專利名稱：：分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
：嘌呤核苷磷酸化酶是許多診斷試劑的關(guān)鍵原料酶，如腺苷脫氨酶(ADA)、5'-核苷酸酶等測定試劑中需要嘌呤核苷磷酸化酶作為工具酶。上述兩種試劑均有重要的臨床意義，如腺苷脫氨酶(ADA)廣泛存在于人體各種組織，尤其是T淋巴細胞中。ADA測定主要用于肝膽疾病的診斷，其臨床意義類似ALT,ADA分子較ALT小，在肝細胞損害時較ALT容易釋放入血中，是肝損傷的敏感指標，對反映急性肝損害的殘存病變和慢性肝損害比ALT為先，可作為肝功能常規(guī)檢査項目之一。5，-核苷酸酶(5，-NT)廣泛存在于肝臟和各種組織中。血清中5，-NT活力增高主要見于肝膽系統(tǒng)疾病，如阻塞性黃疸、原發(fā)及繼發(fā)性肝癌等，且通常其活力變化與ALP活力變化相平衡。但在骨骼系統(tǒng)疾病，如腫瘤轉(zhuǎn)移、畸形性骨炎、甲狀旁腺機能亢進、佝僂病等，通常ALP活力增高，而5'-NT正常。因此臨床上可采用兩者結(jié)合來對肝膽疾病和骨骼系統(tǒng)疾病進行診斷與鑒別。目前，國內(nèi)許多醫(yī)院已經(jīng)將上述兩種試劑作為常規(guī)檢驗項目開展。兩種試劑檢測反應(yīng)步驟中均需要用嘌呤核苷磷酸化酶將肌苷轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤，因此嘌呤核苷磷酸化酶是診斷試劑的重要工具酶。嘌呤核苷磷酸化酶蛋白為六聚體，廣泛存在于真核和原核生物中。酶從天然微生物中提取存在菌體使用量高、轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間長、轉(zhuǎn)化效率低等問題，限制了它們在工業(yè)上的應(yīng)用。通過基因工程手段對酶進行重組表達是酶制劑工業(yè)的發(fā)展趨勢。日本TOYOBO公司(JP2002017354)從嗜熱乳鏈球菌StreptococcusthermophilusIF013957提取分離得到嘌呤核苷磷酸化酶，并公布了酶的基因序列。但該酶在使用中存在熱穩(wěn)定性差的缺點，不適合作為液體診斷試劑的原料。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供通一種分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法。分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶是嘌呤核苷磷酸化酶突變體DNA序列的表3達產(chǎn)物；突變體氨基酸序列是通過使SEQIDN0.1所示的序列中230位半胱氨酸突變替換為丙氨酸，得到具有SEQIDN0.2的氨基酸序列的嘌呤核苷磷酸化酶。載體是含有SEQIDN0.2的氨基酸序列。所述的載體適合于在大腸桿菌中表達。嘌呤核苷磷酸化酶的制備方法包括以下步驟-嘌呤核苷磷酸化酶基因序列引物設(shè)計、PCR擴增；-嘌呤核苷磷酸化酶基因片段與克隆載體的連接，得到攜帶嘌呤核苷磷酸化酶基因的重組表達載體；-基因序列230位定點突變，PCR擴增得到攜帶突變嘌呤核苷磷酸化酶基因的重組表達載體；-重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌株中，得到重組體細菌；-重組體細菌培養(yǎng)、提取得到純化的嘌呤核苷磷酸化酶。所述的重組體細菌是重組的大腸桿菌細菌。本發(fā)明通過過定點突變的方法對嘌呤核苷磷酸化酶基因進行分子改造，改良后的酶在溫度的耐受性方面更加優(yōu)良。首先，本發(fā)明通過引物設(shè)計，用PCR方法擴增出序列，對序列230位氨基酸進行定點突變，使原半胱氨酸突變?yōu)楸彼?。接著，用基因工程技術(shù)將序列與pET-43.1b(+)質(zhì)粒連接。最后轉(zhuǎn)化構(gòu)建工程菌，使嘌呤核苷磷酸化酶高效表達，達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。