專利名稱：釀酒酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)還原性谷胱甘肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及谷胱甘肽的高密度發(fā)酵生產(chǎn)法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽(GSH)，即Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由三 個(gè)氨基酸組成的小肽，通常所說的谷胱甘肽是指還原型谷胱甘肽，其在生物體 內(nèi)起重要作用。谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)存在的最豐富的小分子硫醇類化合物，是保 護(hù)酶和其他蛋白質(zhì)的硫氫基的一種抗氧化劑，是細(xì)胞內(nèi)非蛋白硫氫基團(tuán)的主要 組成部分，參與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，是某些酶的輔酶，并對(duì)一些巰基酶有 激活作用。越來越多的臨床科學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，人體內(nèi)的谷胱甘肽增加后，對(duì)消化 系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和新陳代謝等等都有幫助。美國(guó)著名的醫(yī)學(xué)專家古特曼博士這 樣預(yù)測(cè)"谷胱甘肽很快就會(huì)像膽固醇一樣，成為人們衡量健康的指標(biāo)之一 ！"。 由于谷胱甘肽在細(xì)胞內(nèi)的重要作用，谷胱甘肽在醫(yī)藥領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用早已得 到公認(rèn)，其在食品添加劑、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)、保健品和化妝品上的應(yīng)用也越來越廣 泛。
谷胱甘肽的生產(chǎn)方法主要有萃取法、化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法。自 1938年發(fā)表的GSH制備的最早專利以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞GSH的生產(chǎn)開展了大 量的研究。概括來說，萃取法主要是通過萃取和沉淀的方法從含有GSH的動(dòng)植 物組織中進(jìn)行GSH的分離提取，由于原料不易獲得且GSH的含量極低，因此該 法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)GSH，即將L一谷氨酸、L一半胱氨酸 和甘氨酸縮合成GSH。該法較早用于GSH生產(chǎn)，但操作過程復(fù)雜、耗時(shí)且得到的 GSH是左旋體和右旋體的混合物，分離十分困難，造成產(chǎn)品純度不高，且生物效 價(jià)很難保持一致。GSH的酶法合成是利用GSH合成酶系，在三磷酸腺苷(ATP)的 存在下將三種組成氨基酸催化形成GSH。該法首先需要獲得GSH合成的相關(guān)酶系， 其次需要加入價(jià)格昂貴的前體氨基酸和ATP，目前還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段(國(guó)家專利申請(qǐng)?zhí)?3113418. 1)。綜合比較，發(fā)酵法生產(chǎn)GSH最具競(jìng)爭(zhēng)力，是當(dāng)前世 界上主要的生產(chǎn)方法，并且由于避免了昂貴的ATP消耗，比較經(jīng)濟(jì)實(shí)用(詹谷 宇等.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1990; 25 (7) .494-499)。由于微生物容易培養(yǎng)，肉此該法將 具有極大的應(yīng)用潛力。國(guó)外谷胱甘肽的主要產(chǎn)地在口本，應(yīng)用的是微生物發(fā)酵 法生產(chǎn)谷胱甘肽(詹谷宇等，酵母菌生物合成谷胱甘肽，藥學(xué)學(xué)報(bào)，1990; 25(7)) 國(guó)內(nèi)谷胱甘肽的研究起步較晚，現(xiàn)在主要還是在一些研究院校內(nèi)，處于研究階 段，沒有形成一定的生產(chǎn)規(guī)模(李寅，陳堅(jiān)等.氨基酸和酵母膏對(duì)谷胱甘肽發(fā) 酵的影響，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1998; 29(12): 537—542.)。饒志明等(饒 志明等.產(chǎn)谷胱甘肽重組巴斯德畢赤氏酵母發(fā)酵條件的研究.食品與發(fā)酵工業(yè)， 2007， 33(5) :l-3)研究利用重組巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)x-33 (pGAPZA-gshl)生產(chǎn)谷胱甘肽其產(chǎn)量只有97. 9mg / L，此法利用搖瓶在試驗(yàn)室進(jìn) 行且產(chǎn)量過低，在實(shí)際生產(chǎn)中無意義。董一群等(董一群等.補(bǔ)料方式對(duì)酵母菌 生產(chǎn)谷胱甘肽的影響.工業(yè)微生物，2003， 33 (1): 19-21)研究了分批發(fā)酵及 恒速流加、指數(shù)流加和恒pH流加補(bǔ)料方法。