專利名稱：：通過在發(fā)酵罐中高密度培養(yǎng)真核微生物來增加含有多烯脂肪酸的脂質(zhì)的產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及培養(yǎng)微生物和回收微生物脂質(zhì)的新方法。具體地，本發(fā)明涉及生產(chǎn)微生物多不飽和脂。
背景技術(shù)：
：在真核微生物中生產(chǎn)多烯脂肪酸(含有2個或更多個不飽和碳碳鍵的脂肪酸)一般認(rèn)為需要分子氧的參與(即需氧條件)。這是因?yàn)閾?jù)認(rèn)為在所有非寄生性真核微生物的脂肪酸中形成的順式(cis)雙鍵參與直接的氧依賴型去飽和反應(yīng)(氧化微生物去飽和酶系統(tǒng))。其它已知需要分子氧的真核微生物脂質(zhì)包括真菌甾醇和植物甾醇，羥基類胡蘿卜素(oxycarotenoids)(即葉黃素)，泛醌，和從任一種這類脂質(zhì)制備的化合物(如次級代謝產(chǎn)物)。已證實(shí)某些真核微生物(如藻類；真菌，包括酵母；和原生生物)在發(fā)酵罐中可以很好地生產(chǎn)多烯脂肪酸。但是，極高密度培養(yǎng)(微生物的生物量大于100g/L,特別是商業(yè)規(guī)模的)會降低多烯脂肪酸的含量，這樣會降低多烯脂肪酸的生產(chǎn)力(productivity)。這可能部分是由于幾種因素，包括由于微生物的高濃度造成對氧的高需求，而難于維持發(fā)酵液中的溶氧水平。保持較高溶氧水平的方法包括提高通氣速率和/或采用純氧替代空氣通氣和/或提高發(fā)酵罐的攪拌速度。這些解決方法一般提高脂質(zhì)生產(chǎn)的成本和發(fā)酵設(shè)備的資金成本，而且會產(chǎn)生其它的問題。例如，在高細(xì)胞密度時增加通氣容易在發(fā)酵罐中產(chǎn)生嚴(yán)重的起泡問題，加強(qiáng)攪拌會由于發(fā)酵液中剪切力增加而導(dǎo)致微生物細(xì)胞破碎(這會導(dǎo)致脂質(zhì)釋放到發(fā)酵液中，從而被氧化和/或被酶降解)。對于正處于氮受限或耗盡以誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)從而細(xì)胞壁較弱的細(xì)胞，細(xì)胞破碎問題更為突出。結(jié)果，當(dāng)以極高細(xì)胞密度培養(yǎng)生產(chǎn)脂質(zhì)的真核微生物時，它們的脂質(zhì)通常都只含有極少量的多烯脂肪酸。例如，以醇為碳源培養(yǎng)斯達(dá)氏油脂質(zhì)酵母(丄^om少c"Warfey/)在140小時到153g/L的密度，產(chǎn)生的脂質(zhì)濃度為83g/L。但是在濃度大于100g/L時酵母的多烯脂肪酸含量平均只有總脂肪酸的4.2%(在細(xì)胞密度為20-30g/L時其含量從占總脂肪酸的11.5%開始減少)。Yamauchi等,J.Ferment.Technol.,1983，61,275-280。這樣產(chǎn)生的多烯脂肪酸濃度只有約3.5g/L,平均多烯脂肪酸生產(chǎn)力只有約0.025g/L/hr。此外，在酵母脂質(zhì)中唯一報導(dǎo)的多烯脂肪酸是C18:2。已證實(shí)另一酵母，A/zocfotorw/flg/w"m^，具有的平均脂質(zhì)生產(chǎn)力約為0.49g/L/hr，但其脂質(zhì)中多烯脂肪酸含量也較低(占全部脂肪酸的15.8%,14.7%C18:2和1.2%C18:3)，導(dǎo)致在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中多烯脂肪酸生產(chǎn)力只有約0.047g/L/hr，在連續(xù)培養(yǎng)中是0.077g/L/hr。本發(fā)明人之一以前已證實(shí)破嚢壺菌(Thraustochytriales)目的某些海洋微藻類在發(fā)酵罐中是極好的多烯脂肪酸生產(chǎn)者，特別是在低鹽，特別是極低氯化物水平培養(yǎng)時。其它有人描述了Thraustochytrids在培養(yǎng)120小時，細(xì)胞密度為59g/L時的平均多烯脂肪酸(DHA，C22:6n-3;和DHA，C22:5n-6)生產(chǎn)力約為0.158g/L/hr。但是這樣的生產(chǎn)力只能在約50%的海水鹽度下達(dá)到，這樣的濃度會嚴(yán)重腐蝕傳統(tǒng)的不銹鋼發(fā)酵罐。生產(chǎn)含多烯脂肪酸的微生物脂質(zhì)，特別是高度不飽和脂肪酸，如C18:4n-3，C20:4n-6，C20:5n3，C22:5n-3，C22:5n-6和C22:6n-3,的費(fèi)用一直較高，部分原因是含高水平多烯脂肪酸的真核微生物培養(yǎng)密度的限制和在這樣的高細(xì)胞濃度下的氧限制以及獲到高生產(chǎn)力所需的較高溫度的限制。因此，需要高濃度培養(yǎng)微生物，并同時利于提高含多烯脂肪酸的脂質(zhì)的產(chǎn)量。本發(fā)明提供了培養(yǎng)真核微生物的方法，所述微生物能產(chǎn)生至少約20%的生物量的脂質(zhì)，本發(fā)明還提供生產(chǎn)這樣的脂質(zhì)的方法。優(yōu)選這些脂質(zhì)包含一或多種多烯脂肪酸。此方法包括向含有真核微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基加入發(fā)明概述碳源，優(yōu)選是非醇碳源，和限制性營養(yǎng)源。優(yōu)選地，所述碳源和營養(yǎng)源的添加速度足以提高發(fā)酵培養(yǎng)基的生物量密度到至少約100g/L。本發(fā)明的一方面，發(fā)酵條件包括生物量密度提高階段和脂質(zhì)生產(chǎn)階段，其中所述生物量密度提高階段包括加入碳源和限制性營養(yǎng)源，所述脂質(zhì)生產(chǎn)階段包括添加碳源但不加入限制性營養(yǎng)源，以形成誘導(dǎo)脂質(zhì)產(chǎn)生的條件。本發(fā)明的另一方面，在脂質(zhì)生產(chǎn)階段的發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量低于在生物量密度提高階段的發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量。本發(fā)明的另一方面，微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細(xì)菌或其混合物，其中所述微生物能產(chǎn)生多烯脂肪酸或其它一般被認(rèn)為其合成需要氧的脂質(zhì)。本發(fā)明特別有用的微生物是能在發(fā)酵培養(yǎng)基中氧水平低于約3%的飽和度的情況下生產(chǎn)脂質(zhì)的真核微生物。本發(fā)明的另一方面，以補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式培養(yǎng)微生物。本發(fā)明的另一方面還提供了在此發(fā)酵工藝的后半部分保持發(fā)酵培養(yǎng)基中氧水平低于約3%飽和度。本發(fā)明的另一方面提供了生產(chǎn)真核微生物脂質(zhì)的方法，包括(a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)真核微生物，以便將該發(fā)酵培養(yǎng)基的生物量密度提高到至少約100g/L;(b)提供足以使所述^f鼓生物生產(chǎn)所述脂質(zhì)的發(fā)酵條件；和(c)回收所述脂質(zhì)，其中所述脂質(zhì)的多于15%是多不飽和脂。本發(fā)明的另一方面提供了回收脂質(zhì)的方法，包括(d)除去所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的水，得到干的微生物；和(e)從所述干的微生物分離所述脂質(zhì)。優(yōu)選地，所述除去水的步驟包括將所述發(fā)酵培養(yǎng)基不經(jīng)預(yù)先離心而直接與轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)接觸。本發(fā)明的另一方面提供了回收脂質(zhì)的步驟，包括(d)處理發(fā)酵液以透化，溶解，或石皮裂樣吏生物細(xì)胞；和(e)在有或沒有水溶性試劑幫助裂解脂質(zhì)/水乳劑的情況下，通過重力分離，優(yōu)選離心，回收發(fā)酵液中的脂質(zhì)。優(yōu)選地，步驟(c)中是在發(fā)酵罐或類似容器中處理微生物細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面提供了富集微生物的多烯脂肪酸含量的方法。所述方法包括存溶氧水平低于10%的生長培養(yǎng)基中發(fā)酵微生物。本發(fā)明的又一方面是生產(chǎn)產(chǎn)品和微生物的異養(yǎng)方法。該方法包括在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有聚酮化合物合成酶基因的微生物并保持培養(yǎng)液中的溶氧水平低于10%。本發(fā)明還涉及1.一種從真核微生物生產(chǎn)含有多烯脂肪酸的脂質(zhì)的方法，所述微生物能產(chǎn)生至少占其生物量約20%的脂質(zhì)，該方法包括向含有所述微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中以足以提高該發(fā)酵培養(yǎng)基生物量密度到至少約100g/L的速率加入非醇碳源和限制性營養(yǎng)源。2.項(xiàng)1的方法，其中該方法包含一個生物量密度提高階段和一個生產(chǎn)階段，其中該生物量密度提高階段包括添加所述碳源和所述限制性營養(yǎng)源，該生產(chǎn)階段包括添加所述碳源，不加或很少加入所述限制性營養(yǎng)源以誘導(dǎo)產(chǎn)生營養(yǎng)源限制性條件，該條件可誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)。3.