專利名稱：：一種分析水稻抗稻瘟病基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用稻瘟病菌近等菌株進(jìn)行抗稻瘟病基因分析的一種方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：水稻稻瘟病是一種世界性的病害，多年的實(shí)踐證明培育和種植抗病品種是控制這一病害最安全、經(jīng)濟(jì)、有效的防治措施。但水稻稻瘟病菌是一個(gè)較易于發(fā)生變異的病原群體，常使一個(gè)新推廣的品種在種植35年后便喪失抗性。為了穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)，育種家不得不利用新的抗病基因或采用基因組合來(lái)選育新的抗病品種，因此，準(zhǔn)確可靠的抗稻瘟病基因分析對(duì)水稻抗病育種具有重要意義。到目前為止，人們大約鑒定了40多個(gè)抗稻瘟病基因。然而，這些抗病基因是由不同的實(shí)驗(yàn)室，不同年份、不同地點(diǎn)，采用不同菌株鑒定出來(lái)的。由于稻瘟病抗性鑒定對(duì)發(fā)病條件要求嚴(yán)格，只有當(dāng)接種的苗齡、生長(zhǎng)勢(shì)、所用菌辟的壞傳背景，接種時(shí)的溫度、濕度，所用的孢子尊等等都一致的條件下，所獲得的接種結(jié)果才可靠。目前，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用的菌株不同，各菌株的遺傳背景不一致，且在不同的接種條件下接種，所獲得的結(jié)果可比性較差。即各實(shí)驗(yàn)室依據(jù)水稻分離世代抗性表現(xiàn)而推導(dǎo)出的抗病基因沒有可比性，可能將不同抗病基因定名為相同的基因，將相同的基因定名為不同基因。為了證明各個(gè)基因?qū)嶓w間的真正關(guān)系，進(jìn)行抗病基因克隆和功能分析，則需要做大量的測(cè)交和等位性分析。這是一件非常繁重的工作，且將不同的抗病基因間的關(guān)系都分析清楚是難以實(shí)現(xiàn)的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是克服現(xiàn)有方法的不足，提供了一種準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)便、快速的抗稻瘟病基因分析的方法，為稻瘟病抗病育種及抗病基因克隆和功能分析奠定基礎(chǔ)。本方法的技術(shù)方案1利用一個(gè)對(duì)含有30多個(gè)抗病基因的水稻近等基因系，包括普遍認(rèn)為沒有抗病基因的麗江新團(tuán)黑谷在內(nèi)的所有品系，均不能致病的菌株CY2，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，獲得大量轉(zhuǎn)化子；2將獲得的轉(zhuǎn)化子接種到己知抗病基因的水稻近等基因系上，從感病型病斑上獲得單孢菌株，回接到近等基因系上，確認(rèn)致病性，得到了35個(gè)致病性發(fā)生了變異的菌株；3在育苗盤中分穴播種待測(cè)的水稻品種，并用麗江新團(tuán)黑谷作為感病對(duì)照，用常規(guī)方法進(jìn)行管理，待秧苗長(zhǎng)到3葉1心時(shí)備用；4分別將35個(gè)菌株在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，產(chǎn)孢后制備孢子懸浮液；5將制備好的孢子懸浮液分別接種到待測(cè)的秧苗上，接種濃度，接種方法同常規(guī);6在25-28'C下保濕7天后，按常規(guī)方法觀察記載病情，確定抗感反應(yīng)型，推導(dǎo)待測(cè)品種的基因型。水稻稻瘟病菌與水稻是一個(gè)基因?qū)蜿P(guān)系的病害系統(tǒng)。水稻抗病基因與稻瘟病菌無(wú)毒基因的鑒定與推導(dǎo)是一種相互依存的關(guān)系。即利用稻瘟病菌株的致病類型推導(dǎo)水稻品種的抗病基因組成，利用水稻的抗病基因推導(dǎo)菌株的無(wú)毒基因或致病基因組成?；谶@一理論基礎(chǔ)，就可人為的構(gòu)建一套稻瘟病菌近等菌株進(jìn)行抗性基因推導(dǎo)工作。如果利用一個(gè)遺傳背景完全一致的菌株，篩選不同致病性的突變體，構(gòu)建近等菌株，則可以實(shí)現(xiàn)不用做水稻雜交和接種雜交后代抗病性，也不用通過(guò)等位性測(cè)驗(yàn)，便可以通過(guò)直接利用突變體接種穩(wěn)定的品種，依據(jù)抗病類型，了解品種的抗性基因組成。我們得到的35個(gè)致病性發(fā)生變芽的菌株有的在一個(gè)位點(diǎn)上發(fā)生了變異，有的在多個(gè)位點(diǎn)上發(fā)生了變異，各菌株致病類型構(gòu)成了一個(gè)致病型矩陣。因此，利用這套致病基因近等菌株不僅可用于含單個(gè)抗病基因水種品種的抗病基因推導(dǎo)，也可用于含多個(gè)抗病基因水稻品種的推導(dǎo)。