其結(jié)果為分批補(bǔ)料中GSH含量 323. 39mg/L;恒速流加巾GSH含量為638. 2 mg/L;指數(shù)流加中GSH含量為678. 9 mg/L;而恒pH流加補(bǔ)料中GSH含量為977.8mg/L。該試驗(yàn)中明顯GSH含量較高 且采用恒pH流加補(bǔ)料其工藝過程易于控制有利于生產(chǎn)，但是其發(fā)酵周期為60 小時(shí)，同時(shí)GSH含量沒有顯著提高。王崢，譚天偉等(王崢，譚天偉等.谷胱甘 肽發(fā)酵過程中的乙醇控制.生物加工過程，2004， 5 (2): 64-67)研究在釀酒酵 母谷胱甘肽發(fā)酵中，比較了乙醇控制在一定濃度和逐步卜降兩種乙醇控制方式 對(duì)谷胱甘肽合成的影響，其結(jié)果為后者較好。該研究中GSH含量較高達(dá)到 1620mg/L，而此法只有當(dāng)乙醇形成后并達(dá)到一定的檢測(cè)濃度時(shí)才可以進(jìn)行控制， 雖有一定的指導(dǎo)意義但很有限。在國(guó)家專利(專利申請(qǐng)?zhí)?00510023119. 1)"谷 胱甘肽的生產(chǎn)方法"中指出將帶有谷胱甘肽合成酶A和酶B的兩種表達(dá)重組基因的基因工程大腸桿菌經(jīng)大規(guī)模培養(yǎng)和大規(guī)模分離純化技術(shù)，獲得酶A和酶B， 并將它們分別用合適的材料固定。該方法中存在以下幾個(gè)不利因素(1)基因 工程菌因其穩(wěn)定性差不適合規(guī)模生產(chǎn)；(2)大腸桿菌的培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，在丁業(yè)
化生產(chǎn)中容易染菌并延長(zhǎng)了生產(chǎn)周期；(3)酶A和酶B的分離純化也存在難度; (4)用合適的材料固定也使得生產(chǎn)工藝復(fù)雜化。國(guó)家專利(申請(qǐng)?zhí)?3113418. 1) "一種提高產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽產(chǎn)量的方法"中指出采用產(chǎn)朊假絲 酵母(Candidautilis) WSH02-08為出發(fā)菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種 在搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)，在發(fā)酵液中添加L-半胱氨酸，添加時(shí)間0-20小時(shí)， 添加濃度6-1O腿ol/L。該方法所得最后產(chǎn)量為400mg/L-520mg/L。該方法雖然 時(shí)間短工藝簡(jiǎn)單，但最后目標(biāo)產(chǎn)量卻較低，仍很難用于生產(chǎn)。國(guó)家專利(申請(qǐng) 號(hào)200510059998. 3)"酵母發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)麥角固醇和谷胱甘肽的方法"中利用同一種 酵母發(fā)酵菌種發(fā)酵同時(shí)生產(chǎn)兩種代謝產(chǎn)物-麥角固醇和谷胱甘肽。該方法在生產(chǎn) 谷胱甘肽的情況下又得到了麥角固醇，做到了產(chǎn)業(yè)鏈的良好延伸，谷胱甘肽產(chǎn) 量930mg/L-1561mg/L，但從GSH的產(chǎn)量來看結(jié)果仍不理想，并且乙醇含量的控
制仍然存在滯后的問題
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種工藝設(shè)計(jì)更合理、且能夠提高谷胱甘 肽產(chǎn)量的釀酒酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)還原性谷胱甘肽的方法。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為
一種釀酒酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)還原性谷胱甘肽的方法，包括以下歩驟
a. 將斜面釀酒酵母菌種接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，在28 32"C溫度條件下， 震蕩培養(yǎng)10 15小時(shí)，震蕩頻率為100 300rpm;
b. 將震蕩培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在 溫度為28 32。C、初始攪拌轉(zhuǎn)速為50 150rpm、通風(fēng)比為0. 5 1. 5VVM條件下 培養(yǎng)6 12小時(shí)，當(dāng)溶解氧低于20% 30%時(shí)，提高攪拌轉(zhuǎn)速50 100rpm，使溶解氧保持在20% 30%以上；
c.按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%接入步驟b中的種子培養(yǎng)液，在溫度為28 32 。C、初始攪拌轉(zhuǎn)速為50 150rpm,之后每過2 4h增加50 150rpm直到升至 500rpm，初始通氣量為0. 5 1VVM，當(dāng)轉(zhuǎn)速升至500rpm 2 4h后增加至1. 5 2VVM，在此條件下培養(yǎng)10 14h后，開始按2 6g/l.h均速加入流加培養(yǎng)基， 流加培養(yǎng)基的滅菌參數(shù)為100 110°C， 10 20分鐘；