項(xiàng)2的方法，其中在該生產(chǎn)階段發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量低于在該生物量密度提高階段的發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧量。4.項(xiàng)3的方法，其中在該生物量密度提高階段發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧量是至少約4。/0。5.項(xiàng)4的方法，其中在該生產(chǎn)階段發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧量是不到約1%。6.項(xiàng)1的方法，其中該非醇碳源包含一種碳水化合物。7.項(xiàng)1的方法，其中該限制性營養(yǎng)源選自氮源，碳源，磷酸鹽源，維生素源(如維生素B^源，泛酸鹽源，碌^胺素源)，痕量金屬源(如鋅源，銅源，鈷源，鎳源，鐵源，錳源，鉬源)，主要金屬源(如鎂源，4丐源，鈉源，鉀源)，二氧化硅源或其混合物。8.項(xiàng)7的方法，其中所述痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(如MgS04*7H20;MnCl2'4H20;ZnS04'7H20;CoCl2*6H20;Na2Mo04'2H20;CuS04'5H20;NiSO,6H20;FeS04'7H20;CaCl2;K2S04;KC1;和Na2S04)或其混合物。9.項(xiàng)1的方法，其中所述限制性營養(yǎng)源包括氮源。10.項(xiàng)9的方法，其中所述氮源包括無機(jī)銨鹽。11.項(xiàng)9的方法，其中所述氮源包括氫氧化銨。12.項(xiàng)10的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH由該限制性營養(yǎng)源控制。13.項(xiàng)1的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度至少為約2(TC。14.項(xiàng)1的方法，其中該方法以至少約0.5g/L/hr的速率產(chǎn)生脂質(zhì)。15.項(xiàng)14的方法，其中所述脂質(zhì)的至少約15%是多不飽和脂。16.項(xiàng)14的方法，其中co-3和co-6脂肪酸的總量是所述脂質(zhì)的至少約20%。17.項(xiàng)14的方法，其中所述脂質(zhì)的至少約25%是二十二碳六烯酸。18.項(xiàng)1的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細(xì)菌或其混合物，其中所述微生物能產(chǎn)生多烯脂肪酸或其它一般被認(rèn)為其合成需要氧的脂質(zhì)。19.項(xiàng)18的方法，其中所述微生物能在發(fā)酵培養(yǎng)基氧水平低于約3%的飽和度下產(chǎn)生脂質(zhì)。20.項(xiàng)18的方法，其中對所述微生物進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。21.項(xiàng)20的方法，還包括在該發(fā)酵方法的生產(chǎn)階段發(fā)酵培養(yǎng)基維持低于約3%飽和度的氧水平。22.項(xiàng)1的方法，其中所述微生物是微藻類和類藻微生物。23.項(xiàng)1的方法，其中所述微生物是Stmmenopiles。24.項(xiàng)1的方法，其中所述微生物屬于破嚢壺菌目。25.項(xiàng)1的方法，其中所述孩i生物選自破嚢壺菌屬，Sc/z/zoc/^n'wm或其混合物。26.培養(yǎng)能生產(chǎn)占其生物量的20%為脂質(zhì)的真核微生物的方法，包括向包含所述微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加碳源和限制性營養(yǎng)源，添加的速率足以提高該發(fā)酵培養(yǎng)基的生物量密度到至少約100g/L，其中該方法生產(chǎn)脂質(zhì)的速度至少平均約為0.5g/L/hr，所述微生物產(chǎn)生的總脂質(zhì)中至少約15%是多不飽和脂。27.項(xiàng)26的方法，其中該方法還包括(a)生物量密度提高階段，其中發(fā)酵培養(yǎng)基的溶氧水平至少約為4%;和(b)脂質(zhì)高產(chǎn)階段，其中發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平低于約1%。28.項(xiàng)26的方法，其中所述碳源是非醇碳源。29.項(xiàng)26的方法，其中所述限制性營養(yǎng)源選自氮源，碳源，磷酸鹽源，維生素源(如維生素B!2源，泛酸鹽源，硫胺素源)，痕量金屬源(如鋅源，銅源，鈷源，鎳源，鐵源，錳源，鉬源)，主要金屬源(如鎂源，釣源，鈉源，鉀源)，二氧化硅源或其混合物。30.項(xiàng)29的方法，其中所述痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(如MgS(V7H20;MnCl2'4H20;ZnS04'7H20;CoCl2*6H20;Na2Mo04'2H20;CuS04'5H20;NiS04'6H20;FeS04'7H20;CaCl2;K2S04;KC1;和Na2S04)或其混合物。31.項(xiàng)26的方法，其中所述限制性營養(yǎng)源包含氮源。32.項(xiàng)31的方法，其中該氮源包含無機(jī)銨鹽。33.項(xiàng)26的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細(xì)菌或其混合物，其中所述微生物能產(chǎn)生多烯脂肪酸或其它一般被認(rèn)為其合成需要氧的脂質(zhì)。34.項(xiàng)26的方法，其中所述微生物是Stramen叩iles。35.項(xiàng)26的方法，其中所述微生物是微藻類。36.項(xiàng)26的方法，其中所述微生物屬于破嚢壺菌目。37.項(xiàng)26的方法，其中所述孩史生物選自破嚢壺菌屬，&/z/zoc/z>^/wm或其混合物。38.項(xiàng)26的方法，其中所述脂質(zhì)的至少約20%是0>3和co-6脂肪酸。39.項(xiàng)26的方法，其中所述脂質(zhì)的至少約25%是二十二碳六烯酸。40.培養(yǎng)真核微生物的方法，包括向包含所述微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加碳源和限制性營養(yǎng)源，添加的速率足以提高該發(fā)酵培養(yǎng)基的生物量密度到至少約100g/L,其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細(xì)菌或其混合物，其中所述微生物能生產(chǎn)占其生物量至少約20%的包含多烯脂肪酸的脂質(zhì)。41.項(xiàng)40的方法，其中該方法以至少約為0.5g/L/hr的平均速度產(chǎn)生微生物脂質(zhì)。42.項(xiàng)41的方法，其中多于約15%的所述脂質(zhì)是多不飽和脂。43.項(xiàng)41的方法，其中co-3和co-6多不飽和脂肪酸的總量是所述脂質(zhì)的至少約20%。44.項(xiàng)41的方法，其中所述脂質(zhì)的至少約25%是二十二碳六烯酸。45.項(xiàng)40的方法，其中該方法以至少約0.2g/L/hr的平均速度產(chǎn)生二十二碳六烯酸。46.項(xiàng)40的方法，其中所述碳源不是一種醇。47.項(xiàng)46的方法，其中所述碳源是碳水化合物。48.項(xiàng)40的方法，其中所述限制性營養(yǎng)源選自氮源，碳源，磷酸鹽源，維生素源(如維生素B,2源，泛酸鹽源，>琉胺素源)，痕量金屬源(如鋅源，銅源，鈷源，鎳源，鐵源，錳源，鉬源)，主要金屬源(如鎂源，鈣源，鈉源，鉀源)，二氧化硅源或其混合物。49.項(xiàng)48的方法，其中所述痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(如MgS04*7H20;MnCl2*4H20;ZnS04'7H20;CoCl2*6H20;Na2Mo04'2H20;CuS04'5H20;NiSCV6H20;FeS04'7H20;CaCl2;K2S04;KC1;和Na2S04)或其混合物。50.項(xiàng)40的方法，其中限制性營養(yǎng)源包括氮源。51.項(xiàng)50的方法，其中所述氮源包括無機(jī)銨鹽。52.項(xiàng)40的方法，其中所述氮源包括氫氧化銨。53.項(xiàng)40的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細(xì)菌或其混合物，其中所述微生物能產(chǎn)生多烯脂肪酸或其它一般被認(rèn)為其合成需要氧的脂質(zhì)。54.項(xiàng)40的方法，其中所述微生物是微藻類和類藻微生物。55.項(xiàng)40的方法，其中所述微生物是Stramenopiles。56.—種生產(chǎn)真核微生物脂質(zhì)的方法，包括(a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)真核微生物以便將該發(fā)酵培養(yǎng)基的生物量密度提高到100g/L;(b)提供足以使所述微生物生產(chǎn)所述脂質(zhì)的發(fā)酵條件；和(c)回收所述脂質(zhì)，其中所述脂質(zhì)的多于約15%是多不飽和脂。57.項(xiàng)56的方法，其中在所述微生物的生長階段所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平高于生產(chǎn)所述脂質(zhì)的階段的發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平。58.