。美國專利WO96/40991和WD97/38134中描述了酶聯(lián)寡核苷酸方法，其中用核苷酸配基代替夾心法中的檢測抗體或捕捉抗體；同時也提到捕捉分子-靶分子-檢測分子復(fù)合物中核酸配基PCR擴(kuò)增檢測系統(tǒng)。該方法利用常用報告分子如酶、生物素等的PCR引物來擴(kuò)增擴(kuò)增子，這樣在提高配體數(shù)量的同時，還需要進(jìn)一步增加把擴(kuò)增的配基和不純的核苷酸引物二聚體分離的步驟。DNA和RNA配基也存在著這樣的問題。另外，夾心法用傳統(tǒng)的酶聯(lián)檢測抗體檢測捕捉分子-抗原復(fù)合物，然后用報告酶分子標(biāo)記寡核苷酸，這需要化學(xué)合成步驟和額外的勞動，同時用來標(biāo)記的引物不能解決不純問題和引物二聚體擴(kuò)增問題，因此，無法解決定量檢測的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高靈敏度、快速、可定量檢測的肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種簡便易行的肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒的制備方法。本發(fā)明還要解決的一個技術(shù)問題是提供肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒在檢測獲得性人類免疫缺陷病肺炎球菌的特異寡核苷酸配體中的應(yīng)用。為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒，包括一PCR管為聚苯乙烯材料制成的普通PCR管，其上包被捕捉獲得性人類免疫缺陷病肺炎球菌靶分子的抗體或配基；一檢測試劑A液和B液，用于獲得性人類免疫缺陷病肺炎球菌配體/抗原一陰性和陽性對照樣品。一種用于如上所述的肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒的A液，其特征在于它由100ul、pH值為7.4的25pmol/ul帶有人為序列修飾的檢測配基和2ug/ml抗體的磷酸鹽緩沖液組成。所述人為序列修飾的檢測配基是指人為在配基的3'和5'端分別或同時加上己知序列的單鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)和兩條互補(bǔ)雙鏈。一種用于如上所述的肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒的B液，其特征在于它由lul上游引物、lul下游引物、8ul4XdNTP、lOullOXPCR緩沖液、25單位的耐熱DNA聚合酶和水組成；其中上游引物序列為1:5，-TCTAACGTGAATGATAG-3，；下游引物序列為2:5，-TATGGTCGAATAAGTTAA-3'。該B液還含有分子信標(biāo)。所述的分子信標(biāo)是修飾序列的莖環(huán)分子信標(biāo)、SYBRGreen1熒光染料及帶有熒光分子和淬滅分子的探針分子信標(biāo)中的任意一種。一種制備如上所述的肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒的方法，包括以下步驟(1)在37土rC下、用體積濃度為120。/。的戊二醛處理PCR管，使戊二醛附著在PCR管；(2)用超純水清洗PCR管；(3)將捕捉肺炎球菌靶分子的配基/抗體包被在PCR管上；(4)用pH值為7.4的含5。/。的脫脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龜精DNA的碳酸氫鈉緩沖液封閉PCR管，經(jīng)干燥得PCR管；(5)配制檢測試劑A液將檢測肺炎球菌的抗體和經(jīng)序列修飾的抗體特異寡核苷酸配基在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中孵育并通過紫外線交聯(lián)，或用磷酸鹽緩沖液溶解配基即可；(6)配制檢測試劑B液將B液各組分混合后加水即得；(7)將干燥后的PCR管、檢測試劑A液和B液與標(biāo)準(zhǔn)檢測樣品、陰性和陽性對照樣品組裝，放入試劑盒即可。所述步驟(3)中的配基包被在PCR管上是指先將鏈酶親和素包被在PCR管上，再加入帶有生物素的配體捕捉配基，通過鏈酶親和素和生物素的結(jié)合，使捕捉配基固著在PCR管上。所述步驟(3)中的抗體包被在PCR管上是指將單克隆抗體用pH值為9.6的碳酸氫鈉緩沖液包被在PCR管上。一種如上所述的肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒在檢測獲得性人類免疫缺陷病肺炎球菌的特異寡核苷酸配體中的應(yīng)用，包括以下步驟①設(shè)置陰性和和陽性標(biāo)準(zhǔn)曲線；②待測樣品的制備；③在PCR管中加入待測樣品和陰陽對照樣品，在37土rC孵育45-120分鐘；④將步驟③中孵育后的PCR管用洗液沖洗；在PCR管中加入A液，在37±rC孵育45-120分鐘；⑥將步驟⑤中孵育后的PCR管用洗液沖洗；⑦在PCR管中加入B液后再加入標(biāo)準(zhǔn)品，采用實(shí)時定量-PCR檢測，并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。.