專利名稱：EGFP融合的β2腎上腺素能受體、其重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種與增強型綠色熒光蛋白EGFP融和的人類e 2腎上腺素能受體e2AR (簡稱EGFP—P2AR)、其重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
e2-腎上腺素能激動劑(簡稱e2激動劑)是一類激素類藥物，其成員為數(shù)眾多，包括克倫
特羅(俗稱瘦肉精)、沙丁胺醇、萊克多巴胺等數(shù)十種，其作用機制是e2-激動劑結(jié)合于e2 —腎上腺素能受體(簡稱P2AR)，通過G蛋白偶聯(lián)的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮生理效應(yīng)，臨床上用于治療哮喘和支氣管痙攣等相關(guān)疾病。遵循同樣的作用機制，激動劑還具有增強肌
肉，減少脂肪的副效應(yīng)，己被濫用作生長促進(jìn)劑以提高家畜瘦肉率。藥代動力學(xué)研究表明e
2-激動劑一旦飼用便難以代謝排出，易大量蓄積在動物機體內(nèi)。人類在食用帶有殘留藥物的肉類食品后，會出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、頭暈等中毒癥狀，因此迫切需要加大e2激動劑檢測力度。
當(dāng)前檢測P2激動劑殘留的方法主要有兩類即化學(xué)檢測法、免疫檢測法(IA)。化學(xué)檢測法其最低檢測限范圍為l 15ng/g，具有較高的靈敏度，但它存在樣品處理繁雜，檢測時間長，儀器貴重，難于操作，通量低等缺點，因此常作確證性方法。免疫檢測法(主要為酶聯(lián)免疫分析)具有較高的檢測通量，且快速方便、成本低，常用于多樣品篩查。免疫檢測法的
缺點是一種e 2激動劑的抗體只能檢測一種或少數(shù)幾種e 2激動劑，因此隨著現(xiàn)今被濫用的e 2激動劑種類的增多，該法常出現(xiàn)假陰性?；谑荏w-配基系統(tǒng)的檢測方法則克服了這一缺點，
具有以下其他方法無可比擬的優(yōu)勢
高特異性一受體與配基的結(jié)合具有嚴(yán)格的立體構(gòu)象互補性。高親和力一受體-配基系統(tǒng)親和力高于抗原-抗體系統(tǒng)。廣譜性一基于受體-配基系統(tǒng)的檢測技術(shù)可一次檢出所有種類的e2-激動劑，將其"一網(wǎng)
打盡"。
因此構(gòu)建一種能夠識別并結(jié)合e2—激動劑，同時能夠提供檢測信號的雙功能原件，即重組融合受體成為目前研究的主流。發(fā)明目的
本發(fā)明的目的之一在于提供一種EGFP融和的人類e 2腎上腺素能受體e 2AR (簡稱EGFP一P2AR)，該重組融合受體是能夠識別并結(jié)合e2—激動劑，同時能夠提供檢測信號的雙功能
4原件。
本發(fā)明的目的之二在于提供該重組融合受體的構(gòu)建方法。本發(fā)明的目的之三在于提供該重組融合受體的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的目的之四在于提供該重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種EGFP融和的e 2腎上腺素能受體，其特征在于該融合受體具有下列核苷酸序列之一
1) 具有SEQ ID NO 1所示的堿基序列；
2) 與序列表中序列1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且編碼相同生物學(xué)功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
一種上述的融合受體的編碼蛋白，該蛋白具有下列氨基酸序列之一
1) 具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；
2) 通過將SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而產(chǎn)生的衍生蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該衍生蛋白質(zhì)與SEQ ID NO 2的蛋白具有相同的生物學(xué)功能。
一種構(gòu)建上述的融合受體的方法，該方法包括如下步驟
1) 在已構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPICZa-e2AR外源片段3'下游的NotI禾QXbaI位點處插入增強型綠色熒光蛋白EGFP基因序列，得到新的重組表達(dá)載體pPICZd-EGFP-B2AR。
2) 重組表達(dá)載體經(jīng)酶切驗證后，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115,用Zeocin抗性篩選克隆并對其基因組進(jìn)行PCR驗證，獲得重組酵母工程菌pPICZ a -EGFP- P 2AR—GS115。
3) 甲醇誘導(dǎo)重組酵母表達(dá)，獲得融合重組受體EGFP-P 2AR，經(jīng)熒光和Dot—blot鑒定該重組融合受體定位于細(xì)胞膜上，經(jīng)放射配基結(jié)合實驗證明重組融合受體保留配基結(jié)合活性。
一種重組表達(dá)載體，該重組載體含有上述的基因。
一種上述的重組表達(dá)載體，其特征在于該重組表達(dá)載體為pPICZa-EGFP-P2AR,其基因具有具有SEQ ID NO 3所示的堿基序列。
一種構(gòu)建上述的重組表達(dá)載體的方法，其特征在于該方法的具體步驟為從載體pEGFP-Nl中PCR分離EGFP基因，所用的引物為
上游引物ATAGCGGCCGCA ATGGTGAGCAAGGGC;
Not I
下游弓I物CGGCTCTAGACTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC;
Xba I瓊脂糖凝膠電泳回收產(chǎn)物經(jīng)Not I和Xba I線性化后和用相同內(nèi)切酶線性化的重組載體 pPICZa-卩2AR進(jìn)行連接反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F'，并涂布25ug/mgZeocin抗性LB 平板；挑取10個陽性克隆，用試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)NotI和Xbal雙酶切后電泳得到約4.8kb 及750Pb的兩個片段；經(jīng)EcoR I和Xba I雙酶切鑒定獲得約3.5kb及2kb的兩個片段；經(jīng)Not
I單酶切，獲得的一個約5.5kb的片段，即為重組表達(dá)載體pPICZa-EGFP-{32AR。