項(xiàng)56的方法，其中在微生物生長階段的發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧水平至少約為4%。59.項(xiàng)56的方法，其中在生產(chǎn)脂質(zhì)階段的發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧水平低于約1%。60.項(xiàng)56的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細(xì)菌或其混合物，其中所述微生物能產(chǎn)生多烯脂肪酸或其它一般被認(rèn)為其合成需要氧的脂質(zhì)。61.項(xiàng)56的方法，其中所述樣么生物是Stramenopiles。62.項(xiàng)56的方法，其中所述微生物是微藻類和類藻微生物。63.項(xiàng)56的方法，其中所述微生物屬于破嚢壺菌目。64.項(xiàng)56的方法，其中所述微生物選自石皮囊壺菌屬，5b/2/zoc/z盧n'w"或其混合物。65.項(xiàng)56的方法，其中是co-3和(D-6脂肪酸的總量是所述微生物脂質(zhì)的至少約20%。66.項(xiàng)56的方法，其中所述微生物脂質(zhì)的至少約25%是二十二碳六烯酸。67.項(xiàng)56的方法，其中所述方法產(chǎn)生二十二碳六烯酸的平均速度至少約為0.2g/L/hr。68.項(xiàng)56的方法，其中所述脂質(zhì)回收步驟包括(d)除去所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的水，得到干的微生物；和(e)從所述干的微生物分離脂質(zhì)。69.項(xiàng)68的方法，其中所述除去水的步驟包括將所述發(fā)酵培養(yǎng)基不經(jīng)預(yù)先離心而直接與轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)接觸。70.項(xiàng)56的方法，其中所述回收脂質(zhì)的步驟包括(d)處理發(fā)酵液以透化，溶解，或;皮裂纟鼓生物細(xì)胞；和(e)在有或沒有試劑幫助裂解脂質(zhì)/水乳劑的情況下，通過重力分離來回收發(fā)酵液中的脂質(zhì)。71.項(xiàng)70的方法，其中在步驟(d)中是在發(fā)酵罐或類似容器中處理微生物纟田月包。72.項(xiàng)70的方法，其中所述重力分離包括離心。73.項(xiàng)56的方法，其中所述微生物培養(yǎng)階段包括添加碳源和限制性營養(yǎng)源。74.項(xiàng)73的方法，其中所述碳源并非醇類。75.項(xiàng)74的方法，其中所述碳源包括一種碳水化合物。76.項(xiàng)73的方法，其中所述限制性營養(yǎng)源選自氮源，碳源，磷酸鹽源，維生素源(如維生素Bu源，泛酸鹽源，碌b胺素源)，痕量金屬源(如鋅源，銅源，鈷源，鎳源，鐵源，錳源，鉬源)，主要金屬源(如鎂源，鈣源，鈉源，鉀源)，二氧化硅源或其混合物。77.項(xiàng)76的方法，其中所述痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(如MgSCV7H20;MnCl2'4H20;ZnS04*7H20;CoCl2'6H20;Na2Mo04'2H20;CuS04'5H20;NiS04'6H20;FeS04*7H20;CaCl2;K2S04;KC1;和Na2S04)或其混合物。78.項(xiàng)73的方法，其中限制性營養(yǎng)源包括氮源。79.項(xiàng)78的方法，其中所述氮源包括無機(jī)銨鹽。80.項(xiàng)78的方法，其中所述氮源包括氫氧化銨。81.—種生產(chǎn)真核微生物脂質(zhì)的方法，包括(a)向包含所述微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入非醇碳源和限制性營養(yǎng)源；(b)提供足以使所述微生物生產(chǎn)所述微生物脂質(zhì)的條件；和(c)回收所述微生物脂質(zhì)，其中所述微生物脂質(zhì)的至少約15%為多不飽和脂。82.項(xiàng)81的方法，其中在生物量密度提高階段的發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧水平高于脂質(zhì)生產(chǎn)階段發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平。83.項(xiàng)81的方法，其中在生物量密度提高階段的發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧水平至少約為4%。84.項(xiàng)81的方法，其中在脂質(zhì)生產(chǎn)階段的發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧水平約為1%或更低。85.項(xiàng)81的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細(xì)菌或其混合物。86.項(xiàng)81的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細(xì)菌或其混合物，且其中所述微生物能產(chǎn)生多烯脂肪酸或其它一般被認(rèn)為其合成需要氧的脂質(zhì)。87.項(xiàng)81的方法，其中所述微生物是Stramenopiles。88.項(xiàng)81的方法，其中所述微生物是微藻類和類藻微生物。89.項(xiàng)81的方法，其中所述微生物屬于破嚢壺菌目。90.項(xiàng)81的方法，其中所述微生物選自破嚢壺菌屬，5b/H'zoc/7"n'wm或其混合物。91.項(xiàng)81的方法，其中該方法以至少約為0.5g/L/hr的平均速度產(chǎn)生微生物脂質(zhì)。92.項(xiàng)91的方法，其中co-3和co-6脂肪酸的總量是所述微生物脂質(zhì)的至少約20%。93.項(xiàng)81的方法，其中所述脂質(zhì)的至少約25%是二十二碳六烯酸。94.項(xiàng)81的方法，其中該方法以至少約0.2g/L/hr的平均速度產(chǎn)生二十二碳六烯酸。95.項(xiàng)58的方法，其中所述脂質(zhì)回收步驟包括(d)除去所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的水，得到干的微生物；和(e)從所述干的微生物分離脂質(zhì)。96.項(xiàng)95的方法，其中所述除去水的步驟包括將所述發(fā)酵培養(yǎng)基不經(jīng)預(yù)先離心而蒸發(fā)去水。97.項(xiàng)81的方法，其中所述回收脂質(zhì)的步驟包括(d)處理發(fā)酵液以透化，溶解，或破裂^[效生物細(xì)胞；和(e)在有或沒有試劑幫助裂解脂質(zhì)/水乳劑的情況下，通過重力分離而回收發(fā)酵液中的脂質(zhì)。98.項(xiàng)97的方法，其中在步驟(d)中是在發(fā)酵罐或類似容器中處理微生物細(xì)月包。99.項(xiàng)97的方法，其中所述重力分離包括離心。100.項(xiàng)81的方法，其中所述非醇碳源包括碳水化合物。101.項(xiàng)81的方法，其中所述限制性營養(yǎng)源選自氮源，碳源，磷酸鹽源，維生素源(如維生素B!2源，泛酸鹽源，硫胺素源)，痕量金屬源(如鋅源，銅源，鈷源，鎳源，鐵源，錳源，鉬源)，主要金屬源(如鎂源，鈣源，鈉源，鉀源)，二氧化硅源或其混合物。102.項(xiàng)101的方法，其中所述痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(如MgS04'7H20;MnCl2*4H20;ZnS04*7H20;CoCl2*6H20;Na2MoO,2H20;CuS04'5H20;NiS04'6H20;FeS04'7H20;CaCl2;K2S04;KC1;和Na2S04)或其混合物。103.項(xiàng)81的方法，其中限制性營養(yǎng)源包括氮源。104.項(xiàng)103的方法，其中所述氮源包括無機(jī)銨鹽。105.項(xiàng)103的方法，其中所述氮源包括氫氧化銨。106.—種生產(chǎn)真核微生物脂質(zhì)的方法，包括(a)在含有真核微生物的發(fā)醇培養(yǎng)基中添加碳源和限制性營養(yǎng)源，并提供足以將該發(fā)醇培養(yǎng)基中溶氧水平維持在至少約4%的條件，以便產(chǎn)生至少約100g/L的生物量密度；(b)提供足以將該發(fā)醇培養(yǎng)基中溶氧水平維持在約1%或更低水平的條件，并提供足以使所述微生物生產(chǎn)所述脂質(zhì)的發(fā)酵條件；和(c)回收所述脂質(zhì)，其中所述微生物脂質(zhì)的至少約15%是多不飽和脂。107.項(xiàng)106的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細(xì)菌或其混合物。108.項(xiàng)106的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細(xì)菌或其混合物，且其中所述微生物能產(chǎn)生多烯脂肪酸或其它一般被認(rèn)為其合成需要氧的脂質(zhì)。109.項(xiàng)106的方法，其中所述孩么生物是Stramenopiles。110.項(xiàng)106的方法，其中所述微生物是微藻類和類藻微生物。111.項(xiàng)106的方法，其中所述微生物屬于破嚢壺菌目。112.項(xiàng)106的方法，其中所述樣i生物選自破嚢壺菌屬，Sc/n'zoc/^fn'wm或其混合物。113.項(xiàng)106的方法，其中所述微生物脂質(zhì)的至少約20%是00-3和/或co-6脂肪酸。114.項(xiàng)106的方法，其中所述微生物脂質(zhì)的至少約25%是二十二碳六烯酸。