所述步驟④和⑥中的洗液是指pH值為7.4、含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。所述步驟⑦中的實(shí)時定量-PCR檢測的標(biāo)記物選自化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、酶、熒光和同位素中的一種或多種。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、由于本發(fā)明利用聚苯乙烯制成的PCR管經(jīng)戊二醛處理后，可附著核酸配體(或抗原、抗體及配基等)，通過特異寡核苷酸配基(或攜帶信號分子的特異寡核苷酸配基)與配體直接結(jié)合，將配體信號轉(zhuǎn)換成核酸配基信號，然后經(jīng)PCR(或滾環(huán)復(fù)制)擴(kuò)增放大、檢測，來測定配體，因此其檢測配體具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、多配體微陣檢測和可機(jī)械化完成的特點(diǎn)。2、由于本發(fā)明是利用連接在抗體或配基上的人為修飾DNA或RNA序列作為信號分子，該修飾DNA或RNA序列具有一對引物和中間的人為標(biāo)記序列，針對被檢測的靶分子和檢測目的的要求這一對引物可以相同也可以不相同，中間的標(biāo)記序列是靶分子的標(biāo)記，因此通過對信號修飾序列的PCR擴(kuò)增，可以實(shí)現(xiàn)對抗原或配體的檢測。3、由于本發(fā)明在使用過程中是通過采用實(shí)時定量-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測或寡核苷酸芯片檢測來進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理的，同時通過對DNA或RNA修飾序列的變換來達(dá)到數(shù)據(jù)的效正，因此可有效進(jìn)行單一樣品或多種樣品的檢測。4、由于本發(fā)明在使用過程中所進(jìn)行的數(shù)據(jù)采集和處理都在PCR管內(nèi)一次性完成，無須將產(chǎn)物轉(zhuǎn)換地方，進(jìn)行提純、檢測等步驟，并且PCR產(chǎn)物可在PCR管內(nèi)封閉銷毀，因此操作過程簡單、安全、可有效避免逸出產(chǎn)物所造成的環(huán)境污染。5、本發(fā)明由于在反應(yīng)時只需將配體和配基室溫孵育45分鐘就能完成配體和配基的結(jié)合反應(yīng)，因此操作簡便，便于一般實(shí)驗(yàn)室或臨床檢驗(yàn)科室的普及應(yīng)用。6、由于本發(fā)明組裝的檢測試劑盒或構(gòu)建的生物芯片可以廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究與臨床檢測，因此具有一定的經(jīng)濟(jì)效益與社會效益。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1為本發(fā)明的小鼠IgG-Fc片段的配基特異寡核苷酸配基序列。圖2為本發(fā)明的新型免疫-PCR檢測流程。圖2a為本發(fā)明的抗體IgG的Fc片段特異寡核苷酸修飾配基。圖2b為本發(fā)明的抗體IgG的Fc片段特異寡核苷酸修飾配基PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，熒光信號分子5'熒光分子-TTTTTTTTTT-熒光淬滅分子3'序列。圖3為本發(fā)明的配基檢測流程。圖3a為本發(fā)明的5'生物素化的捕捉配基序列。圖3b為本發(fā)明的修飾的檢測配基序列。圖3C為本發(fā)明的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，熒光信號分子5'熒光分子(激發(fā)光源波長470nm，檢測光源波長510nm)-TTTTTTTTTT-熒光淬滅分子3'序列。圖4為本發(fā)明的實(shí)時定量-PCR原理圖。圖5為本實(shí)施例1的實(shí)時定量PCR檢測曲線。圖6為本實(shí)施例1的樣品檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為本實(shí)施例2的實(shí)時定量PCR檢測曲線。圖8為本實(shí)施例2的樣品檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施例方式一種肺炎球菌的抗原及配體PCR管式檢測試劑盒，包括其上包被捕捉肺炎球菌靶分子的抗體或配基的檢測PCR管;用于肺炎球菌配體/抗原檢測的檢測試劑A液和B液；標(biāo)準(zhǔn)品和對照品。其中A液由帶有人為序列修飾的配基/抗體和磷酸鹽緩沖溶液組成；B液包括上游引物、下游引物、4XdNTP、IOXPCR緩沖液和耐熱DNA聚合酶；上游引物序列為l:5，-TCTAACGTGAATGATAG-3'下游引物序列為2:5，-TATGGTCGAATAAGTTAA-3'標(biāo)準(zhǔn)檢測樣品、陰性和陽性對照樣品為國家認(rèn)定的已知滴度為103~108拷貝/ul的檢測樣品。