圖l是質(zhì)粒連接模式示意圖2是PCR擴增得到PNP基因目的條帶圖片，圖中，Lanel:DNAMarkerDL2000，Lane2-4:基因PNP酶切產(chǎn)物，Lane5-7:pET-43.1b(+)酶切圖3是pET-43.1b(+)-PNP酶切鑒定圖片，圖中，Lane1:DL2000TMDNAMarker,Lane2-8:重組質(zhì)粒的酶切條帶；圖4是pET-43.1b(+)-PNPPCR鑒定圖片，圖中，Lanel:DL2000TMDNAMarker,Lane2-7:重組質(zhì)粒的PCR反應(yīng)條帶；圖5是37°C，IPTG誘導(dǎo)凝膠電泳圖片，圖中，LanehProteinMarker，Lane2:誘導(dǎo)lh，Lane3:誘導(dǎo)2h，Lane4:誘導(dǎo)3h，Lane5:誘導(dǎo)4h，Lane6:誘導(dǎo)5h，Lane7:誘導(dǎo)過夜，Lane8:無IPTG;圖6是室溫(25-30°C)IPTG誘導(dǎo)凝膠電泳圖片，圖中，Lanel:ProteinMarker，Lane2:誘導(dǎo)lh，Lane3:誘導(dǎo)2h，Lane4:誘導(dǎo)3h，Lane5:誘導(dǎo)4h，Lane6:誘導(dǎo)5h，Lane7:誘導(dǎo)過夜，Lane8:無IPTG。具體實施方式本發(fā)明通過PCR技術(shù)大量擴增PNP全長片段，將片段插入pET-43.1b(+)質(zhì)粒載體構(gòu)成pET-43.1b(+)-PNP重組載體，對基因片段進行分子改造、定點突變，將序列230半胱胺酸改造為丙氨酸，以提高酶的熱穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)化工程菌E.coliBL21(DE3)。小規(guī)模誘導(dǎo)篩選最佳的培養(yǎng)條件，根據(jù)最佳條件，發(fā)酵培養(yǎng)、誘導(dǎo)原核細胞表達，親和層析純化重組蛋白。此系統(tǒng)不但可以提高產(chǎn)率，還可以縮短生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本，從而極大地提高在市場上的競爭力。分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶是嘌呤核苷磷酸化酶突變體DNA序列的表達產(chǎn)物；突變體氨基酸序列是通過使SEQIDN0.1所示的序列中230位半胱氨酸突變替換為丙氨酸，得到具有SEQIDN0.2的氨基酸序列的嘌呤核苷磷酸化酶。載體是含有SEQIDN0.2的氨基酸序列。所述的載體適合于在大腸桿菌中表達。嘌呤核苷磷酸化酶的制備方法包括以下步驟-嘌呤核苷磷酸化酶基因序列引物設(shè)計、PCR擴增；-嘌呤核苷磷酸化酶基因片段與克隆載體的連接，得到攜帶嘌呤核苷磷酸化酶基因的重組表達載體；-基因序列230位定點突變，PCR擴增得到攜帶突變嘌呤核苷磷酸化酶基因的重組表達載體；-重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌株中，得到重組體細菌；-重組體細菌培養(yǎng)、提取得到純化的嘌呤核苷磷酸化酶。所述的重組體細菌是重組的大腸桿菌細菌。實施列1:嗜熱乳鏈球菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因序列引物設(shè)計、PCR擴增。1、根據(jù)PNP基因序列(GenBank:BD107242)，以pET-43.1b(+)作為表達載體，利用primer5.0引物設(shè)計軟件進行全基因引物設(shè)計上游引物Ph5，-tgtctaagtcaccccggggcatgtcactacttgaaaaaattagagttacg-3';下游引物P2:5，-cgagtcgactggtaccttagacaaaatagctttaagcaatcctttgaag-3'Pl、P2的5'端分別包含Smal、Kpnl兩個限制性酶切位點并在酶切位點前加了3-7個保護性堿基。2、PCR反應(yīng)，嗜熱乳鏈球菌(StreptococcusthermophilusIF013957)為DNA為模板，應(yīng)用PCR反應(yīng)，通過特定的設(shè)計引物引入Smal、Kpnl兩個酶切位點，PCR擴增PNP目的基因片段。(1)PCR反應(yīng)體系如下成分(ul)體積DNA模板(嗜熱乳鏈球菌)TaqDNApolymerase上引物下引物10xbufferdNTPddH20tt畏212223650(2)PCR反應(yīng)條件溫度時間95°C5min95°C15s、69°C30sx35個循環(huán)72°C90s^72°C7min4°C通過PCR擴增的產(chǎn)物，經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnI、Smal兩次單酶切反應(yīng)后，經(jīng)葡萄糖瓊脂電泳顯示，預(yù)期堿基大小處存在PNP目的片段(見圖2)，測序后(委托上海生工)序列如序列表中SEQIDNO.l。實施列2:嘌呤核苷磷酸化酶基因與克隆載體的連接，得到攜帶嘌呤核苷磷酸化酶基因的重組表達載體1、將PCR反應(yīng)產(chǎn)物用UNIQ-10柱式(購于上海生工生物公司)質(zhì)粒小量抽提試劑盒回收，得到較純的DNA。