115.項(xiàng)106的方法，其中該方法以至少約0.2g/L/hr的平均速度產(chǎn)生二十二碳六烯酸。116.項(xiàng)106的方法，其中所述脂質(zhì)回收步驟包括(d)除去所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的水，得到千的微生物；和(e)從所述干的微生物分離脂質(zhì)。117.項(xiàng)116的方法，其中所述除去水的步驟包括將所述發(fā)酵培養(yǎng)基不經(jīng)預(yù)先離心而直接蒸發(fā)去水。118.項(xiàng)106的方法，其中所述回收脂質(zhì)的步驟包括(d)處理發(fā)酵液以透化，溶解，或破裂微生物細(xì)胞；和(e)在有或沒有試劑幫助裂解脂質(zhì)/水乳劑的情況下，通過重力分離而回收發(fā)酵液中的脂質(zhì)。119.項(xiàng)106的方法，其中在步驟(d)中是在發(fā)酵罐或類似容器中處理微生物細(xì)月包。120.項(xiàng)118的方法，其中所述重力分離包括離心。121.—種富集微生物的多烯脂肪酸含量的方法，包括在溶氧水平低于10%的生長培養(yǎng)基中發(fā)酵所述微生物。122.項(xiàng)121的方法，其中的溶氧水平低于5%。123.項(xiàng)121的方法，其中的溶氧水平低于1%。124.項(xiàng)121的方法，其中在開始的生長階段，溶氧水平高于10%,在隨后的生產(chǎn)階段，溶氧水平低于10%。125.項(xiàng)121的方法，其中所述微生物包括聚酮化合物合成酶基因。126.—種生產(chǎn)產(chǎn)物和微生物的異養(yǎng)方法，包括b.在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，所述微生物中包含聚酮化合物合成酶基因；和b.保持溶氧水平低于10%。127.項(xiàng)126的方法，其中所述溶氧水平低于約5%。128.項(xiàng)126的方法，其中所述溶氧水平低于約1%。129.項(xiàng)126的方法，其中所述聚酮化合物合成酶基因天然產(chǎn)生于所述微生物中。130.項(xiàng)126的方法，其中所述聚酮化合物合成酶基因是通過基因工程引入到所述微生物中的。131.項(xiàng)126的方法，其中在生長的開始階段，溶氧水平高于10%，在隨后的生產(chǎn)階段，溶氧水平約低于10%。圖1是微生物的各種脂質(zhì)生產(chǎn)參數(shù)對發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧量的表和圖。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了培養(yǎng)微生物，例如藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，和細(xì)菌的方法。優(yōu)選地，微生物選自藻類，原生生物，細(xì)菌或其混合物。更優(yōu)選地，微生物是藻類。而且，本發(fā)明方法可用于生產(chǎn)各種脂質(zhì)化合物，尤其是不飽和脂質(zhì)，優(yōu)選多不飽和脂(即含有至少2個不飽和碳-碳鍵，例如雙鍵，的脂質(zhì))，更優(yōu)選高度不飽和脂(即含有4個或更多個不飽和碳-碳鍵的脂質(zhì))如ro-3和/或co-6多不飽和脂肪酸，包括二十二碳六烯酸(即DHA);和其它天然的不飽和，多不飽和及高度不飽和化合物。本文中術(shù)語"脂質(zhì)"包括磷脂；游離脂肪酸；脂肪酸的酯；三?；视?；甾醇和甾醇酯；類胡羅卜素；葉黃素(例如羥基類胡蘿卜素)；烴；類異戊二烯衍生的化合物和本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其它脂質(zhì)。更具體地，本發(fā)明方法可用于生產(chǎn)真核微生物多烯脂肪酸，類胡蘿卜素，真菌甾醇，植物甾醇，葉黃素，泛醌，和通常認(rèn)為需要氧來產(chǎn)生不飽和碳-碳鍵(即通氣條件)的其它類異戊二烯衍生的化合物，和其次級代謝產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明方法可用于培養(yǎng)生產(chǎn)多烯脂肪酸的微生物，并用于生產(chǎn)微生物多烯脂肪酸(類)。本發(fā)明的方法可用于培養(yǎng)許多微生物并得到由其產(chǎn)生的包含多不飽和脂的化合物，但為了簡潔，便利和說明，此發(fā)明詳述將討論培養(yǎng)能產(chǎn)生含有-3和/或co-6多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)的微生物，尤其能產(chǎn)生DHA(或密切相關(guān)的化合物如DPA，EPA或ARA)的微生物的方法。優(yōu)選的孩i生物包括微藻類，真菌(包括酵母)，原生生物和細(xì)菌。優(yōu)選的一組微生物是稱為Stramenopiles的成員，包括微藻類和類藻微生物。Stramenopiles包括下列微生物Hamatores,Proteromonads，Opalines,Developayelle,Diplophrys,Labrinthulids，Thraustochytrids,Biosecids,卵菌纟岡(Oomycetes)，Hypochytridiomycetes，Commation，Reticulosphaera,Pelagomonas，Pelagococcus，Ollicola，Aureococcus,Parmales，娃藻屬(Diatoms),黃藻(Xanthophytes),Phaeophytes(褐藻)，Eustigmatophytes,Raphidophytes,Synurids,Axodines(包才舌Rhizochromulinaales,Pedinellales,Dictyochales),Chrysomeridales,Sarcinochrysidales，Hydrurales，Hibberdiales,和Chromulinales。其它優(yōu)選的微藻類包括綠藻和腰鞭毛目(dinoflagellates)，包括O7/^ec0AMm屬的成員。更具體地，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案參照培養(yǎng)海洋微生物的方法進(jìn)行討論，所述海洋微生物尤其是藻類，例如破嚢壺菌目的Thraustochytrids,更尤其是破嚢壺菌屬(772rawWoc/zj^n^m)的破嚢壺菌(Thraustochytriales)以及Sc/z/zoc/z;^7Ywz屬，包4奮在共同壽爭讓的美國專利5340594和5340742(兩者授權(quán)于Barclay,都全文引入作為參考)中公開的破嚢壺菌。應(yīng)注意，許多專家同意Ulkenia不是一個單獨(dú)的屬，實(shí)際是Sc/n'zoc/z;^r/Mw屬的一邢分。在本文中,Sc/z/zoc/zjvtn'wm屬包括L7fem'a。優(yōu)選的微生物是那些可通過聚酮化合物合成酶系統(tǒng)產(chǎn)生目的化合物的微生物。這樣的微生物包括具有內(nèi)源的聚酮化合物合成酶系統(tǒng)的微生物以及已通過基因工程導(dǎo)入聚酮化合物合成酶系統(tǒng)的^f效生物。聚酮化合物是結(jié)構(gòu)多樣的天然產(chǎn)物，具有多種生物活性，包括抗生素和藥物學(xué)特性。聚酮化合物合成酶催化聚酮化合物碳鏈骨架的生物合成。象結(jié)構(gòu)和機(jī)理相關(guān)的脂肪酸合成酶，聚酮化合物合成酶催化?；虼狨ブg的重復(fù)的脫羧縮合，一次可以使碳鏈延長兩個碳原子。但是，與脂肪酸合成酶不同，聚酮化合物合成酶能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)具有很大差異的終產(chǎn)物。單個聚酮化合物合成酶系統(tǒng)可如下實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)利用非乙酸酯的起始單元，利用甲基或乙基丙二酸酯作為延伸單位，和改變每次縮合所得(3-酮基的酮還原、脫水和烯?；€原反應(yīng)的還原周期(cycle)。本文特別感興趣的是脫水步驟導(dǎo)入的碳-碳雙鍵在終產(chǎn)物中可保持。此外，盡管這些雙鍵開始是反式構(gòu)型，通過酶促異構(gòu)化作用在DHA(和其它目的多烯脂肪酸)中可轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖?。脫水酶和異?gòu)化反應(yīng)都可在缺乏分子氧的情況下出現(xiàn)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了異養(yǎng)方法用于產(chǎn)生產(chǎn)品和微生物。此方法優(yōu)選包括在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，所述微生物中包含了聚酮化合物合成酶系統(tǒng)。優(yōu)選地，保持溶氧水平低于約8%,更優(yōu)選低于約4%，更優(yōu)選低于約3%，更優(yōu)選低于約1%。但是應(yīng)理解地是，本發(fā)明作為一個整體并非要進(jìn)行這樣的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到根據(jù)本發(fā)明的方法可用于其它微生物生產(chǎn)多種其它化合物，包括其它脂質(zhì)化合物。假定某種藻類有相對恒定的生產(chǎn)脂質(zhì)的速度，顯然較高的生物量密度能使單位體積生產(chǎn)的脂質(zhì)總量更多。當(dāng)今傳統(tǒng)的培養(yǎng)藻類的發(fā)酵方法產(chǎn)生的生物量密度為約50到約80g/L或更少。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過采用本發(fā)明方法，可以得到比現(xiàn)有已知生物量密度顯著提高的生物量密度。