標(biāo)準(zhǔn)檢測樣品序列為TTCGACCATA-3'在B液中還可以加入莖環(huán)分子信標(biāo)、SYBRGreen1nucleicacidstain及帶有熒光分子和淬滅分子的探針分子信標(biāo)中任意一種的分子信標(biāo)。在本實(shí)施例中選用了熒光分子信標(biāo)，其序列為5'熒光分子-TTTTTTTTTT-熒光淬滅分子3'。為便于理解，本發(fā)明選用小鼠IgG-Fc片段的特異寡核苷酸配基序列(參見圖1)進(jìn)行具體實(shí)施例的描述，該序列是通過SELEX技術(shù)針對配體篩選出的一段20-40個堿基的寡核苷酸片段，再經(jīng)人為增加修飾序列后，使其變成可攜帶大量信息的配基序列用于多種配體同時檢測的示意圖。人為序列可以分別加在5，端、3，端或在5'端和3'端同時加上，長度可以多樣，其中PCR所用引物為寡核苷酸配基兩端人為添加序列的互補(bǔ)序列。實(shí)施例l:新型免疫-PCR檢測新型PCR檢測流程(參見圖2)是指將PCR管處理后，首先包被一抗體，然后與檢測樣品共同孵育，形成一抗體-抗原復(fù)合物；再經(jīng)清洗后，加入經(jīng)配基標(biāo)記的檢測抗體，共同孵育后洗去未結(jié)合的檢測抗體，最后針對配基修飾序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和處理。其具體步驟如下1、PCR管的制備將0.2ml聚苯乙烯PCR管用50ul、體積濃度為120%的戊二醛在37士1。C下處理13小時；用超純水、每次2~5分鐘沖洗PCR管三次；用pH值為9.6的碳酸氫鈉緩沖液將捕捉肺炎球菌抗原的單克隆抗體2ug/ml包被在PCR管上，然后將該P(yáng)CR管用100ul、pH值為7.4的含5%脫脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龜精DNA的碳酸氫鈉緩沖液在37士rC下處理13小時，使PCR管封閉，干燥后待用。2、抗體試劑A液的制備將檢測肺炎球菌的小鼠IgG抗體2ug/ml和經(jīng)序列修飾的小鼠IgG抗體Fc特異寡核苷酸配基25pmol/ul(參見圖2a:檢測配基由兩部分組成，第一部分ATCTGCGCGCTCCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3，為小鼠IgG抗體FC特異寡核苷酸配基；第二部分雙鏈TTCGACCATA-3，為配基修飾序列，其中5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'為標(biāo)志序列)，在100ul、pH值為7.4的1XPBS(138mMNaCl，2.7mMKCl，8.1mMNa2HP04，l.lmMKH2P04，lmMMgCl2)中共同孵育60~120分鐘，并通過308納米波長、12焦耳、1分鐘的紫外線交聯(lián)，使抗體和配基形成更穩(wěn)定的復(fù)合物。3、PCR檢測試劑B液的制備將含修飾序列的上游引物和下游引物各(25pmol/ul)lul、4XdNTP8ul、10XPCR緩沖液10ul(含Mg2+)和25單位的TaqDNA聚合酶(臨用前加入)混合后加水至100ul(可根據(jù)檢測儀即得。其中IOXPCR緩沖液是由pH值為8.3的50mmol氯化鉀、15mmol氯化鎂、10mmol的Tris-HCl和質(zhì)量濃度為0.1%的明膠組成的混合物；4XdNTP是由每種2.5mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP組成的混合物。以下為應(yīng)用具體操作步驟每次檢測均應(yīng)根據(jù)陰性、陽性對照樣品按100pg，10pg，lpg，0.1pg，0.01pg，O.OOlpg設(shè)置陰性和和陽性標(biāo)準(zhǔn)曲線。(1)從試劑盒中取出檢測PCR管放入檢測架上，將在56。C下滅活60分鐘的人血清樣品100ul，及陰陽對照樣品放入普通微量離心機(jī)中，以4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10分鐘后，分別取被檢測人血清和陰陽對照樣品血清各50ul加入檢測PCR管中，在37士rC下孵育45120分鐘。(2)用洗液沖洗PCR管3次，3分鐘/次；其中洗液為pH值為7.4、含0.05%吐溫-20(Tween-20)的磷酸鹽緩沖液(PBS)。(3)在PCR管中加入A液60ul，在37±rC下孵育45~120分鐘。(4)用步驟(2)中的洗液沖洗PCR管3次，3分鐘/次。(5)在PCR管中加入B液60ul后，同時再加入4個制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用Rotor-GeneRG3000實(shí)行實(shí)時定量-PCR擴(kuò)增，共35個循環(huán)(參見圖4、圖5)，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理并打印檢測報告。其中擴(kuò)增條件為預(yù)變性95"C、5分鐘；變性94'C、30秒；復(fù)性55°C、30秒；延伸72'C、30秒；終延伸72'C、5分鐘。實(shí)時定量-PCR檢測的標(biāo)記物選自化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、酶、熒光和同位素中的一種或多種。圖4為本發(fā)明的實(shí)時定量-PCR原理圖。