用Smal、Kpnl限制性內(nèi)切酶進行兩次單酶切，6條件如下a)限制性內(nèi)切酶KpnI酶切體系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>b)DNA沉淀通過Kpnl酶切的反應(yīng)體系，需通過DNA沉淀進行第二次酶切。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>13000rpm離心8min，去上清，力B70%乙醇洗滌，13000rpm4min，去上清，再離2min，用200ul加樣槍吸去上清。室溫敞開干燥5min，待用。c)限制性內(nèi)切酶Smal酶切體系_<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>30°C恒溫水浴，2.5h。d)目的基因PNP切膠回收、純化50ul體系加10ul6xloadingbuffer進行0.8%的Agarose疑膠電泳，110V跑40min，紫外燈下觀察結(jié)果，切下目的Agarose凝膠，利用UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒進行純化,待用。2、pET-43.1b(+)載體片段制備(1)UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒制備pET-43.1b(+)載體a)從質(zhì)粒保存菌平板上挑取數(shù)個單菌落，在4個7ml含氨芐青霉素50ug/mlLB液體培養(yǎng)基中37°C，300rpm振蕩培養(yǎng)過夜。b)次日，按照UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒說明書制備得到pET-43.1b(+)質(zhì)粒載體。(2)已進行KpnI、SmaI兩次單酶切目的基因PNP、純化pET-43.1b(+)載體片段，待用。3、載體pET-43.1b(+)與PNP連接(1)將pET-43.1b(+)與PNP按1:51:10比例混勻，DNA濃縮儀抽干。(2)連接反應(yīng)體系成分_體積(ul)ddH20810xbuffer1T4DNA連接酶1.5總量_10.522°C連接過夜。實施列3:基因序列230位定點突變，PCR擴增得到重組表達載體。用定點突變方法將序列SEQIDNOl第230位半胱氨酸突變?yōu)楸彼?。設(shè)計引物為Mutl:5'-cttgaaagttctgggcatttcag￡gatctctaactttgcagc-3，突變位點Mut2:5'-gctgcaaagttagagatcgctg;aaatgcccagaacttteaag-3'突變位點(1)PCR反應(yīng)體系_成分_體積(ul)PNP-pET43b質(zhì)粒模板2TaqDNApolymerase1上引物2下引物210xbuffer5dNTP2ddH2036總量5(2)PCR反應(yīng)條件溫度時間95。C5min95°C15s，69°C30s丁'x35個循環(huán)72°C90s72°C7min4°C(3)PCR產(chǎn)物(重組表達載體)用Dpn酶切37。C2小時，經(jīng)DNA測序后(委托上海生工)再轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)工程菌，見實施列4，測序后序列如序列表中SEQIDN0.2。實施列4:重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌株中。(1)E.coliDH5a感受態(tài)制備a)從E.coliDH5a保存平板上挑取白色單克隆菌落，在7mlLB液體培養(yǎng)基中37°C恒溫水浴箱靜置培養(yǎng)過夜。b)次日，取過夜培養(yǎng)液10ul轉(zhuǎn)種至新LB液體培養(yǎng)基中，37°C，300rpm振蕩，培養(yǎng)至OD600值約0.6左右。c)按感受態(tài)制備試劑盒(購自寶生物公司)制備高效感受態(tài)細胞。-7(TC冷凍備用。(2)轉(zhuǎn)化a)實施列3中PCR產(chǎn)物65'C7(TC過夜，滅菌10min。常溫自然冷卻。b)從-7(TC取出E.coliDH5a感受態(tài)細胞，速溶，插入冰中。將滅菌連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)至感受態(tài)細胞中，輕輕均勻，置冰上30min。c)42°C熱激1min。將感受態(tài)細胞液轉(zhuǎn)至含500ulLB液體培養(yǎng)液的EP管中，37。C恒溫水浴1h。d)涂板，那培養(yǎng)物涂布于LB固體培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)過夜。