一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述的重組載體。
上述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母。 重組載體pPICZa-卩2AR的構(gòu)建方法 一.e2AR基因的獲得
l.用Blood Genome DNA Extraction Kit從人血中提取基因組DNA
(1) 取靜脈血100(^1于1. 5ml離心管中，加入GenTLE Solution I 500|xl,立即振蕩數(shù)分 鐘。
(2) 室溫放置10分鐘以上，室溫下12000rpm以上離心5分鐘。
(3) 用移液槍小心除去管中溶液，加入lml GenTLE Solution II。
(4) 輕柔地上下顛倒離心管數(shù)次，室溫12000rpm以上離心2分鐘，用移液槍小心地除去 上清。
(5) 加入GenTLE Solution III 50(^1，輕微振蕩10秒鐘充分混合。
(6) 室溫12000rpm以上離心5分鐘，把上清移至一新的離心管中。
(7) 加入等體積(50(^1)的異丙醇，輕柔顛倒數(shù)次，混合均勻。
(8) 4'C、 12000rpm離心5分鐘，小心除去上清。
(9) 加入lml的70%乙醇清洗沉淀，4°C、 12000rpm離心5分鐘，小心除去上清.
(10) 干燥沉淀，用5(^1 TE緩沖液溶解沉淀。 2 .PCR擴增e2-腎上腺素能受體基因
PI上游引物CGGAATTCATGGGGCAACCCGGGA
P2下游引物ATTTGCGGCCGCCAGCAGTGAGTCATTTGTACTA
Abt I
Pl上游引物(lOpmol/Vl) : 0. 5pl
P2下游引物(10pmol/|xl) : 0.5^1 基因組DNA: 5^110 X buffer: 5jal
dNTP(各2. 5tnol/nl): 4. 0pl
Taq酶 0. 25^1
補加ddH20至50|xl。反應(yīng)條件為94。C變性4min，立即冰浴，然后94。C30s， 62。C60s, 72°C60s， 30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，并用膠回收試劑盒回收并純化約1200bp 的片段，具體操作參見上海華舜生物工程有限公司DNA凝膠回收試劑盒使用說明。 3.目的基因的消化和載體的線性化
由于引物設(shè)計時在P2AR基因的5'端和3'端分別引入EcoR I和Not I酶切位點，用這 兩種酶酶切后露出對應(yīng)的粘性末端。同時，載體pPICZa也具有這兩個酶的位點，用這兩種 酶酶切后，同樣露出對應(yīng)的粘性末端。(具體步驟如下) a.在1. 5ral離心管中加入下列試劑
10 X buffer 2|il
目的基因或載體 lOpl
EcoR I 0.5^1
Not I 0.5^1
ddH20 7)il
總計 20|il
b. 混勻上述試劑，在37'C水浴中酶切3小時
c. 用1%瓊脂糖電泳檢測，并回收目的條帶，具體操作參見上海華舜生物工程有限公司DNA 凝膠回收試劑盒使用說明。
4.連接反應(yīng)
對應(yīng)的粘性末端之間發(fā)生連接反應(yīng)(連接反應(yīng)體系如下)下列比例進(jìn)行連接反應(yīng)
10X buffer
線性pPICZ alpl
目的基因 1
T4 DNA連接酶1^1
總計20^1
在16"C連接反應(yīng)過夜。
5 .轉(zhuǎn)化大腸桿菌
7在200^1感受態(tài)大腸桿菌加入連接產(chǎn)物，混勻后冰浴45分鐘，37'C水浴5分鐘，再冰浴 5分鐘，加入lml LB液體培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)1小時，取出大腸桿菌涂布于含有25pg/ml Zeocin的LB固體平板上(無論是重組質(zhì)粒還是原始質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，都可表達(dá)Zeocin 抗性基因)，37'C恒溫培養(yǎng)過夜。 6.陽性克隆的篩選鑒定
按下述方法抽取含有Zeocin平板上的單克隆菌落的質(zhì)粒，并用EcoR I和Not I雙酶切或
者單獨用EcoR I (或Not I)單酶切可對酶切片段大小進(jìn)行鑒定。
質(zhì)粒抽提過程
1) 從平板上挑取單克隆接種于含25叫/ml Zeocin的LB液體培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)過 夜
2) 在離心管中加入2ml菌體培養(yǎng)液，12000rpm離心15秒收集菌體
3) 加入200(al溶液I (25mM Tris-HCl， lOmM EDTA)重懸菌體
4) 加入400^1溶液II (0.2M Na0H, ， 1% SDS)，顛倒4-6次，至澄清
5) 加入200nl預(yù)冷的溶液IH (7. 5M NH4Ac PH7. 6)，冰浴10分鐘
6) 12000rpm離心5分鐘
7) 取上清，加入0.5倍體積異丙醇，室溫靜置10分鐘
8) 12000rpm離心5分鐘，棄上清
9) lOOpl 2M NH4Ac (PH7. 4)重懸沉淀，冰浴5分鐘
10) 12000rpm離心5分鐘
11) 取上清，加lOOpl異丙醇，室溫靜置10分鐘
12) 12000rpm離心5分鐘
13) 1ml 80%乙醇洗滌
14) 12000rpm離心5分鐘，棄上清，室溫干燥10分鐘
15) 25^1含有20嗎/ml RNase的TE溶解，37。C反應(yīng)30分鐘
16) 取2pl電泳檢測
17) 若要除去RNase，則重復(fù)7)至14)步，用25|xl TE溶解 酶切體系
酶切反應(yīng)體系
10X buffer 2nl 質(zhì)粒DNA 8plddH20 9.5^1
限制性內(nèi)切酶
總計 20|il
在37'C水浴中酶切反應(yīng)1. 5小時，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
本發(fā)明對重組質(zhì)粒pPICZ a - P 2AR進(jìn)行改造，通過酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)得到重組表達(dá)載 體pPICZa-EGFP-P2AR。將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10F，經(jīng)Zeocin抗性篩選出陽性克隆后，.抽 提質(zhì)粒并電擊轉(zhuǎn)化酵母，得到基因重組酵母。用甲醇誘導(dǎo)融合受體EGFP-e2AR表達(dá)后，通過 玻璃珠法提取細(xì)胞膜，并經(jīng)放射配基結(jié)合實驗對膜受體進(jìn)行功能鑒定。