圖5為本實(shí)施例的實(shí)時定量PCR檢測曲線，該曲線橫坐標(biāo)是PCR的循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是PCR產(chǎn)物熒光檢測對數(shù)值。通過該曲線可計(jì)算出每個模板的Ct值，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，利用己知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到對未知模板進(jìn)行定量分析。圖6為本實(shí)施例的樣品檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線橫坐標(biāo)是配基修飾序列模板的拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)是Ct值。利用標(biāo)準(zhǔn)品的己知起始拷貝數(shù)和Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個未知模板的Ct值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知模板的起始拷貝數(shù)，從而計(jì)算出檢測配體或抗原的含量。檢測結(jié)果如下表:編號彩線名稱類型Ct預(yù)定拷貝(copies/ul)檢測拷貝(c叩ies/ul)1■標(biāo)準(zhǔn)品1St3ndsrd17.9850,000,000.0000000051,615,165.78285460<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例2:配基檢測配基檢測流程(參見圖3)是指將PCR管處理后，首先包被識別配體的配基，然后與檢測樣品共同孵育，形成配體-配基復(fù)合物；再經(jīng)清洗后，加入經(jīng)修飾序列標(biāo)記的識別檢測配體的不同配基，共同孵育后洗去未結(jié)合的檢測配基，最后針對配基修飾序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和處理。其具體步驟如下1、PCR管的制備將0.2ml聚苯乙烯PCR管用50ul、1~20%戊二醛在37士rC處理13小時；用超純水、每次25分鐘清洗PCR管三次；將50ul鏈菌親和素(streptavidin)包被在PCR管上后，用60ul、pH值為7.4的含5%脫脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龜精DNA的碳酸氫鈉緩沖液在37。C處理2小時封閉，干燥后待用；然后用300ul、pH值為7.4碳酸氫鈉緩沖液漂洗三次，每次3分鐘；再加入25pmol/ul的50ul捕捉肺炎球菌配體的含生物素配基(biotin，B，其序列為生物素-5，AGGCATGTTTCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA畫3，)(參見圖3a)，在37士rC孵育1小時后用300ul、pH值為7.4的碳酸氫鈉緩沖液漂洗三次，每次3分鐘，干燥后待用。2、抗體試劑A液的制備、PCR檢測試劑B液的制備及具體應(yīng)用均同實(shí)施例l。其中圖7為本實(shí)施例的實(shí)時定量PCR檢測曲線；圖8為本實(shí)施例的樣品檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求1、一種肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒，包括—PCR管為聚苯乙烯材料制成的普通PCR管，其上包被捕捉獲得性人類免疫缺陷病肺炎球菌靶分子的抗體或配基；—檢測試劑A液和B液，用于獲得性人類免疫缺陷病肺炎球菌配體/抗原檢測；—標(biāo)準(zhǔn)檢測樣品；—陰性和陽性對照樣品。2、一種用于如權(quán)利要求1所述的肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒的A液，其特征在于它由IOOul、pH值為7.4的25pmol/ul帶有人為序列修飾的檢測配基和2ug/ml抗體的磷酸鹽緩沖液組成。3、如權(quán)利要求2所述的一種用于肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒的A液，其特征在于所述人為序列修飾的檢測配基是指人為在配基的3'和5'端分別或同時加上已知序列的單鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)和兩條互補(bǔ)雙鏈。4、一種用于如權(quán)利要求1所述的肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒的B液，其特征在于它由lul上游引物、lul下游引物、8ul4XdNTP、10ulIOXPCR緩沖液、25單位的耐熱DNA聚合酶和水組成；其中上游引物序列為1:5，-TCTAACGTGAATGATAG-37;下游引物序列為2:5，-TATGGTCGAATAAGTTAA-3，。5、如權(quán)利要求4所述的一種用于肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒的B液，其特征在于該B液還含有分子信標(biāo)。