(3)表達載體pET-43.1b(+)-PNP酶切鑒定隨機挑取6個轉(zhuǎn)化平板上的白色單個菌落于7ml含氨芐青霉素50ug/mlLB液體培養(yǎng)基中37"C，300rpm振蕩培養(yǎng)過夜。UMQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒小量提取質(zhì)粒，按下述體系進行兩次單酶切，DNA沉淀過程如上。成分體積(ul)質(zhì)粒DNA2510xbuffer3Kpn237'C恒溫水浴2h成分體積(ui)ddH202510xbuffer3SmaI230°C恒溫水浴2h表達載體pET-43.1b(+)-PNP酶切鑒定，6個樣品都得到目的條帶(圖3)。表達載體pET-43.1b(+)-PNPPCR鑒定，6個樣品均得到目的條帶(圖4)。實施列5:工程菌誘導(dǎo)表達與篩選1、PNP少量誘導(dǎo)優(yōu)化培養(yǎng)條件及SDS-PAGE電泳分析pET-43.1b(+)-PNP的誘導(dǎo)表達(1)感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)，方法如制備E.coliDH5a。(2)將測序比對吻合的重組表達質(zhì)粒pET-43.1b(+)-PNP轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)，37。C過夜培養(yǎng)。(3)從平板中隨機挑取單個白色菌落接種于7ml含氨芐青霉素50ug/mlLB液體培養(yǎng)基中37°C恒溫水浴箱靜置培養(yǎng)過夜。(4)次日，轉(zhuǎn)種至14管7ml含氨芐青霉素50ug/mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C300rpm振蕩培養(yǎng)3-5h，至OD550值0.6左右。(5)分兩組A、B，分別標記1-7號。1-6號加IPTG至終濃度1mmol/L誘導(dǎo)表達，7號不加IPTG，A組37匸300rpm振蕩，B組室溫振蕩。(6)取lh、2h、3h、4h、5h、過夜六個時間段誘導(dǎo)菌液，無IPTG菌管在lh時取出。(7)12000rpm15s收集菌體。(8)超聲波破碎細胞。離心收集上清液，-20"保存。待SDS-PAGA電泳分析。2、表達產(chǎn)物分別進行SDS-PAGE分析(l)制膠配制12。/。分離膠20ml，迅速將分離膠灌注于兩層玻璃板中，并在膠10上小心覆蓋一層異丙醇，室溫下靜置30min;待分離膠聚合后，倒出異丙醇，用蒸餾水洗3遍，并配制5%積層膠6.0ml，直接灌注，并插入干凈的梳子，室溫下30min。(2)樣品準備將蛋白樣品與3x蛋白上樣緩沖液混合，沸水浴3min，自然冷卻。取上清適量上樣。(3)電泳開始時電壓為40V，待樣品跑過積層膠、ProteinMarker分開后，將電壓增加打70V，直至染料到啊分離膠底部。(4)取下凝膠，去掉多余部分，0.25%考馬斯亮藍染色液浸泡凝膠，染色過夜。(5)脫色液脫色。從SDS-PAGE電泳結(jié)果可見，重組克隆pET-43.1b(+)-PNP/BL21(DE3)經(jīng)終濃度為lmmol/LIPTG誘導(dǎo)后，在分子大小約95KD出現(xiàn)了明顯的表達條帶，且亮度超過50%。A組誘導(dǎo)溫度為37。C，300rpm，用1.0mmol/LIPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示誘導(dǎo)lh時，基因PNP表達目的蛋白的量最高；誘導(dǎo)時間2-5h?；騊NP表達目的蛋白的量較平均；誘導(dǎo)過夜的產(chǎn)生的蛋白量明顯較上少；無IPTG。B組室溫(25-30°C)誘導(dǎo)，用1.0mmol/LIPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示:基因PNP過夜誘導(dǎo)時產(chǎn)生目的蛋白的效率高于其他時間段。A、B兩組誘導(dǎo)液經(jīng)過同樣的處理，電泳條件、染色條件、脫色條件相同，因此兩組結(jié)果有一定的可比性。由圖5、圖6對比可知，37"C基因PNP誘導(dǎo)表達目的蛋白具有更高的效率，更高的量。實施列7:重組體細菌培養(yǎng)、提取得到純化的嘌呤核苷磷酸化酶1、重組體細菌發(fā)酵培養(yǎng)(1)從pET-43.1b(+)-PNP/E.coliBL21(DE3)的氨芐青霉素平板上挑取數(shù)個菌落至100ml含氨芐青霉素50ug/mlLB液體培養(yǎng)基中，室溫搖過夜。另準備三升發(fā)酵液至發(fā)酵罐中，高壓滅菌。