經(jīng)檢測本發(fā)明的融合受體和11種P2藥物都具有一定的結(jié)合活性，其中以Alprenolol 的親和力最強，抑制常數(shù)Ki為7.2nM，與文獻(xiàn)(Biochetn. J, (1998) 330， 1137)報道 ((-)-[3H]CGP-12177的Kd為0. 5 nM， Alprenolol的Ki為2. 6nM)基本一致。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體為pPICZ a -EGFP- P 2AR的特征在于
(1) 0 2AR的N端具有來自于載體的a信號肽序列(a -factor),可介導(dǎo)重組蛋白的分泌 表達(dá) ，
(2) P2AR的C端融合了增強型綠色熒光蛋白序列，賦予融合受體熒光性質(zhì)，易于表達(dá)的 監(jiān)測和熒光受體檢測技術(shù)的建立
(3) 在EGFP的C端連接有c一myc表位和6xHis標(biāo)簽，方便利用相應(yīng)抗體對重組蛋白進(jìn)行 檢測及提純工作。


圖1為重組受體EGFP— P 2AR結(jié)構(gòu)組成圖。其中a -factor, C-myc印itope及6xHis來自 于載體pPICZa (Invitrogen)， 0 2AR與EGFP為外源引入，共1910bp。
圖2為質(zhì)粒pPICZ。-EGFP- e 2AR的酶切鑒定圖，其中1—DNA Marker; 2—pPICZ a -EGFP-P 2AR linearized with Not I; 3—pPICZ a - P 2AR linearized with Not I; 4—pPICZ a -EGFP-e 2AR digested with Xba I和Not I; 5—pPICZa — e 2AR digested with EcoR I和Xba I; 6—腿Marker 。
圖3為重組載體pPICZ a -EGFP- P 2AR的質(zhì)粒圖譜圖。
圖4為重組酵母pPICZa -EGFP-P 2AR-GS115的PCR鑒定圖。其中l(wèi)一DNA Marker; 2-17 —pPICZ ci -EGFP- P 2AR-GS115。 圖5為重組酵母pPICZ a -EGFP- P 2AR-GS115熒光鑒定圖。
具體實施方式
1. 融合受體EGFP- P 2AR的構(gòu)建在已構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPICZ a - P 2AR的Not I和Xba I位點處插入增強型綠色熒光蛋白EGFP基因序列，得到新的重組表達(dá)載體pPICZa -EGFP-P2AR。該表達(dá)載體分別經(jīng)EcoR I和Xba I， EcoR I和Xba I雙酶切及Not I單酶切驗證 后，電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)巴斯德畢赤酵母GS115，用Zeocin抗性篩選陽性克隆并對其基因組進(jìn)行 PCR驗證，獲得重組酵母工程菌pPICZa-EGFP-0 2AR—GSU5?；蛑亟M酵母用甲醇誘導(dǎo) 表達(dá)，即獲得融合受體EGFP-P2AR。熒光和Dot—blot鑒定表明該重組融合受體表達(dá)于細(xì) 胞膜上。同時經(jīng)放射配基結(jié)合實驗證明重組融合受體保留配基結(jié)合活性。上述結(jié)果證明，甲 醇氧化酶啟動子A0X 1在甲醇的誘導(dǎo)下，成功啟動其下游的a —信號序列，e 2AR， EGFP， c-Myc 表位及6xHis標(biāo)簽的表達(dá)。重組融合受體的組成參見圖1 。
2. 重組表達(dá)載體pPICZ a - EGFP- P 2AR的構(gòu)建
從載體pEGFP-Nl中PCR分離EGFP基因，所用的引物為 上游引物ATAGCGGCCGCA ATGGTGAGCAAGGGC，
Not I
下游引物CGGCTCTAGACTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC，
Xba I
瓊脂糖凝膠電泳回收產(chǎn)物經(jīng)Not I和Xba I線性化后和用相同內(nèi)切酶線性化的重組載 體pPICZci-e2AR進(jìn)行連接反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F'，并涂布25ug/mgZeocin抗性 LB平板。挑取10個陽性克隆，用試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)Not I和Xba I雙酶切后電泳得到約 4. 8kb及750Pb的兩個片段；經(jīng)EcoR I和Xba I雙酶切鑒定獲得約3. 5kb及2kb的兩個片段； 經(jīng)NotI單酶切，獲得的一個約5.5kb的片段，表明重組表達(dá)載體pPICZa-EGFP-e2AR構(gòu)建 成功，參見圖2。
重組載體pPICZ a -EGFP-e 2AR的質(zhì)粒圖譜參見圖3，
3. 重組酵母pPICZ a -EGFP- P 2AR-GS115的構(gòu)建
重組載體pPICZa-EGFP-P2AR用Sacl線性化后，電擊轉(zhuǎn)化(700V， 5mS)畢赤酵母菌種 GSU5，電擊產(chǎn)物分別涂布于含抗生素Zeocin"100ng/ml、 250pg/ml、 500|ig/ml、 1000ng/ml 的固體YPDS培養(yǎng)基上，經(jīng)溫育溫育2-4天后，依次獲得156， 50， 10， 6個單菌落。將含抗 生素Zeocin 500叫/ml、 1000叫/ml培養(yǎng)基上的28株e 2AR重組菌和16株e 2AR_EGFP重組 菌接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天后，用玻璃珠法提取酵母總DNA，然后以提取的酵母總DNA 為模板PCR，所用引物為
上游引物CGGAATTCATGGGGCAACCCGGGA，Xba I
下游引物CGGCTCTAGACTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC，
經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，10株重組菌2. 0kb處有條帶，說明具有e 2AR-EGFP成功整合 進(jìn)入酵母染色體組，參見圖4。