優(yōu)選地，本發(fā)明生產(chǎn)的生物量密度為至少約100g/L,更優(yōu)選至少約130g/L，還優(yōu)選至少約150g/L,還優(yōu)選至少約170g/L，最優(yōu)選至少約200g/L。因此，有了這樣高的生物量，即使藻類的脂質(zhì)生產(chǎn)率稍稍降低，單位體積的脂質(zhì)總產(chǎn)量也會顯著高于現(xiàn)有方法。本發(fā)明培養(yǎng)破嚢壺菌目微生物的方法包括向包含微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入碳源和限制性營養(yǎng)源，其加入速度足以提高發(fā)酵培養(yǎng)基的生物量密度到上述水平。此處，"限制性營養(yǎng)源"指微生物生長所必需的營養(yǎng)來源(包括營養(yǎng)物本身)，當(dāng)生長培養(yǎng)基中限制性營養(yǎng)耗盡時，它的缺乏會大大抑制微生物的進(jìn)一步生長或復(fù)制。但是，由于其它營養(yǎng)物質(zhì)還很豐富，所述生物會繼續(xù)制造和累積胞內(nèi)和/或胞外產(chǎn)物。通過選擇特異性的限制性營養(yǎng)物，可以控制積累產(chǎn)物的類型。因此，以一定的速度提供限制性營養(yǎng)源，可以控制微生物的生長速度和所需產(chǎn)物(例如脂質(zhì))的生產(chǎn)或積累。這種發(fā)酵過程由于將一或多種底物(例如碳源和限制性營養(yǎng)源)增量加入，而通常稱為補(bǔ)料分批發(fā)酵過程。已發(fā)現(xiàn)在分批發(fā)酵過程中加入底物時，大量的碳源(例如每60g/L生物量約200g/L或更高密度)對微生物有不利影響。不受任何理論的限制，認(rèn)為這樣大量的碳源會對微生物產(chǎn)生有害影響，包括滲透壓，并抑制微生物的初始生產(chǎn)力。本發(fā)明方法避免了這種不需要的有害影響，同時提供了足以使所述微生物達(dá)到上述生物量密度的底物量。本發(fā)明的培養(yǎng)微生物的方法包括生物量密度的提高階段。在此階段，發(fā)酵過程的主要目的是提高發(fā)酵培養(yǎng)基中的生物量密度以得到上述的生物量密度。加入碳源的速度一般保持在不對微生物的生產(chǎn)力，或微生物的活力產(chǎn)生顯著有害影響的特定水平或范圍，所述有害影響是由于發(fā)酵設(shè)備除熱和對培養(yǎng)液輸入或輸出氣體的能力不足而導(dǎo)致的。具體微生物在發(fā)酵過程所需的碳源量的合適范圍為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。優(yōu)選地，本發(fā)明的碳源是非醇碳源，即不包含醇的碳源。此處，"醇"指具有4個或更少的帶有一個羥基的碳原子，例如曱醇，乙醇和異丙醇，但是為了本發(fā)明的目的不包括羥基有機(jī)酸如乳酸和類似的化合物。更優(yōu)選地，本發(fā)明的碳源是碳水化合物，包括，但不限于果糖，葡萄糖，蔗糖，糖蜜，和淀粉。其它合適的單純和復(fù)合碳源和氮源公開在上述參考的專利中。但是典型地，碳水化合物，優(yōu)選玉米糖漿用作主要的碳源。脂肪酸，羥基形式的脂肪酸，三酸甘油酯，和雙-和單-酸甘油酯也可用作^暖源。特別優(yōu)選的氮源是尿素，硝酸鹽，亞硝酸鹽，大豆蛋白，氨基酸，蛋白質(zhì)，玉米漿，酵母提取物，動物性副產(chǎn)物，無機(jī)銨鹽，更優(yōu)選硫酸銨，氫氧化銨，最優(yōu)選氫氧化銨。其它限制性營養(yǎng)源包括碳源(如上定義)，磷酸鹽源，維生素源(如維生素B!2源，泛酸鹽源，硫胺素源)，痕量金屬源(如鋅源，銅源，鈷源，鎳源，鐵源，錳源，鉬源)，主要金屬源(如鎂源，4丐源，鈉源，鉀源，和二氧化硅源等)。痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(例如MgS04*7H20;MnCl2'4H20;ZnS04*7H20;CoCl6H20;Na2Mo04，2H20;CuS04'5H20;NiS04'6H20;FeS04*7H20;CaCl2;K2S04;KC1;和Na2S04)。當(dāng)銨用作氮源時，如不加堿或不用緩沖液控制，發(fā)酵培養(yǎng)基會變酸。當(dāng)氫氧化銨用作主要的氮源時，它也可用于控制pH。破嚢壺菌目微生物，尤其破嚢壺菌屬的破嚢壺菌和5"c/zz'zoc/z聲n'ww屬可在較寬pH范圍內(nèi)生長，例如從約pH5到約pHll。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解具體微生物發(fā)酵的合適pH范圍。本發(fā)明培養(yǎng)微生物的方法還包括生產(chǎn)階段。在此階段，微生物利用底物的主要用途不是提高生物量密度，而是利用該底物生產(chǎn)脂質(zhì)。應(yīng)理解地是在生物量密度提高階段微生物也產(chǎn)生脂質(zhì)；但是，如上所述，在生物量密度提高階段的主要目的是提高生物量密度。一般地，在生產(chǎn)階段，減少或優(yōu)選停止添加限制性營養(yǎng)底物。以前一般認(rèn)為在利用真核微生物生產(chǎn)多不飽和化合物，包括co-3和/或①-6多不飽和脂肪酸時，發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧的存在是至關(guān)重要的。因此，通常認(rèn)為發(fā)酵培養(yǎng)基中優(yōu)選溶氧水平相對較高。但是，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)階段當(dāng)溶氧水平降低時脂質(zhì)的生產(chǎn)速率顯著提高。因此，在生物量密度提高階段發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平優(yōu)選至少約8%的飽和度，優(yōu)選至少4%的飽和度，而在產(chǎn)生階段發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平減少到約3%的飽和度或更少，優(yōu)選約1%飽和度或更少，更優(yōu)選0%飽和度。在發(fā)酵開始時，DO值可以為或接近飽和，當(dāng)微生物生長時可使DO值降低至這些低DO設(shè)定值。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，發(fā)酵期間發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量有變化。例如，對于總發(fā)酵時間為從約90小時到約100小時的一個發(fā)酵過程，發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平在前24小時保持在約8%，在約第24小時到約第40小時約為4%，從第40小時到發(fā)酵過程終止約為0.5%或更少?？赏ㄟ^控制發(fā)酵罐頂部空間中的氧量來控制發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量，或優(yōu)選通過控制發(fā)酵培養(yǎng)基的搖動(或攪拌)速度來控制。例如，高的搖動(或攪拌)速度會比低搖動速度在發(fā)醇培養(yǎng)基中產(chǎn)生相對更高的溶氧水平。例如，在約14,000加侖容量的發(fā)酵罐中，搖動速度設(shè)定為前12小時約50rpm到約70rpm，約第12小時到18小時約55rpm到約80rpm，約第18小時到發(fā)酵過程終止為約70rpm到約90rpm,以獲得上述總發(fā)酵時間約90到約100小時的發(fā)酵過程所具有的溶氧水平。獲得發(fā)醇培養(yǎng)基中特定溶氧量所需攪拌速度的特定范圍是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠決定的。本發(fā)明方法的優(yōu)選溫度是至少約2(TC,更優(yōu)選約25。C，最優(yōu)選至少約30°C。應(yīng)理解地是，冷水比熱水更能保持較高的溶氧量。因此，較高的發(fā)酵培養(yǎng)基溫度具有降低溶氧量的額外的好處，這是如上所述特別需要的。某些微生物可能需要在發(fā)酵培養(yǎng)基中有一定量的礦物鹽。這些礦物鹽，特別是氯離子，能腐蝕發(fā)酵罐和其它下游處理設(shè)備。為防止或降低在發(fā)酵培養(yǎng)基中相對大量氯離子的存在的這些不需要的影響，本發(fā)明方法還包括使用不含氯的鈉鹽，優(yōu)選硫酸鈉，作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的鈉源。更具體地，發(fā)酵中絕大部分鈉需求以不含氯的鈉鹽形式提供。例如，在發(fā)酵培養(yǎng)基中少于約75%的鈉鹽以氯化鈉的形式提供，更優(yōu)選少于約50%,更優(yōu)選少于25%。本發(fā)明的微生物可在氯濃度低于約3g/L時生長，優(yōu)選少于約500mg/L,更優(yōu)選低于250mg/L，更優(yōu)選在約60mg/L到約120mg/L之間。不含氯的鈉鹽可包括蘇打灰(碳酸鈉和氧化鈉的混合物)，碳酸鈉，碳酸氬鈉，硫酸鈉及其混合物，優(yōu)選包括硫酸鈉。蘇打灰，碳酸鈉，碳酸氫鈉將會提高發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，因此需要控制步驟以維持培養(yǎng)基的正確的pH。硫酸鈉的濃度有效地符合微生物的鹽度要求，優(yōu)選鈉濃度(表示為g/L的鈉)至少約為lg/L,更優(yōu)選為lg/L到約50g/L,更優(yōu)選為約2g/L到約25g/L。接種，培養(yǎng)，和回收微生物的各種發(fā)酵參數(shù)，詳述于美國專利5130242,其全文引入作為參考。