發(fā)酵液配方成分每3000mlNa2HP0425.3gKH2P043.6gNaCl19.6gNH4C13.0gYeastextract15.0gTryptone雄g消泡劑0.5ml(2)次日，發(fā)酵液中加100mg/ml氨芐青霉素1.5ml至3L發(fā)酵液中，將搖過夜的菌液全部轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中，攪拌400rpm,通氣量1升/min/V,發(fā)酵培養(yǎng)。(3)至OD600值2.0左右加IPTG，控制IPTG終濃度1mmol/L，37。C誘導(dǎo)1h。(4)離心收集菌體吧，4T保存，次日純化。2、提取純化嘌呤核苷磷酸化酶(1)3L培養(yǎng)液離心收集沉淀，濾干上清液。(2)用200mlpH7.4PBS重懸細菌沉淀。加入50mg溶菌酶至菌液中，室溫0.5h。(3)加入終濃度為0.5%的TritonX100，4°C放置0.5h。(4)9000rpm離心，收集上清液。(5)過柱，洗滌液充分洗滌。(6)300mmol/L咪唑系統(tǒng)洗脫。(7)洗脫液用透析膜4"C脫鹽，其間換液6次，PEG濃縮至50ml。(8)加入100U限制性凝血酶,切除誘導(dǎo)蛋白，得到較純的PNP目的蛋白。(9)加入5%蔗糖,冷凍干燥，得到酶的純品。實施列6:酶活力測定、分子改造前、后活力分析PNP酶活性測定2.9mL反應(yīng)液(32mmo1/L肌苷Inosine，80mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.7)于37。C水浴預(yù)熱3min，加入O.lml適當稀釋的酶液(0.1-lu/ml)啟動反應(yīng)，立即計時，用HPLC測定反應(yīng)液中次黃嘌呤的上升值。PNP酶活單位定義為在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生lmmol次黃嘌呤所需的酶量定義為一個酶活單位。酶熱穩(wěn)定性測定在80mmol/L磷酸鉀緩沖液、0.1%疊氮鈉溶液中加入適量酶溶液，于37"C水浴，觀察酶活力變化。表一分子改造酶活力對照表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表中結(jié)果可以看出，230位分子改造后酶的熱穩(wěn)定性有了明顯的提高。序列表SEQUENCELISTING<110>杭州利安生物科技有限公司<120>分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法<130>GenBank:BDl07242<160>2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>807<212>DNA<213>StreptococcusthermophilusIFO13957<400>1atgtcactacttgaaaaaattagagttacgcaaacctttttggaaaacaaaggaattgaa60aaacctgagtttggtttgattttgggttctggacttggagaattggctgatgagatccaa120gatgctattgtaatcgattacgcagatattccaaactgggggcaatcaacagtagtcggt180catgcaggcaaacttgtatatggtactttgtctggacgtaaggtattggctcttcaagga240cgtttccatttttatgaaggaaatcctcttgaagtggtaactttccctgtacgtgttatg300aaagctcttggttgtgaaggtgttattgtaactaatgctgctggtggtattagcttcggt360cctggtactttgatggctattactgaccatatcaatatgactggtcagaacccattgatc420ggtaaaaacttggatgactttggcccacgtttcccagatatgtctaaagcttacactcca480gcctaccgcgaaattgctcataaagtggctgataaacttggaatcaagttggaagaaggg540gtttatcttggagtaactggtccaacttatgaaactcctgctgaaattcgtgccttcaag600tcattgggggcagatgctgttggtatgtcaacagttcctgaggttatcgtcgcagcacat660tctgacttgaaagttctgggcatttcatgtatctctaactttgcagctggtttgcaagaa720gaattgaaccacgaagaagttgtagaagtaactgaacgcattaagggggacttcaaagga780ttgcttaaagctattttgtcgaaactc807