4. 重組受體EGFP - e 2AR的表達(dá)從新鮮平板上分別挑取EGFP- P 2AR重組菌于15ml (150ml 錐形瓶)BMGY培養(yǎng)液中，30°C 270轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜，使其OD600=4. 0-6. 0，離心棄上清，用 新鮮BMMY重懸菌體，接種于50ml (500ml錐形瓶)BMMY培養(yǎng)液中，使起始0D600=1. 0， 28 °C 280轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)30小時。取部分菌體在熒光顯微鏡下觀察，觀測到酵母細(xì)胞發(fā)出綠色熒光， 說明EGFP- e 2AR-在畢赤酵母GS115胞中成功表達(dá)，參見圖5。
5. EGFP-P2AR的功能鑒定對重組菌株EGFP-P 2AR-GS115進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，并用玻璃珠法 提取細(xì)胞膜后，對重組受體的功能進(jìn)行鑒定。放射配基飽和實驗結(jié)果表明重組受體EGFP-e 2AR對放射配基(-)-[3H]CGP-12177的解離平衡常數(shù)Kd為0. 44nM，表明重組受體保留配基結(jié) 合活性。放射配基競爭分析測定了 11種e2藥物對重組受體的親和力，結(jié)果表明重組受體和 這ll種e2藥物都具有一定的結(jié)合活性，其中以Alprenolol的親和力最強，抑制常數(shù)Ki為 7.2nM，與文獻(xiàn)(Biochem. J. (1998) 330， 1137)報道((-)-[3H]CGP-12177的Kd為0. 5 nM， Alprenolol的Ki為2.6nM)基本一致，參見下表l。
表l: 11種e2 —配基對(-)-[3H]CGP-12177和EGFP-e2AR結(jié)合的競爭抑制
LigatidKd (M)Ki (M>
Salbutamo，7.70E-06
Terbutallne1.88E-05
Cl抓buterol2.74E-07
lsopropyl noradrenaline hydrochkoride1.12E-06
Fenoterol hydrobromide1.41E-06
lsoxsuprine hydrochloric!4.49E-06
Ritodrine hydrochloride5.85E-06
Salmeterol Xinafoate4.61 E-08
Ractopamine hydrochloride1.54E-06
Alprenolol7.22E-09
Cimaterol7.26E-07
(-H3HCGP-121774.41 E-10序列表
<110〉上海大學(xué)
〈120〉 EGFP融合的P 2腎上腺素能受體、其重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法 〈歸 3
〈210〉 1 〈211> 2310 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉
<223〉 a —factor: 1 267 P2AR: 274 1512 EGFP: 1522 2238 c-myc epitope:2245 2274
6xHis Tag:2290 2305 <400〉 1
3tg3g3tttCcttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgct60
ccagtc犯cactacaacaga3g3tg3犯CggC3C朋3ttCcggctg犯gctgtcstcggt120
tactcagattt卿agggg3tttcgatgttgctgttttgccattttccaa180
犯cgggttattgttt3t3犯tactsctattgCC3gC3ttgctgcta犯ga鄉(xiāng)3ggggt3240
tctctcgaga犯3g鄉(xiāng)ggCtg犯gctg犯ttcatggggc朋cccggg犯cggc鄉(xiāng)gcc300
ttcttgctggC3CCC朋t3g犯gcceitgcgccggaccacg3CgtC3CgC3gC3犯ggg3C360
gsggtgtgggtggtgggcatgggcatcgtcatgtctctcatcgtcctggccatcgtgttt420
ggc朋tgtgctggtcatcacagccattgccaagttcgagcgtCtgC3g3Cggtcaccaac480
tacttcatcacttcactggcctgtgctgatCtggtC3tgggcctggcsgtggtgcccttt540
ggggccgcccatattcttatgM犯tgtgg3CttttggC3acttctggtgcgsgUttgg600
acttccattgatgtgctgtgcgtcacggccccctgtgcgtg3tCgC3gtg660
gatcgctactttgccattacttcacctttcaagtaccagagcctgctgacc犯gaBtaag720
gcccgggtgatcattctgatggtgtggattgtgtc鄉(xiāng)ccttatctccttcttgcccatt780
12caga/tgcactggtaccgggccELcccacceiggangccatceiactgctatgcceiatgagacc840
tgctgtgacttcttcacgaaccaagcctatgccattgcctcttccatcgtgtccttctac900
gttcccctggtgatcatggtcttcgtctactccagggtctttC郷SLggCcaaaaggcag960
CtCC3g朋gatg郷gccgcttccatgtccagaaccttagccaggtggeig1020
caggatgggcgg已CggggC3tggactccgcagatcttccaagttctgcttg犯gg3gC3C1080
aaagccctcs卿cgttaggcatcatcatgggcactttcaccctctgctggctgcccttc1140
ttcatcgttaacattgtgcatgtgatccagg￡lt￡l￡lCCtC￡Ltccgtaaggaagtttacatc1200
ctcctetaattggataggct已tgtcaattctggtttcaatccccttatctactgccggagc1260
ccagatttcaggattgccttcc觀gagcttctgtgcctgcgcaggtcttctttgaaggcc1320
tstggg犯tggctactccagcaacggcaacac鄉(xiāng)ggagctcacgtggaa1380
c鄉(xiāng)卿鄉(xiāng)aaaat aaac tgctgtgtgaag已cctcccaggcacgga卿ctttgtgggc1440
catx犯ggtactgtgcctagcgat犯cattg3ttc3caBgggagg肪Ugtagtacaaat1500
gactcactgctggcggccgc城ggtgagc卿ggcgagg3gCtgttC3Ccggggtggtg1560