任何現(xiàn)今分離方法可用于從發(fā)酵培養(yǎng)基分離微生物，包括離心，過濾，超濾，傾析，和溶劑蒸發(fā)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于本發(fā)明的方法產(chǎn)生如此高的生物量密度，當(dāng)采用離心回收微生物時，優(yōu)選加入水稀釋發(fā)酵培養(yǎng)基以降低生物量密度，從而能更有效的從發(fā)酵培養(yǎng)基分離微生物。本發(fā)明中獲得的極高生物量密度也便于回收微生物脂質(zhì)的"無溶劑，，方法。2000年1月19日提交的題為"無溶劑提取方法"的美國臨時專利申請60/177,125、2001年1月19日提交的題為"無溶劑提取方法"的美國專利申請Q9〃66,50Q(現(xiàn)為U.S.LettersPatentNo.6,750,048,2004年6月15曰授&和2001年1月19日提交的題為"無溶劑提取方法"的PCT專利申請PCT/USO1/001806(皆全文引入作為參考)，都記述了在發(fā)酵罐中裂解細(xì)胞的優(yōu)選方法。優(yōu)選的在細(xì)胞于發(fā)酵罐中透化，破碎或裂解后回收脂質(zhì)的方法(它可使脂質(zhì)乳劑裂解，并回收富含脂質(zhì)的級分)，包括WO96/05278公開的脫油方法，其全文引入作為參考。在此方法中，在油/水乳液中加入水溶性化合物，例如醇或丙酮，以裂解乳液，所得混合物通過重力分離技術(shù)，例如離心來分離。此方法經(jīng)改良后也可以用其它試劑(水和/或脂溶性的試劑)裂解乳液。備選地，通過使發(fā)酵培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，例如使發(fā)酵培養(yǎng)基直接接觸干燥設(shè)備如轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)(即沒有，例如通過離心來預(yù)先濃縮)，而從培養(yǎng)基回收干(dry)的微生物，即一種直接的轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)回收方法。當(dāng)采用直接轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)回收方法分離微生物時，一般采用蒸汽加熱式轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)。此外當(dāng)采用直接轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)回收方法時，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的生物量密度優(yōu)選至少約130g/L,更優(yōu)選至少約150g/L，最優(yōu)選至少約180g/L。這種高生物量密度通常是直接轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)回收方法所希望的，因?yàn)樯锪棵芏鹊蜁r所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有的水分足以使轉(zhuǎn)鼓明顯冷卻，使微生物不能徹底干燥。其它干燥細(xì)胞的方法，包括噴霧干燥，已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明的方法提供至少約0.5g/L/hr的平均脂質(zhì)生產(chǎn)速度，優(yōu)選至少約0.7g/L/hr,更優(yōu)選至少約0.9g/L/hr,最優(yōu)選1.0g/L/hr。而且，本發(fā)明方法生產(chǎn)的脂質(zhì)包含約15%以上的多不飽和脂，優(yōu)選約20%以上，更優(yōu)選約25%以上，還優(yōu)選約30%以上，最優(yōu)選約35%以上。可從干孩么生物或發(fā)酵培養(yǎng)基中的微生物回收脂質(zhì)。通常，本發(fā)明方法中由微生物產(chǎn)生的脂質(zhì)至少約20%是-3和/或co-6多不飽和脂肪酸，優(yōu)選至少約30%的脂質(zhì)是-3和/或co-6多不飽和脂肪酸，更優(yōu)選至少約40%的脂質(zhì)是co-3和/或co-6多不飽和脂肪酸，最優(yōu)選至少約50%的脂質(zhì)是0>3和/或co-6多不飽和脂肪酸?；蛘撸景l(fā)明方法的-3脂肪酸(例如DHA)平均產(chǎn)生速度為至少約0.2go>3脂肪酸(例如DHA)/L/hr,優(yōu)選至少約0.3go>3脂肪酸(例如DHA)/L/hr，更優(yōu)選至少約0.4gco-3脂肪酸(例如DHA)/L/hr，最優(yōu)選至少約0,5gco-3脂肪酸(例如DHA)/L/hr。或者，本發(fā)明方法的cd-6脂肪酸(例如DPAn-6)平均產(chǎn)生速度為至少約0.07gco-6脂肪酸(例如DPAn-6)/L/hr，優(yōu)選至少約O.lgco-6脂肪酸(例如DPAn-6)/L/hr,更優(yōu)選至少約0.13gco-6脂肪酸(例如DPAn-6)/L/hr，最優(yōu)選至少約0.17gco-6脂肪酸(例如DPAn-6)/L/hr。還備選地，至少約25%的脂質(zhì)是DHA(基于總脂肪酸曱基酯)，優(yōu)選至少約30%，更優(yōu)選至少約35%，最優(yōu)選至少約40%。從中提取了脂質(zhì)的微生物，在提取脂質(zhì)之后所剩的生物量或其混合物可直接用作食品成分，例如飲料，調(diào)味汁，乳制品(例如乳，酸乳酪，干酪和冰淇淋)和烤制的食品的成分；營養(yǎng)添加劑(膠嚢或片劑形式中)；其肉或產(chǎn)品為人所消費(fèi)的任何動物的飼料或飼料添加劑；食品添加劑，包括幼兒食品和嬰兒乳粉；藥品(在直接或附屬的治療應(yīng)用中)。術(shù)語"動物"指屬于動物界的任何生物，包括但不限于可得到家禽肉，海產(chǎn)食品，牛肉，豬肉或羊肉的任何動物。海產(chǎn)食品得自但不限于魚，奸，曱殼類動物。術(shù)語"產(chǎn)品"包括除了這類動物的肉以外的任何產(chǎn)品，包括但不限于蛋，乳或其它產(chǎn)品。當(dāng)伺喂這樣的動物時，多不飽和脂能被引入到這些動物的肉，乳，蛋或其它產(chǎn)品中以^提高它們中這些脂質(zhì)的含量。在了解了下面的實(shí)施例后，本發(fā)明的其它目的，優(yōu)勢和新的特點(diǎn)對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員是顯而易見的，這些實(shí)施例并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實(shí)施例在較寬范圍的各種發(fā)酵條件下，這些實(shí)施例所用的5"c/^oc/^n'wm菌抹產(chǎn)生兩種主要的多烯酸，DHAn-3和DPAn-6，比例一^:為3:1，還有少量的其它多烯酸，如EPA和C20:3。因此，當(dāng)下列實(shí)施例^l列出了DHA的量時，可以采用上述的比例容易地計(jì)算出產(chǎn)生的DPA(n-6)的量。實(shí)施例1本實(shí)施例舉例說明發(fā)酵培養(yǎng)基中氧含量對脂質(zhì)生產(chǎn)力的影響。斥企測了在各種溶氧水平下Sc/n:zoc/^Www菌抹ATCC20888的發(fā)酵結(jié)果。該結(jié)果見圖1,其中RCS是蔗糖的殘余濃度，DCW是細(xì)胞干重。實(shí)施例2本實(shí)施例也舉例說明發(fā)酵培養(yǎng)基中低溶氧水平對最終生物量產(chǎn)物中DHA含量(％干重)的影響。在250ml的Erlenmeyer燒瓶中進(jìn)行"按比例縮小(scale-down)"實(shí)驗(yàn)以模擬在大規(guī)模發(fā)酵罐中培養(yǎng)5b/^oc/z盧n'ww細(xì)胞時低氧量對DHA含量的影響。在04-4培養(yǎng)基中培養(yǎng)Sc//zoc/^n'wm菌才朱(ATCC20888)。該培養(yǎng)基由每升去離子水中溶解的如下物質(zhì)組成Na2S0412.61g;MgS04'7H201.2g;KC10.25g;CaCl20.05g;谷氨酸單鈉7.0g;葡萄糖10g;KH2P040.5g;NaHC03O.lg;酵母提取物O.lg;混合維生素l.OmL;PII金屬l.OOmL。PII金屬混合物含有(每升)6.0gNa2EDTA，0.29gFeCI3'6H20，6.84gH3B03,0.86gMnCl2'4H20,0.06gZnCl2，0.026gCoCl2'6H20，0.052gNiS04*H20，0.002gCuS04'H20,和0.005gNa2Mo04*2H20?；旌暇S生素含有(每升)lOOmg硫胺素，0.5mg生物素，0.5mg維生素B12。調(diào)培養(yǎng)液的pH為7.0，然后過濾除菌。此按比例縮小實(shí)驗(yàn)的構(gòu)想是，在有不同體積培養(yǎng)液的搖瓶中培養(yǎng)細(xì)胞-搖瓶中幾乎裝滿(例如在250mL搖瓶中裝200mL)，在搖床上不能充分混合，這樣在細(xì)胞生長時就會產(chǎn)生低溶氧條件。為此，在本實(shí)驗(yàn)中建立4種處理，每一種都雙份(1)250mL搖瓶中裝50mL培養(yǎng)基；(2)250mL搖瓶中裝lOOmL培養(yǎng)基；(3)250mL搖瓶中裝150mL培養(yǎng)基；(4)250mL搖瓶中裝200mL培養(yǎng)基。這8個搖瓶的每一個都接種已經(jīng)培養(yǎng)了48小時的Sc/z/zoc/^n'Mm細(xì)胞，所述細(xì)胞已經(jīng)在04-4培養(yǎng)基中按照第l種處理所述條件，在28。C以220rpm在搖床上培養(yǎng)。將所有這8個搖瓶置于培育箱(28。C)中的搖床(220rpm)上，避光培養(yǎng)48小時。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，用YSI溶氧計(jì)檢測每個搖瓶中的溶氧(DO)水平，也測定培養(yǎng)基中的pH,以及細(xì)胞干重和脂肪酸含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1中。