<210>2<211>807<212>DNA<213>人工序列<400>2atgtcactacttgaaaaaattagagttacgcaaacctttttggaaaacaaaggaattgaa60aaacctgagtttggtttgattttgggttctggacttggagaattggctgatgagatccaa120gatgctattgtaatcgattacgcagatattccaaactgggggcaatcaacagtagtcggt180catgcaggcaaacttgtatatggtactttgtctggacgtaaggtattggctcttcaagga240cgtttccatttttatgaaggaaatcctcttgaagtggtaactttccctgtacgtgttatg300aaagctcttggttgtgaaggtgttattgtaactaatgctgctggtggtattagcttcggt360cctggtactttgatggctattactgaccatatcaatatgactggtcagaacccattgatc420ggtaaaaacttggatgactttggcccacgtttcccagatatgtctaaagcttacactcca480gcctaccgcgaaattgctcataaagtggctgataaacttggaatcaagttggaagaaggg540gtttatcttggagtaactggtccaacttatgaaactcctgctgaaattcgtgccttcaag600tcattgggggcagatgctgttggtatgtcaacagttcctgaggttatcgtcgcagcacat660tctgacttgaaagttctgggcatttcagcgatctctaactttgcagctggtttgcaagaa720gaattgaaccacgaagaagttgtagaagtaactgaacgcattaagggggacttcaaagga780ttgcttaaagctattttgtcgaaactc80權(quán)利要求1.一種分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于是嘌呤核苷磷酸化酶突變體DNA序列的表達產(chǎn)物；突變體氨基酸序列是通過使SEQIDN0.1所示的序列中230位半胱氨酸突變替換為丙氨酸，得到具有SEQIDN0.2的氨基酸序列的嘌呤核苷磷酸化酶。2.—種載體，其特征在于其含有SEQIDN0.2的氨基酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種嘌呤核苷磷酸化酶的制備方法，其特征在于，所述的載體適合于在大腸桿菌中表達。4.一種如權(quán)利要求1所述的嘌呤核苷磷酸化酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟-嘌昤核苷磷酸化酶基因序列引物設(shè)計、PCR擴增；-嘌呤核苷磷酸化酶基因片段與克隆載體的連接，得到攜帶嘌呤核苷磷酸化酶基因的重組表達載體；-基因序列230位定點突變，PCR擴增得到攜帶突變嘌呤核苷磷酸化酶基因的重組表達載體；-重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌株中，得到重組體細菌；-重組體細菌培養(yǎng)、提取得到純化的嘌呤核苷磷酸化酶。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種嘌呤核苷磷酸化酶的制備方法，其特征在于，所述的重組體細菌是重組的大腸桿菌細菌。全文摘要本發(fā)明公開了一種分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法。采用PCR技術(shù)從嗜熱乳鏈球菌(Streptococcusthermophilus)中擴增嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)全長片段，用pET-43.1b(+)質(zhì)粒載體構(gòu)成pET-43.1b(+)-PNP重組載體，用定點突變的方法將片段第230位半胱氨酸突變?yōu)楸彼?，用E.coliBL21(DE3)轉(zhuǎn)化為工程菌。將工程菌發(fā)酵培養(yǎng)、誘導(dǎo)原核細胞表達，親和層析純化重組嘌呤核苷磷酸化酶。采用本發(fā)明得到的酶，熱穩(wěn)定性得到改良，并且可以提高產(chǎn)率，還可以縮短生產(chǎn)周期、降低成本。文檔編號C12N9/12GK101629169SQ200910101440公開日2010年1月20日申請日期2009年8月6日優(yōu)先權(quán)日2009年8月6日發(fā)明者朱永良,聞樹群申請人:杭州利安生物科技有限公司