CCC3tCCtggtcg解ctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgsg1620
ggcgagggcgatgccacctacggc卿ctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaag1680
ctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagc1740
cgctaccccgacc3c3tga^gcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctac1800
gtcc鄉(xiāng)解cgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtg1860
鄉(xiāng)ttcg鄉(xiāng)gcgacaccctggtg朋ccgc3tXg3gCtg33gggC8tCg3cttcaaggag1920
gacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacacgtctatatcl卿
atggccgacaCggCatCSL8Lggtg犯cttcaagatccgcceicaaceitcg￡ig2040
gacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggcccc2100
gtgctgctgcCCg3C33CC3ctacctgagcacccagtccgccctgagc犯ag3ccccaac2160
gagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgeiccgccgccgggatcsctctcggc2220
atggacgagctgtacaagagtctagaacaa8aactc3tctc卿聊ggatctgaatagc2280
gccgtcgacctcatcattga2310
<210〉 2 <211> 769 <212> PRT<213>人工序列
〈400> 2
1MetArgPheProSerliePheThrAlaValLeuPheAlaAlaSer
16SerAlaLeuAlaAlaProValAsnThrThrThrGluAspGluThr
31AlaGinlieProAlaGluAlaVallieGlyTyrSerAspLeuGlu
46GlyAspPheAspValAlaValLeuProPheSerAsnSerThrAsn
61AsnGlyLeuLeuPhelieAsnThrThrlieAlaSerlieAlaAla
76LysGluGluGlyValSerLeuGluLysArgGluAlaGluAlaGlu
91PheMetGlyGinProGlyAsnGlySerAlaPheLeu乙euAlaPro
106AsnArgSerHisAlaProAspHisAspValThrGinGinArgAsp
121GluValTrpValValGlyMetGlylieValMetSerLeulieVal
136LeuAlalieValPheGlyAsnValLeuVallieThrAlalieAla
151LysPheGluArgLeuGinThrValThrAsnTyrPhelieThrSer
166LeuAlaCysAlaAspLeuValMetGlyLeuAlaValValProPhe
181GlyAlaAlaHislieLeuMetLysMetTrpThrPheGlyAsnPhe
196TrpCysGluPheTrpThrSerlieAspValLeuCysValThrAla
211SerlieGIuThrLeuCysVallieAlaValAspArgTyrPheAla
226lieThrSerProPheLysTyrGinSerLeuLeuThrLysAsnLys
241AlaArgVallielieLeuMetValTrplieValSerGlyLeulie
256SerPheLeuProlieGinMetHisTrpTyrArgAlaThrHisGin
271GluAlalieAsnCysTyrAlaAsnGluThrCysCysAspPhePhe
286ThrAsnGinAlaTyrAlalieAlaSerSerlieValSerPheTyr
301ValProLeuVallieMetValPheValTyrSerArgValPheGin
316GluAlaLysArgGinLeuGinLyslieAspLysSerGluGlyArg
331PheHisValGinAsnLeuSerGinValGluGinAspGlyArgThr
346GlyHisGlyLeuArgArgSerSerLysPheCysLeuLysGluHis
361LysAlaLeuLysThrLeuGlylielieMetGlyThrPheThrLeu
376CysTrpLeuProPhePhelieValAsnlieValHisVallieGin
391AspAsnLeulieArgLysGluValTyrlieLeuLeuAsnTrplie
406GlyTyrValAsnSerGlyPheAsnProLeulieTyrCysArgSer
421ProAspPheArglieAlaPheGinGluLeuLeuCysHeuArgArg
436SerSerLeuLysAlaTyrGlyAsnGlyTyrSerSerAsnGlyAsn
451ThrGlyGluGinSerGlyTyrHisValGluGinGluLysGluAsn
466LysLeuLeuCysGluAspLeuProGlyThrGluAspPheValGly
481HisGinGlyThrValProSerAspAsnlieAspSerGinGlyArg
4恥AsnCysSerThrAsnAspSerLeuLeuAlaAlaAlaMetValSer
511LysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProlieLeuValGlu
526LeuAspGlyAspValAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGlu
541GlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPhelie
556CysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThr
571ThrLeuThrTyrGlyValGinCysPheSerArgTyrProAspHis
586MetLysGinHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyr601ValGinGluArg Thrlie