表1:觀察低溶氧濃度對Sc/2^c/^r/ww菌株的長鏈高度不飽和脂肪酸含量(DHA%干重)的影響的按比例縮小實(shí)驗(yàn)結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>該結(jié)果顯示在低溶氧水平下培養(yǎng)的細(xì)胞的脂質(zhì)含量(以％FAME計(jì))和DHA含量(y。干重)較高，溶氧水平越低，脂質(zhì)和DHA量越高。這是令人意外的，因?yàn)橐话阏J(rèn)為氧是形成不飽和(雙)鍵所必需的。令人驚異的是在低溶氧水平下形成如此多的DHA，因?yàn)镈HA是最不飽和的脂肪酸之一。盡管隨著溶氧水平降低，生物量產(chǎn)量降低，DHA含量卻提高了。因此，較為有利地是使生長階段的溶氧水平較高以形成最多的生物量，然后降低溶氧水平以產(chǎn)生最多的長鏈脂肪酸。實(shí)施例3本實(shí)施例闡明本發(fā)明方法的再現(xiàn)性。采用正常工作體積為1200加侖的發(fā)酵罐生產(chǎn)微生物。濃縮所得發(fā)酵液，采用轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)干燥微生物。提取所得微生物等分試樣的脂質(zhì)，并純化產(chǎn)生精煉的，脫色的，除臭的油。在分析脂質(zhì)前加入約3000ppmd-l-a-生育酚醋酸酯作為營養(yǎng)添加劑。對ScWzoc/z^n'Mm菌抹ATCC20888進(jìn)行九次發(fā)酵，所得結(jié)果表示于表2中。在前24小時溶氧水平為約8%,其后為約4%。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>1.生物量密度實(shí)際產(chǎn)量，2.以％細(xì)胞干重計(jì)的DHA含量，3.以％細(xì)胞干重計(jì)的總脂肪酸含量(以甲基酯形式測定)，4.(gDHA)/L/Hr，5.平均值，6.標(biāo)準(zhǔn)差7.變異系數(shù)。變異系數(shù)值低于5%指示具有極佳再現(xiàn)性的方法，在5%到10%之間指示具有良好再現(xiàn)性的方法，在10%到20%之間指示具有合理再現(xiàn)性的方法。補(bǔ)加玉米糖漿^吏發(fā)酵罐中的體積達(dá)到約1200加侖，此時停止加入玉米糖漿。在殘余糖濃度低于5g/L時停止發(fā)酵過程。從接種到終點(diǎn)的典型菌齡為約100小時。發(fā)酵液，即發(fā)酵培養(yǎng)基用水稀釋至接近2:l的比例以減少終產(chǎn)品中灰分含量并幫助改進(jìn)離心步驟時的相分離。將濃縮的細(xì)胞加熱到160'F(約71。C),在BlawKnow雙-轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)(42"x36")上干燥。但是優(yōu)選微生物不經(jīng)離心而直接在轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)上干燥。從表2中每一實(shí)體的等分試樣提取的脂質(zhì)的分析結(jié)果總結(jié)在表3中。表3:表2所列補(bǔ)料分批發(fā)酵中產(chǎn)生的微生物生物量的分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>1.參見表2。2.參見上述討論。3.標(biāo)準(zhǔn)差4.變異系數(shù)。變異系數(shù)值低于5%指示具有極佳再現(xiàn)性的方法，在5%到10%之間指示具有良好再現(xiàn)性的方法，在10%到20%之間指示具有合理再現(xiàn)性的方法。除非特別指出，在本文實(shí)施例部分所用的發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下成分，其中第一個數(shù)字指出正常的目標(biāo)濃度，括號中的數(shù)字表示可接受的范圍碌b酸鈉12g/L(11-13);KC10.5g/L(0.45-0,55);MgS04'7H202g/L(1.8-2.2);HodagK-60消泡劑0.35g/L(0.3-0.4);K2S040.65g/L(0.60-0,70);KH2P04lg/L(0.9-1.1);(NH4)2S04lg/L(0.95-1.1);CaCl2*2H200.17g/L(0.15-0.19);95DE玉米糖漿(以固體計(jì))4.5g/L(2-10);MnCl2'4H203mg/L(2.7-3.3);ZnS04'7H203mg/L(2.7-3.3);CoCl2'6H200.04mg/L(0.035-0.045);Na2Mo04'2H200.04mg/L(0-0.045);CuS04'5H202mg/L(1.8-2.2);NiS04'6H202mg/L(1.8-2.2);FeS04'7H2010mg/L(9-ll);硫胺素9.5mg/L(4-15);維生素BI20.15mg/L(0.05-0.25)和泛酸4丐3.2mg/L(1.3-5.1)。此外，28%NH4OH溶液用作氮源。干微生物的灰分量約為6%重量^[分。實(shí)施例4'本實(shí)施例用于闡明14000加侖規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧水平降低對微生物生產(chǎn)力的影響。采用實(shí)施例3所述方法，利用5Wz/zoc/^n'ww野生型菌抹進(jìn)行標(biāo)稱體積為14000加侖的發(fā)酵，所述菌4朱是用上述美國專利5340594和5340742公開的分離方法得到的。在前24小時發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧水平為約8%,在第24到40小時約為4%,從第40小時到發(fā)酵過程終止約為0.5%。表4顯示了發(fā)醇過程中此低溶氧水平的結(jié)果。表4:在降低的溶氧濃度下14000加侖規(guī)模的Schizochytrium補(bǔ)料分批發(fā)酵的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實(shí)施例5本實(shí)施例闡明41000加侖規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)基中低溶氧水平對微生物生產(chǎn)力的影響。除了發(fā)酵在41000加侖的發(fā)醇罐中進(jìn)行外，采用與實(shí)施例4相同的方法。增加培養(yǎng)液體積以在此規(guī)模下維持目標(biāo)化合物的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于表5。表5:Sc/^oc/^nim的41000加侖規(guī)模發(fā)酵<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例6本實(shí)施例闡明額外的氮對本發(fā)明的發(fā)酵過程的影響采用與實(shí)施例4近似的方法進(jìn)行4組250L規(guī)模的補(bǔ)料分批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行兩組對照實(shí)驗(yàn)和兩組含有額外的氨(1.15x和1.25x標(biāo)稱量)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于表6中。表6:額外的氨對&/z/zoc/^n'ww發(fā)酵的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>通常，額外的氮對發(fā)酵效能有負(fù)面影響，在加入了額外的氨的兩批中DHA生產(chǎn)力顯著降低。如表6所示，對照批次的最終DHA水平占總細(xì)胞干重的18.4%和22.1%，額外供應(yīng)了氨的批次為9.2。/。(1.15x氨)和12.6%(1.25x氨)。實(shí)施例7本實(shí)施例顯示本發(fā)明發(fā)酵方法的動力學(xué)特征(profile)。采用與實(shí)施例4近似的方法進(jìn)行1000加侖規(guī)模的補(bǔ)料分批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。表7表示了發(fā)酵過程的動力學(xué)特征。表7:1000加侖規(guī)模的Sc/^ocA^n'wm4卜料分批發(fā)酵的動力學(xué)特征<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>*在48小時的時候分析了兩個不同的樣品。"這是洗過的細(xì)胞干重(DCW)樣品。其它的值是未洗過的樣品的。實(shí)施例8本實(shí)施例闡明了碳源的量對生產(chǎn)力的影響。采用實(shí)施例4的方法以不同的碳源的量進(jìn)行了三批不同發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表8所示。表8:不同碳源量對Sc/n'zoc/^n'ww發(fā)酵的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實(shí)施例9本實(shí)施例闡明營養(yǎng)限制對碳轉(zhuǎn)化為生物量，脂質(zhì)并特別是DHA的轉(zhuǎn)化效率的影響。