當(dāng)呼吸商RQ值大于0.85時(shí)，要僅以RQ為補(bǔ)料依據(jù)，立即降低流加補(bǔ)料速 率至原流加補(bǔ)料速率的10% 80%，當(dāng)RQ小于等于0. 85時(shí)，每過1 2小時(shí)流速 增加10% 50%，同時(shí)再以尿素或氨水控制發(fā)酵液的pH值在4. 5 5. 5之間，至 28 36h向發(fā)酵液中分別添加2 6mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸， 并同時(shí)開始降溫1 6"，且同時(shí)降低流加培養(yǎng)基補(bǔ)料速度的10% 50%，經(jīng)過36 48h發(fā)酵停止發(fā)酵，此時(shí)酵母的生物量干重達(dá)到98 128g/L， GSH總量穩(wěn)定在 1800mg/L 2470mg/L。
上述步驟a中的搖瓶種子培養(yǎng)基，其配方為葡萄糖20 50g/l;酵母粉3 10g/l; (NH4)2HP04 l 6g/l; MgS04 7H20 0 . 5 1. 5g/l; K2HP04 0. 5 2g/l; KH2P04 0. 5 2g/l。
上述步驟b中的發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方為葡萄糖40 70g/l;酵母粉10 30 g/1;麥芽汁40 80 g/1; ( 04 5 16 g/1;糖蜜20 50 g/1; MgS04 7H20 2 6 g/1;玉米漿10 30 g/1; K2HP040. 5 2 g/1; KH2PO40. 5 2 g/1; ZnS04 5 15mg/l; FeS04 5 15mg/l; MnS04 5 15mg/l; CuS04 5 15mg/l。
上述步驟c中的流加培養(yǎng)基，其配方為葡萄糖500 700 g/l，酵母粉5 20 g/l，麥芽汁40 80 g/l，玉米漿3 10g/1。
本發(fā)明提供的上述釀酒酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)還原性谷胱甘肽的方法，對(duì)培 養(yǎng)基的配方進(jìn)行了優(yōu)化，在過程控制當(dāng)中實(shí)時(shí)對(duì)發(fā)酵尾氣進(jìn)行檢測(cè)分析，更超
7前的預(yù)測(cè)酵母細(xì)胞的代謝情況，為補(bǔ)料提供了更及時(shí)、更準(zhǔn)確的指導(dǎo)，給出了 更有利于積累谷胱甘肽的工藝技術(shù)參數(shù)。同時(shí)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在適量添加前體氨基 酸的同時(shí)，降低發(fā)酵溫度和流加補(bǔ)料的速率可以明顯提高酵母中GSH的含量，
此方法在發(fā)酵的后段可以節(jié)省流加補(bǔ)料的用量，降低生產(chǎn)成本。最終GSH含量 可達(dá)1800mg/L以上。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，實(shí)施例中的釀 酒酵母是以從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買的1253熱帶假絲酵母為培
養(yǎng)菌株。
實(shí)施例l
a. 將搖瓶種子培養(yǎng)基在12rC滅菌30分鐘，自然冷卻至室溫后，接入斜面 釀灑酵母菌種，在28。C溫度條件下，震蕩培養(yǎng)15小時(shí)，震蕩頻率為100rpm，
其中搖瓶種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖50g/l;酵母粉10g/l; (NH4) 2HP04 3g/l;
MgS04.7H20 lg/l; K2HP04 0.5g/l; KH2P04 0. 5g/l;
b. 將發(fā)酵培養(yǎng)基在12rC滅菌30分鐘，自然冷卻至室溫后，將震蕩培養(yǎng)的 種子培養(yǎng)液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%接入，在溫度為28t:、初始攪拌轉(zhuǎn)速為 100rpm、通風(fēng)比為1VVM條件下培養(yǎng)12小時(shí)，當(dāng)溶解氧低于20%時(shí)提高攪拌轉(zhuǎn)速 50rpm使溶解氧保持在20。/。以上。其中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖70g/l;酵 母粉10g/l;麥芽汁80g/l; (NH4)2HP0410g/l;糖蜜20g/l; MgS04 7H20 4 g/1; 玉米漿20 g/l; K2HP04lg/l; KH2P04 lg/l; ZnS04 10mg/l; FeS04 5mg/l; MnS04 5mg/l; CuS04 5mg/l;
c. 將發(fā)酵培養(yǎng)基在12rC滅菌30分鐘，自然冷卻至室溫后，按發(fā)酵培養(yǎng)基 體積的1(F。接入步驟b中的種子培養(yǎng)液，在溫度為28"C、初始攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm， 之后每過2h增加50rpm直到升至500rpm，初始通氣量為1VVM，當(dāng)轉(zhuǎn)速升至500rpm2h后增加至2VVM，在此條件下培養(yǎng)14h后，開始按2g/l.h均速加入流加培養(yǎng) 基。流加培養(yǎng)基的配方為葡萄糖700 g/1，酵母粉20 g/1，麥芽汁80 g/1， 玉米漿10g/1。流加培養(yǎng)基的滅菌參數(shù)為IO(TC， 20分鐘.