616ThrArgAlaGlu ValLys
631lieGluLeuLys Glylie
646GlyHisLysLeu GluTyr
661MetAlaAspLys GinLys
676ArgHisAsnlie GluAsp
691GinGinAsnThr Prolie
706AsnHisTyrLeu SerThr
721GluLysArgAsp HisMet
736GlylieThrLeu GlyMet
751LysLeulieSer GluGlu
766HisHisHisHis *氺求
Phe PheLysAspAspGlyAsnTyrLys
Phe GluGlyAspThrLeuValAsnArg
Asp PheLysGluAspGlyAsnlieLeu
Asn TyrAsnSerHisAsnValTyrlie
Asn GlylieLysValAsnPheLyslie
Gly SerValGinLeuAlaAspHisTyr
Gly AspGlyProValLeuLeuProAsp
Gin SerAlaLeuSerLysAspProAsn
Val LeuLeuGluPheValThrAlaAla
Asp GluLeuTyrLysSerLeuGluGin
Asp LeuAsnSerAlaValAspHisHis
〈210〉 3
〈211> 5503
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 3
agatct犯catccs犯gax:g犯已ggttg犯tgaaacctttttgccatccgacatccacag60
gtccattctcgccaaacgcaacaggaggggatacactagcageagacegt120
tgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaaceicccacttttgccEitcgaaetaacc180
sgcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctacta240
ac3CC3tgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttC3tgtttgttta300
tttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcgictccagatgagggctttctg360
sgtgtggggtC犯3t3gtttcatgttcccc3犯tggCCC3朋actgac3gttt朋acgct420
gtcttggaacctaatatgacELa^gCgtgSLtctcatccaagtttggttcg480
ttg犯atgctaacggccagttggtc犯a犯gaaacttccaa肌gtcggcataccgtttgt540
cttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaat aat etcatt犯tgcttagegesgtet600
ctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgc犯atggggaaacaxxeget660
ttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgettec^ga/ttctgg720
15gctgatagcctaacgttcatt犯ctgttctaacccctact780
ateLt犯acag犯gga^gctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattsgctt840
actttcataattgcg已ctggttccaattgac犯gcttttgalttta^cgELcttttaacga900
C犯CttgELg8a_g￡itca>aa^ac￡isct￡Lattattcgaaacgatgeigatttccttcaatttt960
tactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtc犯cactaca3caga1020
8Lgatg6L犯Cggcac犯attccggctg犯gctgtcatcggttactcagattt卿agggga1080
tttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgttta/taaa1140
tactactattgccagcattgctgcta犯ga已g已aggggtstctctcgagaaa聊gaggc1200
tgaagctg犯ttcatggggcaacccgggaacggcagcgccttcttgctggcacccaa/tag1260
aagccatgcgccggaccacgacgtcacgcagcaaagggacgaggtgtgggtggtgggcat1320
gggcatcgtcatgtctctcatcgtcctggccatcgtgtttggc犯tgtgctggtcatcac1380
agccattgccaagttcgagcgtctgcagacggtcaccaactacttcatcacttcactggc1440
ctgtgctgatctggtcatgggcctggcagtggtgccctUggggccgcccatattctt已t1500
gaa犯tgtggacttttggcaacttctggtgcgagUttggacttccattgatgtgctgtg1560
cgtcacggccagcattgageiccctgtgcgtgatcgcagtggatcgctactttgccattac1620
ttcacctttc犯gtaccagELgcctgctgacc犯gaata^iggcccgggtgatcattctgat1680
ggtgtggsttgtgtcaggccttatctccttcttgcccattcagatgcactggtaccgggc1740
ceLCcc3CC3ggaagccatcsactgctatgcC3atg￡Lg￡LCCtgctgtgacttcttcacgaa1800
ccaagcctatgccattgcctcttccatcgtgtccttctacgttcccctggtgatcatggt1860
cttcgtctactccagggtctttCELggaggCcaB犯ggcagctccagaagattgacaaatc1920
tg郷gccgcttccatgtcc3gaaccttagccaggtggagc已ggstgggcggacggggca1980
tggactccgcagatcttccaagttctgcttgaaggagcacaaagccctcaagacgtt鄉(xiāng)2040
catcatcatgggcactttcaccctctgctggctgcccttcttcatcgttaacattgtgca2100