為了研究營養(yǎng)限制的影響，在2升Applikon發(fā)酵罐中對5"c/n'zoc/^r/wm菌抹ATCC20888進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，基本生長培養(yǎng)基(ICM-2)由下列化合物組成(標(biāo)定濃度)I組成分Na2S04(18.54g/L),MgS04*7H20(2.0g/L)和KC1(0.572g/L);II組成分(每一個單獨(dú)制備)葡萄糖(43.81g/L)，KH2P04(1.28g/L),CaCl2'6H20(0.025g/L)和(NH4)2S04(6.538g/L);III組成分Na2EDTA(6.0mg/L)，F(xiàn)eCl3'6H20(0.29mg/L),H3B03(6.84mg/L),MnCl2'4H20(0.86mg/L)，ZnS04*7H20(0.237mg/L)，CoCl2'2H20(0.026mg/L),Na2Mo04'2H20(0.005mg/L)，CuS04'5H20(0.002mg/L)和MS04'6H20(0.052mg/L);和IV組成分鹽酸硫胺素(0.2mg/L),維生素B12(0.005mg/L),泛酸鈣(0.2mg/L)。加入到發(fā)酵罐之前，I和II組高壓滅菌，III和IV組過濾除菌。用Sc//zoc/^n^m接種生長培養(yǎng)基，在30。C，pH5.5，溶氧為20%飽和度的控制條件下生長直到達(dá)到最大細(xì)胞密度。通過以足以維持稀釋速率為0.06hr"的流量泵入無菌ICM-2進(jìn)料培養(yǎng)基到發(fā)酵罐并同時移出含5"c/z/zoc/^n'Mm細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行連續(xù)模式操作，直到達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。為觀察營養(yǎng)限制的影響，減少ICM-2進(jìn)料培養(yǎng)基中的含有特定所需營養(yǎng)的化合物，使該營養(yǎng)成分在含細(xì)胞的出口培養(yǎng)液中耗盡，這樣由于該特定所需營養(yǎng)的缺乏，細(xì)胞生長受到限制。一旦確立每一條件的穩(wěn)定狀態(tài)的操作，就測定最終培養(yǎng)液的干生物量，殘余葡萄糖，限制性營養(yǎng)濃度，細(xì)胞脂質(zhì)含量和細(xì)胞DHA含量。用葡萄糖總耗量除以所得干生物量的總量，計(jì)算出葡萄糖轉(zhuǎn)化為生物量的轉(zhuǎn)化效率，以百分比表示。對列于下表中的每一營養(yǎng)成分重復(fù)進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)，研究每一營養(yǎng)成分限制生長的效應(yīng)。最終結(jié)果列于下表中。表9:營養(yǎng)限制對5b/n'zoc/^Wwm菌抹的生物量產(chǎn)量，轉(zhuǎn)化效率(葡萄糖—生物量)，脂質(zhì)含量和DHA含量的影響。_<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>1.干生物量濃度(g/L)2.產(chǎn)量系數(shù)(％產(chǎn)生的生物量/消耗的葡萄糖)3.培養(yǎng)液中的殘余葡萄糖濃度(g/L)4.干生物量中的脂質(zhì)含量(g脂質(zhì)(以FAME計(jì))/g干生物量)5.干生物量中的DHA含量(gDHA/g干生物量)表中清楚地顯示，氮限制導(dǎo)致DHA在細(xì)胞中的積累最多，然后是磷酸鹽，鈉，鎳，錳，葡萄糖(碳源)，鋅和鐵。該信息可用于商業(yè)，即將這些營養(yǎng)成分中一種或多種以足以限制細(xì)胞生長的速度加入到分批發(fā)酵中。在最優(yōu)選的情況下，將氮以限制性方式加入到分批發(fā)酵中，以使細(xì)胞中的DHA量達(dá)到最高水平。其它營養(yǎng)成分(或其混合物)可以限制性方式加入以最大化生物量或其它有價值產(chǎn)物的產(chǎn)量。其它沒有評價的生物學(xué)必需成分，如硫，也可用作這種發(fā)酵控制策略中的限制性營養(yǎng)。本發(fā)明，在各種實(shí)施方案中，包括基本如本文記述的組分，方法，工藝過程，系統(tǒng)和/或裝置，它們包括各種實(shí)施方案，其進(jìn)一步組合與集合。本領(lǐng)域技術(shù)人員在了解本發(fā)明后能理解如何實(shí)施和應(yīng)用本發(fā)明。本發(fā)明，在各種實(shí)施方案中，包括提供沒有在此或各實(shí)施方案中記述的項(xiàng)的裝置和方法，包括那些可能已在以前的裝置或方法中采用的項(xiàng)，例如為改進(jìn)效果，減輕勞動和/或降低實(shí)施成本而采用的項(xiàng)。出于闡述和說明的目的提供本發(fā)明的上述討論。上述內(nèi)容不打算限制本發(fā)明于本文所公開的形式。盡管本發(fā)明的說明已經(jīng)包括一種或多種實(shí)施方式和某些變化與修飾的說明，不過其他變化與修飾也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如在理解了目前的/^開內(nèi)容后，可以在本領(lǐng)域的4支術(shù)與知識范圍內(nèi)作出這些變化和修飾。本發(fā)明打算獲得包括替代實(shí)施方式的權(quán)利至這樣一種程度，包括與所要求保護(hù)的那些可交替、互換和/或等價的結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟，無論本文是否公開這類可交替、互換和/或等價的結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟，并且不打算以公眾名義貢獻(xiàn)任何可授予專利權(quán)的主題。保藏材料以下材料保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>權(quán)利要求1.一種從真核微生物生產(chǎn)含有多烯脂肪酸的脂質(zhì)的方法，所述微生物能產(chǎn)生至少占其生物量約20％的脂質(zhì)，該方法包括向含有所述微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中以足以提高該發(fā)酵培養(yǎng)基生物量密度到至少約100g/L的速率加入非醇碳源和限制性營養(yǎng)源。2.培養(yǎng)能生產(chǎn)占其生物量的20%為脂質(zhì)的真核微生物的方法，包括向包含所述微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加碳源和限制性營養(yǎng)源，添加的速率足以提高該發(fā)酵培養(yǎng)基的生物量密度到至少約100g/L，其中該方法生產(chǎn)脂質(zhì)的速度至少平均約為0.5g/L/hr,所述微生物產(chǎn)生的總脂質(zhì)中至少約15%是多不飽和脂。3.培養(yǎng)真核微生物的方法，包括向包含所述微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加碳源和限制性營養(yǎng)源，添加的速率足以提高該發(fā)酵培養(yǎng)基的生物量密度到至少約100g/L,其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細(xì)菌或其混合物，其中所述微生物能生產(chǎn)占其生物量至少約20%的包含多烯脂肪酸的脂質(zhì)。4.一種生產(chǎn)真核微生物脂質(zhì)的方法，包括(a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)真核微生物以便將該發(fā)酵培養(yǎng)基的生物量密度提高到100g/L;(b)提供足以使所述微生物生產(chǎn)所述脂質(zhì)的發(fā)酵條件；和(c)回收所述脂質(zhì)，其中所述脂質(zhì)的多于約15%是多不飽和脂。5.—種生產(chǎn)真核微生物脂質(zhì)的方法，包括(a)向包含所述微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入非醇碳源和限制性營養(yǎng)源；(b)提供足以使所述微生物生產(chǎn)所述微生物脂質(zhì)的條件；和(c)回收所述微生物脂質(zhì)，其中所述微生物脂質(zhì)的至少約15%為多不飽和脂。6.—種生產(chǎn)真核微生物脂質(zhì)的方法，包括(a)在含有真核微生物的發(fā)醇培養(yǎng)基中添加碳源和限制性營養(yǎng)源，并提供足以將該發(fā)醇培養(yǎng)基中溶氧水平維持在至少約4%的條件，以便產(chǎn)生至少約100g/L的生物量密度；(b)提供足以將該發(fā)醇培養(yǎng)基中溶氧水平維持在約1%或更低水平的條件，并提供足以使所述微生物生產(chǎn)所述脂質(zhì)的發(fā)酵條件；和(c)回收所述脂質(zhì)，其中所述微生物脂質(zhì)的至少約15%是多不飽和脂。7.—種富集微生物的多烯脂肪酸含量的方法，包括在溶氧水平低于10%的生長培養(yǎng)基中發(fā)酵所述微生物。8.—種生產(chǎn)產(chǎn)物和微生物的異養(yǎng)方法，包括a.在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，所述微生物中包含聚酮化合物合成酶基因；和b.保持溶氧水平低于10%。全文摘要本發(fā)明涉及通過在發(fā)酵罐中高密度培養(yǎng)真核微生物來增加含有多烯脂肪酸的脂質(zhì)的產(chǎn)生。本發(fā)明提供了培養(yǎng)真核微生物的方法，所述微生物可以生產(chǎn)脂質(zhì)，具體是含有多烯脂肪酸的脂質(zhì)。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)真核微生物脂質(zhì)類的方法。文檔編號C12N1/12GK101519677SQ200910133079公開日2009年9月2日申請日期2001年1月26日優(yōu)先權(quán)日2000年1月28日發(fā)明者喬恩·M·漢森,喬治·T·維德爾第三,克雷格·M·魯克爾,唐·迪馬西,塔茨奧·卡奈科,威廉·R·巴克利,彼得·J·米拉索爾,理查德·B·貝利申請人:馬泰克生物科學(xué)公司