當(dāng)呼吸商RQ值大于0.85時(shí)，要僅以RQ為補(bǔ)料依據(jù)，立即降低流加補(bǔ)料速 率至原流加補(bǔ)料速率的80%。當(dāng)RQ小于等于0. 85時(shí)，每過1小時(shí)流速增加10%。 同時(shí)再以尿素控制發(fā)酵液的PH值為4. 5，至36h向發(fā)酵液中分別添加4mmol/L
的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同時(shí)開始降溫rc，且同時(shí)降低流加培
養(yǎng)基補(bǔ)料速度的10。/。，至48h停止發(fā)酵，此時(shí)酵母的生物量為108g/L(干重)，GSH 總量為2470mg/L。 實(shí)施例2
a. 將搖瓶種子培養(yǎng)基在12rC滅菌30分鐘，自然冷卻至室溫后，接入斜面 釀酒酵母菌種，在32。C溫度條件下，震蕩培養(yǎng)10小時(shí)，震蕩頻率為300rpm，
其中搖瓶種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖40g/l;酵母粉5g/l; (NH4) 2HP04 lg/1;
MgS04*7H20 0. 5g/l; K2HP042g/l; KH2P04 2g/l;
b. 將發(fā)酵培養(yǎng)基在12rC滅菌30分鐘，自然冷卻至室溫后，將震蕩培養(yǎng)的 種子培養(yǎng)液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%接入，在溫度為32t:、初始攪拌轉(zhuǎn)速為 150rpm、通風(fēng)比為0.5VVM條件下培養(yǎng)6小時(shí)，當(dāng)溶解氧低于25%時(shí)提高攪拌轉(zhuǎn) 速150rpm使溶解氧保持在25。/。以上。其中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖60g/l; 酵母粉30g/l;麥芽汁40 g/l; (NH4)2HP045 g/l;糖蜜40 g/l; MgS04*7H20 2 g/l;玉米漿10 g/l; K2HP040 . 5 g/l; KH2P04 0. 5 g/l; ZnS04 5mg/l; FeS04 10mg/l; MnS04 15mg/l; CuS04 15mg/l;
c. 將發(fā)酵培養(yǎng)基在12rc滅菌30分鐘，自然冷卻至室溫后，按發(fā)酵培養(yǎng)基
體積的IO財(cái)妾入步驟b中的種子培養(yǎng)液，在溫度為32°C 、初始攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm， 之后每過4h增加150rpm直到升至500rpm，初始通氣量為0. 5VVM，當(dāng)轉(zhuǎn)速升至500rpm4h后增加至1.5VVM，在此條件下培養(yǎng)10h后，開始按6g/l. h均速加入 流加培養(yǎng)基。流加培養(yǎng)基的配方為葡萄糖600 g/l，酵母粉IO g/l，麥芽汁 60 g/l，玉米漿5g/1。流加培養(yǎng)基的滅菌參數(shù)為ll(TC， IO分鐘.