特別是這套菌株的應(yīng)用，可改變過(guò)去通過(guò)水稻雜交、測(cè)交分析抗病基因的傳統(tǒng)方法，使鑒定抗病基因的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，所得到的結(jié)果具有廣適性，避免不同實(shí)驗(yàn)室接種的結(jié)果不一致的情況出現(xiàn)；利用這套菌株還可以發(fā)現(xiàn)新的抗病基因。具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例子來(lái)進(jìn)一歩詳述本發(fā)明。品種抗性采用苗瘟鑒定法按常規(guī)方式進(jìn)行。實(shí)施例一l采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化廣泛無(wú)致病力的菌株獲CY2，得到大量轉(zhuǎn)化子；2將獲得的轉(zhuǎn)化子接種到已知抗病基因的水稻近等基因系上，從感病型病斑上獲得單孢菌株，回接到近等基因系上，確認(rèn)致病性，得到了3個(gè)致病性發(fā)生了變異的菌株Tl(Vir/^'-ta)，T2(Vir尸/-和T3(Vir/^'-a);3在育苗盤中分穴播種待測(cè)的水稻品種和3個(gè)相應(yīng)的已知抗病基因的近等基因系(A，B，C)，并用麗江新團(tuán)黑谷作為感病對(duì)照，用常規(guī)方法進(jìn)行管理，待秧苗長(zhǎng)到3葉1心時(shí)備用；4分別將3個(gè)菌株和野生型菌株CY2在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，產(chǎn)孢后制備孢子懸浮液；5將制備好的孢子懸浮液分別接種到待測(cè)的秧苗上，接種濃度，接種方法同常規(guī);6在25-28'C下保濕7天后，按常規(guī)方法觀察記載病情，確定抗感反應(yīng)型，推導(dǎo)待測(cè)品種的基因型。表l接種結(jié)果表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>-從上表的接種結(jié)果可以看出，待測(cè)品種的基因型為-尸/-"。實(shí)施例二l采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化廣泛無(wú)致病力的菌株獲CY2，得到大量轉(zhuǎn)化子；2將獲得的轉(zhuǎn)化子接種到已知抗病基因的水稻近等基因系上，從感病型病斑上獲得單孢菌株，回接到近等基因系上，確認(rèn)致病性，得到了4個(gè)致病性發(fā)生了變異的菌株Tl(Vir/^'-5，尸卜乃，T2(Vir尸y—乃，T3(Vir,卜5,尸卜幼，T4(VirA'—7,戶y-7i)。3在育苗盤中分穴播種待測(cè)的水稻品種和4個(gè)相應(yīng)的已知抗病基因的近等基因系，并用麗江新團(tuán)黑谷作為感病對(duì)照，用常規(guī)方法進(jìn)行管理，待秧苗長(zhǎng)到3葉1心時(shí)備用；4分別將4個(gè)菌株和野生型菌株CY2在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，產(chǎn)孢后制備孢子懸浮液；5將制備好的孢子懸浮液分別接種到待測(cè)的秧苗上，接種濃度，接種方法同常規(guī);6在25-28"C下保濕7天后，按常規(guī)方法觀察記載病情，確定抗感反應(yīng)型，推導(dǎo)待測(cè)品種的基因型。表2接種結(jié)果表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從上表的接種結(jié)果可以看出，待測(cè)品種的基因型和B相同，為Pi-7(r)。實(shí)施例三l采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化廣泛無(wú)致病力的菌株獲CY2，得到大量轉(zhuǎn)化子；2將獲得的轉(zhuǎn)化子接種到已知抗病基因的水稻近等基因系上，從感病型病斑上獲得單孢菌株，回接到相應(yīng)的品系上，確認(rèn)致病性，得到了8個(gè)致病性發(fā)生了變異的菌株<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>3在育苗盤中分穴播種待測(cè)的水稻品種和8個(gè)相應(yīng)的已知抗病基因的近等基因系，并用麗江新團(tuán)黑谷作為感病對(duì)照，用常規(guī)方法進(jìn)行管理，待秧苗長(zhǎng)到3葉1心時(shí)備用；4分別將8個(gè)菌辨和野生型菌株CYS在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，產(chǎn)孢后制備孢子懸浮液；5將制備好的孢子懸浮液分別接種到待測(cè)的秧苗上，接種濃度，接種方法同常規(guī)；6保溫保濕7天后，按常規(guī)方法觀察記載病情，確定抗感反應(yīng)型，推導(dǎo)待測(cè)品種的基因型。