tgtgatccagg3taacctc3tccgtaaggaagtttacatcctcctaaattggataggcta2160
tgtcaattctggtttcaatccccttatctactgccggagcccagatttcaggELttgCCtt2220
ccaggagcttctgtgcctgcgcaggtcttctttgaaggcctatgggaatggctactccag2280
caacggcaac3caggggagcagagtggatatcacgtggaacagg卿鄉(xiāng)2340
gctgtgtg犯gacctcccaggcacgga卿ctttgtgggccatcaaggtactgtgcctag2400
cgataacsttg￡tttC￡LC3￡Lggg鄉(xiāng)aattggactcactgctggcggccgc2460
犯tggtgagc犯gggcg已ggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctgga2520
16cggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccaccta2580
cggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccac2640
cctcgtgaccaccctgacct3CggCgtgC3gtgcttcagccgctaccccgaccacatgaa2700
gcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatctt2760
cttcaaggacgacggcaactacaaga^ccgcgccgaggtg犯gttcg郷gcgacaccct2820
ggtg33CCgC鄉(xiāng)gcatcgaCttCSL3gg3ggacggcaacstcctggggcs2880
頃gctggagcgtctatatcatggccgac3agC3gaagaa2940
cggcatcsLaggtgaacttcaiagatccgccacaacatcgeiggacggcagcgtgcagctcgc3000
cgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgc3060
ctacctgagcacccagtccgCCCtg3gC朋3g8cccca^cgag卿cgcgatcacatggt3120
cctgctggagttcgtgaccgccgccgggatceictctcggcatggacgagctgtax:aag3g3180
犯actcatctc卿卿ggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatca3240
tcatcattgagtttgtagccttagaca/tg3ctgttcctcagttcaagttgggcacttacg3300
卿卿ccggtcttgctagattct犯tc犯g鄉(xiāng)atgtC3gaatgccatttgcctg卿g3360
atgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggatttttttt3420
gtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgc3480
tatcttgtggtsggggtttggg犯犯tC3ttcgsgtttgatgtttttcttggtatttccc3540
actcctcttcaggLgt3ceiga￡Lg￡Ltt￡l￡LgtgagaccttcgtttgtgcggatCCCCC3C8C83600
ccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcg3660
catcgccgtaccscttcsaaeic3ccc犯gc3C3gca^ctaaattttccctctttcttcc3720
tct鄉(xiāng)gtgtcgttaatteicccgtactaaaggtttggaaagaccgcctcg3780
tttctttttcttcgtcg3幼a朋ttttt3tcacgtttctttttcttgaas3840
tnttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacg3900
gtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttcttttttactt3960
cttgttcattC3t3gC犯tCtaatctaaggggcggtgttgacaattaatc4020
atcggcatagt已tatcggcatagtat犯tacgacaaggtgagga^ctaaBccatggccaa4080
gttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagt1xtg4140
gaccgaccggctcgggttxtcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccg4200
ggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggscaac3ccct4260
ggcctgggtgtgggtgcgcggCCtgg8Cg3gctgtacgccgsgtggtcggaggtcgtgtc4320cacgasLcttccgggacgcctccgggccggccatgaccgag￡ttcggcgagc鄧ccgtgggg4380
gcgggsgttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagca4440
ggactgacacgtccgacggcggcccacgggtcccaggcctcgg卿tccgtccccctttt4500
cctttgtcgatatcatgt犯ttagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacat4560
ccgctctaaccg犯肌ggaeLgg￡Lgtt￡Lg￡LCEteLCCtgetELgtctaggtccctatttattttt4620
ttatagttatgttagtatt已agaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgt4680
acagax:gcgtgtscgcatgttg3朋3CCttgcttg卿sggttttgggsc4740
gctcg犯ggctttaatttgc鄉(xiāng)ctgg卿cc犯catgtg3gC犯犯ggCcagcaaaagg4800
ccaggaaccggcgttgctggcgtttttccat已ggctccgcCCCCCtgELCg4860