當(dāng)呼吸商RQ值大于0.85時(shí)，僅以RQ為補(bǔ)料依據(jù)，立即降低流加補(bǔ)料速率 至原流加補(bǔ)料速率的10%。當(dāng)RQ小于等于0. 85時(shí)，每過2小時(shí)流加補(bǔ)料速率增 加50%。同時(shí)再以氨水控制發(fā)酵液的pH值為5. 5，至28h向發(fā)酵液中分別添加 6mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同時(shí)開始降溫6"，且同時(shí)降低 流加培養(yǎng)基補(bǔ)料速度的50%，至36h停止發(fā)酵，此時(shí)酵母的生物量可達(dá)到 98g/L (干重)，GSH總量為1895mg/L。
實(shí)施例3
a. 將搖瓶種子培養(yǎng)基在12rC滅菌30分鐘，自然冷卻至室溫后，接入斜面 釀酒酵母菌種，在30。C溫度條件下，震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，震蕩頻率為150rpm, 其中搖瓶種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/l;酵母粉3g/l; (NH4) 2HP04 6g/1;
MgS04*7H20 1. 5g/l; K2HP04 lg/l; KH2P04 lg/l;
b. 將發(fā)酵培養(yǎng)基在12rC滅菌30分鐘，自然冷卻至室溫后，將震蕩培養(yǎng)的 種子培養(yǎng)液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%接入，在溫度為3(TC、初始攪拌轉(zhuǎn)速為 50rpm、通風(fēng)比為1. 5VVM條件下培養(yǎng)8小時(shí)，當(dāng)溶解氧低于30%時(shí)提高攪拌轉(zhuǎn)速 100rpm使溶解氧保持在30。/。以上。其中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖40g/l; 酵母粉20g/l;麥芽汁60g/l; (NH4)2HP0416 g/l;糖蜜50g/l; MgS04*7H20 6 g/l;玉米漿30g/l; K2HP042 g/l; KH2P04 2 g/l; ZnS0415mg/l; FeS04 15mg/l; MnS04 10mg/l; CuS04 10mg/l;
c. 將發(fā)酵培養(yǎng)基在12rC滅菌3Q分鐘，自然冷卻至室溫后，按發(fā)酵培養(yǎng)基 體積的10。/。接入步驟b中的種子培養(yǎng)液，在溫度為30。C、初始攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm， 之后每過3h增加100rpm直到升至500rpm，初始通氣量為0. 8VVM，當(dāng)轉(zhuǎn)速升至500rpm 3h后增加至1. 8VVM，在此條件下培養(yǎng)12h后，開始按4g/l. h均速加入 流加培養(yǎng)基。流加培養(yǎng)基的配方為葡萄糖500g/l，酵母粉5g/l，麥芽汁40 g/l， 玉米漿3g/1。流加培養(yǎng)基的滅菌參數(shù)為105°C， 15分鐘.
當(dāng)呼吸商RQ值大于0. 85時(shí)，要僅以RQ為補(bǔ)料依據(jù)，立即降低流加補(bǔ)料速 率至原流加補(bǔ)料速率的30%。當(dāng)RQ小于等于0.85時(shí)，每過1.5小時(shí)流速增加 30%。同時(shí)再以氨水控制發(fā)酵液的pH值為5. 0，至30h向發(fā)酵液屮分別添加 2mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同時(shí)開始降溫3'C，且同時(shí)降低 流加培養(yǎng)基補(bǔ)料速度的20%，至42h停止發(fā)酵，此時(shí)酵母的生物量為128g/L(干 重)，GSH總量為2080mg/L。
對(duì)比實(shí)施例1
將實(shí)施例1流加培養(yǎng)基配方中的麥芽汁、酵母粉和玉米漿去掉，只以700g/L 的葡萄糖配制補(bǔ)料，其它條件不變。這樣導(dǎo)致補(bǔ)料以后，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分 逐漸單一化，不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和GSH的積累，最終下罐結(jié)果為生物量50g/L (細(xì)胞干重)，GSH含量452mg/L。
對(duì)比實(shí)施例2
在實(shí)施例2中，28h添加氨基酸后，同時(shí)降溫6。C，現(xiàn)將降溫6"C改為升溫 2°C，其它條件不變。由于環(huán)境溫度的改變，使GSH的積累受到了嚴(yán)重影響，最 終下罐結(jié)果為生物量80g/L (細(xì)胞干重)，GSH含量352mg/L。
對(duì)比實(shí)施例3
在實(shí)施例3中添加氨基酸為2mmol/L，現(xiàn)將添加量升高為12mmol/L.改變氨 基酸添加量后的最終下罐結(jié)果為生物量75g/L (細(xì)胞干重),GSH含量630mg/L。 對(duì)比實(shí)施例4
在實(shí)施例3中發(fā)酵至30h時(shí)，將流加補(bǔ)料的速率降低了 20°/。，現(xiàn)將流加補(bǔ)料 的速率升高20%,其它條件不變。最終下罐結(jié)果為生物量65g/L(細(xì)胞干重)，GSH 含量430mg/L。
權(quán)利要求