表3接種結(jié)果表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從上表的接種結(jié)果可以看出，待測(cè)品種的基因型和B相同，為A-厶實(shí)施例四l采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化廣泛無(wú)致病力的菌株獲CY2，得到大量轉(zhuǎn)化子；2將獲得的轉(zhuǎn)化子接種到己知抗病基因的水稻近等基因系上，從感病型病斑上獲得單孢菌株，回接到相應(yīng)的品系上，確認(rèn)致病性，得到了5個(gè)致病性發(fā)生了變異的菌株Tl(Vir尸i-￡)，T2(VirA-A力，A.-》，T3(Vir尸i-》，T4(Vir/7/-/)，T5(Vir尸/-A'，Vir,i-/)。3在育苗盤中分穴播種待測(cè)的水稻品種和5個(gè)相應(yīng)的已知抗病基因的近等基因系，并用麗江新團(tuán)黑谷作為感病對(duì)照，用常規(guī)方法進(jìn)行管理，待秧苗長(zhǎng)到3葉1心時(shí)備用；4分別將5個(gè)菌株和野生型菌株CY2在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，產(chǎn)孢后制備孢子懸浮液；5將制備好的孢子懸浮液分別接種到待測(cè)的秧苗上，接種濃度，接種方法同常規(guī)；6保溫保濕7天后，按常規(guī)方法觀察記載病情，確定抗感反應(yīng)型，推導(dǎo)待測(cè)品種的基因型。..表4接種結(jié)果表品種和抗病基因菌株和致病基因a(/^.-/)bcz)d/)e(尸j'-a')x(待測(cè))原始菌CY2RRRRRRTl(Vir,H')SRRRRRT2(Vir尸y-/,尸i-2)RSSRRST3(Vir尸卜》RRSRRST4(VW-/)RRRSRRT5(Vir/V-尸W)RRRSSR從上表的接種結(jié)果可以看出，待測(cè)品種的基因型為尸i-Z。權(quán)利要求1、一種分析水稻抗稻瘟病基因的方法，其步驟為1)利用一個(gè)對(duì)含有30個(gè)抗病基因的水稻近等基因系，包括普遍認(rèn)為沒有抗病基因的麗江新團(tuán)黑谷在內(nèi)的所有品系，均不能致病的菌株CY2，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，獲得大量轉(zhuǎn)化子；2)將獲得的轉(zhuǎn)化子接種到已知抗病基因的水稻近等基因系上，從感病型病斑上獲得單孢菌株，回接到相應(yīng)的品系上，確認(rèn)致病性，得到了35個(gè)致病性發(fā)生了變異的菌株；3)在育苗盤中分穴播種待測(cè)的水稻品種，并用麗江新團(tuán)黑谷作為感病對(duì)照，用常規(guī)方法進(jìn)行管理，待秧苗長(zhǎng)到3葉1心時(shí)備用；4)分別將35個(gè)菌株在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，產(chǎn)孢后制備孢子懸浮液；5)將制備好的孢子懸浮液分別接種到待測(cè)的秧苗上，接種濃度，接種方法同常規(guī)；6)保溫保濕7天后，按常規(guī)方法觀察記載病情，確定抗感反應(yīng)型，推導(dǎo)待測(cè)品種的基因型。全文摘要本發(fā)明涉及一種分析水稻抗稻瘟病基因的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是1)尋找一個(gè)性狀穩(wěn)定，廣泛無(wú)致病力的菌株；2)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化該菌株，將獲得的轉(zhuǎn)化子接種到水稻近等基因系上，從感病型病斑上獲得致病性發(fā)生變異的單孢菌株；3)回復(fù)接種，鑒定并確認(rèn)該套單孢菌株的致病性，獲得一套近等菌系，用于品種的抗病基因鑒定。本發(fā)明的效果用途能構(gòu)建一套稻瘟病菌近等基因菌株進(jìn)行抗性基因推導(dǎo)，可以實(shí)現(xiàn)不用做水稻雜交和接種雜交后代抗病性，也不用通過(guò)等位性測(cè)驗(yàn)，便可以通過(guò)直接利用突變體接種穩(wěn)定的品種，依據(jù)抗病類型，了解品種的抗性基因組成；可用于含單個(gè)或多個(gè)抗病基因水稻品種的抗病基因推導(dǎo)。文檔編號(hào)C12Q1/02GK101240346SQ200810058178公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2008年3月13日優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日發(fā)明者何月秋,吳毅馨,周惠萍申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)