agcatcac犯aaatcgacgctcaagtcagaggtggcg犯acccgacaggactat犯agat4920
accaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgctta4980
ccggatacctgtccgcctttctcccttcggg朋gcgtggcgctttctcaatgctcacgct5040
gtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcscgaacccc5100
ccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggt犯ctatcgtcttgagtcc犯cccggtaa5160
g3C3Cg3Cttatcgccactggcagcagccactggtaacaggcgaggtatg5220
taggcggtgct3cag3gttcttg卿tggtggcctaactacggctacact5280
tatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcgggg"tagctctt5340
gatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttUttgtttgcaag5400
cgcgcagaa3犯3ELggBtCtcaagMgatcctttgatcttttctacggggtctgacgctc5460
agtgg犯cgsa^ctcacgttaagggattttggtcatgagate 550權(quán)利要求
1.一種EGFP融和的β2腎上腺素能受體，其特征在于該融合受體具有下列核苷酸序列之一1)具有SEQ ID NO 1所示的堿基序列；2)與序列表中序列1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同生物學(xué)功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2. —種根據(jù)權(quán)利要求l所述的融合受體的編碼蛋白，該蛋白具有下列氨基酸序列之一1) 具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；2) 通過將SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而產(chǎn)生的衍生蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該衍生蛋白質(zhì)與SEQ ID NO 2的蛋白具有相同的生物學(xué)功能。
3. —種構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合受體的方法，該方法包括如下步驟-1) 在巳構(gòu)建的璽組表達(dá)載體p:PICZa-P2AR外源片段3'下游的Not I和Xba :[位點處插入增強型綠色熒光蛋白EGFP基因序列，得到新的:重組表達(dá)載體pPICZa -EGFP- P 2AR。2) 重組表達(dá)載體經(jīng)酶切驗證后，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115，用Zeodn抗性篩選克隆并對其基因組進(jìn)行PCR驗證，獲得重組酵母工程菌pPICZ a -EGFP- J3 2AR—GSU5。3) 甲醇誘導(dǎo)重組酵母表達(dá)，獲得融合重組受體EGFP-P2AR，經(jīng)熒光和Dot—blot鑒定該:S組融合受體定位于細(xì)胞膜上，經(jīng)放射配基結(jié)合實驗證明重組融合受體保留配基結(jié)合活性。
4. 一種重組表達(dá)載體，該重組載體含有上述的基因。
5. —種根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于該重組表達(dá)載體為pPICZa -EGFP-P2AR，其基因具有具有SEQ ID NO 3所示的堿基序列。
6. —種構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體的方法，其特征在于該方法的具體步驟為從載體pEGFP-Nl中PCR分離EGFP基因，所用的引物為上游弓I物ATAGCGGCCGCA ATGGTGAGCAAGGGC;Not I下游引物CGGCTCTAGACTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC;Xba I瓊脂糖凝膠電泳回收產(chǎn)物經(jīng)Not I和Xba I線性化后和用相同內(nèi)切酶線性化的重組載體pPICZa-p2AR進(jìn)行連接反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPIOF'，并涂布25ug/mgZeocin抗性LB平板；挑取10個陽性克隆，用試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)NotI和Xbal雙酶切后電泳得到約4.8kb及750Pb的兩個片段；經(jīng)EcoR I和Xba I雙酶切鑒定獲得約3.5kb及2kb的兩個片段；經(jīng)NotI單酶切，獲得的一個約5.5kb的片段，即為重組表達(dá)載體pPICZa-EGFP-p2AR。
7. —種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述的重組載體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組EGFP-β2腎上腺素能受體(簡稱EGFP-β2AR)的構(gòu)建和表達(dá)。其特征在于首創(chuàng)性地將增強型綠色熒光蛋白EGFP的基因與人類β2腎上腺素能受體(簡稱β2AR)的基因融合，與酵母表達(dá)載體pPICZα進(jìn)行重組后，在畢赤酵母GS115中獲得表達(dá)。放射配基結(jié)合實驗證明該基因重組受體EGFP-β2AR保留β2配基特異性結(jié)合活性。本發(fā)明提供該種同時具備熒光性質(zhì)和配基結(jié)合活性的重組融合受體元件的構(gòu)建過程，結(jié)構(gòu)特征及其功能鑒定。本發(fā)明為建立一種基于受體—配基系統(tǒng)的具有廣譜性的β2激動劑檢測方法提供了新的途徑。
文檔編號C12P21/02GK101671688SQ200910196519
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者彭可順, 戴小峰, 毛春鴻, 潔 蘇, 陳宇光 申請人:上海大學(xué)