1. 一種釀酒酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)還原性谷胱甘肽的方法，其特征在于該方法包括以下步驟a. 將斜面釀酒酵母菌種接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，在28～32℃溫度條件下，震蕩培養(yǎng)10～15小時(shí)，震蕩頻率為100～300rpm；b. 將震蕩培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10％接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度為28～32℃、初始攪拌轉(zhuǎn)速為50～150rpm、通風(fēng)比為0.5～1.5VVM條件下培養(yǎng)6～12小時(shí)，當(dāng)溶解氧低于20％～30％時(shí)，提高攪拌轉(zhuǎn)速50～100rpm，使溶解氧保持在20％～30％以上；c. 按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10％接入步驟b中的種子培養(yǎng)液，在溫度為28～32℃、初始攪拌轉(zhuǎn)速為50～150rpm，之后每過2～4h增加50～150rpm直到升至500rpm，初始通氣量為0.5～1VVM，當(dāng)轉(zhuǎn)速升至500rpm2～4h后增加至1.5～2VVM，在此條件下培養(yǎng)10～14h后，開始按2～6g/l.h均速加入流加培養(yǎng)基，流加培養(yǎng)基的滅菌參數(shù)為100～110℃，10～20分鐘；當(dāng)呼吸商RQ值大于0.85時(shí)，要僅以RQ為補(bǔ)料依據(jù)，立即降低流加補(bǔ)料速率至原流加補(bǔ)料速率的10％～80％，當(dāng)RQ小于等于0.85時(shí)，每過1～2小時(shí)流速增加10％～50％，同時(shí)再以尿素或氨水控制發(fā)酵液的pH值在4.5～5.5之間，至28～36h向發(fā)酵液中分別添加2～6mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同時(shí)開始降溫1～6℃，且同時(shí)降低流加培養(yǎng)基補(bǔ)料速度的10％～50％，經(jīng)過36～48h發(fā)酵停止發(fā)酵，此時(shí)酵母的生物量干重達(dá)到98～128g/L，GSH總量穩(wěn)定在1800mg/L～2470mg/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)還原性谷胱甘肽的方法， 其特征在于該方法的步驟a中所述的搖瓶種子培養(yǎng)基，其配方為葡萄糖20 50g/l;酵母粉3 10g/l;(麗4)2跳l 6g/l; MgS04 7H20 0. 5 1. 5g/1; K2HP(X 0. 5 2g/l; KH2P04 0. 5 2g/l。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)還原性谷胱甘肽的方法，其特征在于該方法的步驟b中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方為葡萄糖40 70 g/l;酵母粉10 30g/l;麥芽汁40 80g/l;(麗4)2跳5 16g/l;糖蜜20 50g/l; MgS04 7H20 2 6 g/l;玉米漿10 30 g/l; K2HP040 . 5 2 g/l; KH2P04 0. 5 2g/l; ZnS04 5 15mg/l; FeS04 5 15mg/l; MnS04 5 15mg/l; CuS04 5 15mg/l。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)還原性谷胱甘肽的方 法，其特征在于該方法的步驟c中所述的流加培養(yǎng)基，其配方為葡萄糖500 700 g/l，酵母粉5 20 g/l，麥芽汁40 80 g/l，玉米漿3 10g/1。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種釀酒酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)還原性谷胱甘肽的方法，以釀酒酵母為培養(yǎng)菌株，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，在過程控制中實(shí)時(shí)對(duì)發(fā)酵尾氣進(jìn)行檢測(cè)分析，超前預(yù)測(cè)酵母細(xì)胞的代謝情況，為補(bǔ)料提供更及時(shí)、更準(zhǔn)確的指導(dǎo)，給出了更有利于積累谷胱甘肽的工藝技術(shù)參數(shù)。同時(shí)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在適量添加前體氨基酸的同時(shí)，降低發(fā)酵溫度和流加補(bǔ)料的速率可以明顯提高酵母中GSH的含量，此方法在發(fā)酵的后段可以節(jié)省流加補(bǔ)料的用量，降低生產(chǎn)成本。最終GSH含量可達(dá)1800mg/L以上。
文檔編號(hào)C12R1/865GK101429537SQ20081023383
公開日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月14日
發(fā)明者曲國(guó)臣, 彬 段, 王選性, 賈子龍 申請(qǐng)人:甘肅正生生物科技有限公司