6、如權(quán)利要求5所述的一種用于肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒的B液，其特征在于所述的分子信標(biāo)是修飾序列的莖環(huán)分子信標(biāo)、SYBRGreen1熒光染料及帶有熒光分子和淬滅分子的探針分子信標(biāo)中的任意一種。7、一種制備如權(quán)利要求1所述的肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒的方法，包括以下步驟(1)在37土rC下、用體積濃度為120。/。的戊二醛處理PCR管，使戊二醛附著在PCR管；(2)用超純水清洗PCR管；(3)將捕捉肺炎球菌靶分子的配基/抗體包被在PCR管上；(4)用pH值為7.4的含5。/。的脫脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龜精DNA的碳酸氫鈉緩沖液封閉PCR管，經(jīng)干燥得PCR管；(5)配制檢測試劑A液將檢測肺炎球菌的抗體和經(jīng)序列修飾的抗體特異寡核苷酸配基在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中孵育并通過紫外線交聯(lián)，或用磷酸鹽緩沖液溶解配基即可；(6)配制檢測試劑B液將B液各組分混合后加水即得；(7)將干燥后的PCR管、檢測試劑A液和B液與標(biāo)準(zhǔn)檢測樣品、陰性和陽性對照樣品組裝，放入試劑盒即可。8、如權(quán)利要求7所述的制備肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒的方法，其特征在于所述步驟(3)中的配基包被在PCR管上是指先將鏈酶親和素包被在PCR管上，再加入帶有生物素的配體捕捉配基，通過鏈酶親和素和生物素的結(jié)合，使捕捉配基固著在PCR管上。9、如權(quán)利要求7所述的制備肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒的方法，其特征在于所述步驟(3)中的抗體包被在PCR管上是指將單克隆抗體用pH值為9.6的碳酸氫鈉緩沖液包被在PCR管上。10、一種如權(quán)利要求1所述的肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒在檢測獲得性人類免疫缺陷病肺炎球菌的特異寡核苷酸配體中的應(yīng)用，包括以下步驟①設(shè)置陰性和和陽性標(biāo)準(zhǔn)曲線；②待測樣品的制備；③在PCR管中加入待測樣品和陰陽對照樣品，在37土rC孵育45~120分鐘；④將步驟③中孵育后的PCR管用洗液沖洗；⑤在PCR管中加入A液，在37±rC孵育45~120分鐘；⑥將步驟(D中孵育后的PCR管用洗液沖洗；⑦在PCR管中加入B液后再加入標(biāo)準(zhǔn)品，采用實(shí)時定量-PCR檢測，并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。11、如權(quán)利要求10所述的肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒在檢測獲得性人類免疫缺陷病肺炎球菌的特異寡核苷酸配體中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟④和⑥中的洗液是指pH值為7.4、含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。12、如權(quán)利要求10所述的肺炎球菌的抗原及配體管式PCR檢測試劑盒在檢測獲得性人類免疫缺陷病肺炎球菌的特異寡核苷酸配體中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟⑦中的實(shí)時定量-PCR檢測的標(biāo)記物選自化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、酶、熒光和同位素中的一種或多種。全文摘要本發(fā)明涉及一種肺炎球菌的抗原及配體PCR管式檢測試劑盒，該試劑盒包括包被捕捉獲得性人類免疫缺陷病肺炎球菌靶分子的抗體或配基的PCR管、用于獲得性人類免疫缺陷病肺炎球菌配體/抗原檢測的檢測試劑A液和B液、標(biāo)準(zhǔn)品和對照品。本發(fā)明通過特異寡核苷酸配基(或攜帶信號分子的特異寡核苷酸配基)與配體直接結(jié)合，將配體信號轉(zhuǎn)換成核酸配基信號，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增放大、檢測，來測定配體，因此其檢測配體具有快速、靈敏度高、可定量檢測的特點(diǎn)。同時本發(fā)明還公開了該試劑盒的制備方法和在檢測獲得性人類免疫缺陷病肺炎球菌的特異寡核苷酸配體中的應(yīng)用方法。文檔編號C12Q1/68GK101429547SQ200810177278公開日2009年5月13日申請日期2008年12月2日優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日發(fā)明者廖世奇申請人:蘭州普利生物技術(shù)開發(fā)有限公司