專利名稱：利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸酸奶及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸的酸奶及方法，屬于利用生
物技術(shù)來生產(chǎn)功能性食品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酸奶，它是以新鮮的牛奶為原料，經(jīng)過巴氏殺菌后再向牛奶中添加有益菌(發(fā)酵 劑)，經(jīng)發(fā)酵后，再冷卻灌裝的一種牛奶制品。目前市場上酸奶制品多以凝固型、攪拌型和添 加各種果汁果醬等輔料的果味型為多。酸奶不但保留了牛奶的所有優(yōu)點(diǎn)，而且某些方面經(jīng) 加工過程還揚(yáng)長避短，成為更加適合于人類的營養(yǎng)保健品。 共軛亞油酸是含有共軛雙鍵的一系列十八碳二烯酸，是由必需脂肪酸亞油酸衍 生的共軛雙烯的多種位置與幾何異構(gòu)體的總稱。共軛亞油酸雙鍵在碳鏈上有多種位置及 排列方式，包括8-10，9-10， 10-12和11-13等，每種位置上又存在順順(cis-cis)，順反 (cis-trans)，反順(trans-cis)和反反(trans-trans) 4種構(gòu)象，因此共軛亞油酸的種類十 分豐富。其中順_9、反-11和反_10、順-12共軛亞油酸兩種異構(gòu)體被證實具有很強(qiáng)的生 理活性，前者是與人類和動物營養(yǎng)最為相關(guān)的，存在于瘤胃動物來源的食品中，被稱為瘤胃 酸，具有抗癌作用，后者具有減肥的功效。 目前，科學(xué)界已經(jīng)公認(rèn)了共軛亞油酸的抗癌、減肥、抗糖尿病等功能，因此生產(chǎn)富 含共軛亞油酸的酸奶對于人類的健康具有非常重大的意義，并且有極好的商業(yè)價值。近年 越來越多研究微生物產(chǎn)共軛亞油酸的報道表明大部分細(xì)菌產(chǎn)生共軛亞油酸異構(gòu)體組成較 單一，與天然食物中共軛亞油酸異構(gòu)體組成相似，無毒副作用，有利于產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用。乳酸 菌是其中的代表，乳酸菌具有將游離亞油酸轉(zhuǎn)化為共軛亞油酸的功能特性，且無毒、無害、 易于培養(yǎng)。目前，國內(nèi)外有關(guān)乳酸菌合成共軛亞油酸的研究尚處在菌種篩選和轉(zhuǎn)化條件研 究階段，因此獲得具有較高轉(zhuǎn)化亞油酸為共軛亞油酸能力的乳酸菌，并將其應(yīng)用于功能性 乳制品生產(chǎn)中，提高(或強(qiáng)化)乳品中共軛亞油酸的含量，能夠增強(qiáng)乳品的保健功效，形成 新一類的功能性乳制品。 固定化細(xì)胞技術(shù)是20世紀(jì)70年代興起的一種生物技術(shù)。所謂固定化細(xì)胞技術(shù)是 指用物理或化學(xué)的手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持生物活性、反復(fù)使 用的方法。 固定化細(xì)胞是在固定化酶的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它的優(yōu)點(diǎn)如下
(1)省去了細(xì)胞的分離手續(xù)。為多細(xì)胞系統(tǒng)，無須輔因子再生。 [OOOS] (2)細(xì)胞生長快、數(shù)量多。 (3)可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細(xì)胞，能一邊排 出發(fā)酵液，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗。 (4)保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定性，特別是對污染因子的抵抗力 增加。 將固定化細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)富含共軛亞油酸的酸奶中，不僅有效的提高了酸奶
3中共軛亞油酸的含量，進(jìn)而提高了酸奶的營養(yǎng)保健功能。而且固定化后的細(xì)胞作為催化劑 可以在之后的酸奶生產(chǎn)中重復(fù)使用，還節(jié)約了生產(chǎn)成本，易于應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，創(chuàng)造巨大 的社會及經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種采用生物技術(shù)和固定化細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸、 共軛亞油酸含量轉(zhuǎn)化率高、共軛亞油酸異構(gòu)體單一的酸奶及方法。 本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的，采用的技術(shù)方案為提供一種利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含 共軛亞油酸酸奶，以鮮牛奶、糖、亞油酸為底物，通過菌種生物轉(zhuǎn)化技術(shù)制備酸奶，其底物的 組分為 鮮牛奶 85-95%
糖 5-15%
亞油酸 0.055-1% 根據(jù)本發(fā)明所述利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸酸奶的制備工藝一優(yōu)選技 術(shù)方案，酸奶的制備工藝為 (1)將鮮牛奶預(yù)熱至50 6(TC，加糖溶解過濾，同時加入經(jīng)過0. 22iim濾膜過濾 的無菌亞油酸，由均質(zhì)機(jī)均質(zhì)； (2)將均質(zhì)后的溶液，85t:滅菌5min或95t:滅菌15s ; (3)將滅菌后的溶液，用冰水冷卻至30 4(TC加入細(xì)胞固定化得到的凝珠；
(4)將上述溶液30-40。C反應(yīng)10-50h ; (5)在上述溶液酸度達(dá)到80-90° T、 pH4_5停止發(fā)酵，反應(yīng)結(jié)束后過濾除去凝珠， 冷卻后經(jīng)0-5°C、10-12h后熟制成成品。 根據(jù)本發(fā)明所述的利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸酸奶制備工藝一優(yōu)選技 術(shù)方案所述接種其中包括細(xì)胞固定化法得到的凝珠、嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌。
根據(jù)本發(fā)明所述的利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸酸奶制備工藝一優(yōu)選 技術(shù)方案所述接種細(xì)胞固定化法得到的凝珠、嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌比例為
i : o.i-i : 1，接種量為2%-6%。 根據(jù)本發(fā)明所述的利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸酸奶制備工藝一優(yōu)選技 術(shù)方案所述細(xì)胞固定化得到的凝珠工藝方法為將在脫脂乳中培養(yǎng)10 40h的菌液離心
若干次，直至上清液澄清為止，取下層固相，稀釋倍數(shù)為i : 0.5-1 : 4，取占鮮奶體積的
2_6%的菌液與無菌的濃度為0. 5-3%海藻酸鈉溶液混合，充分?jǐn)嚢杌靹?；將上述混合菌?注入滅菌注射器中，選擇7G-27G型號的針頭，以一定的速度滴入無菌的濃度為1_5%氯化 鈣溶液中，使其凝固成珠狀；凝珠在氯化鈣溶液中固定化O. l-2h后撈出，用無菌水沖洗，洗 去凝珠表面的氯化鈣溶液；風(fēng)干表面水分后待用。 根據(jù)本發(fā)明所述的利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸酸奶制備工藝一優(yōu)選技
術(shù)方案所述的菌種制備方法為，將4t:保藏的可產(chǎn)共軛亞油酸的乳酸菌的斜面菌種，接種
至MRS斜面培養(yǎng)基中，于30-45t:恒溫培養(yǎng)。傳代兩次，以充分恢復(fù)菌種活力。從活化斜面 上挑起一個完整的單菌落接入脫脂乳培養(yǎng)基，37t:靜置培養(yǎng)24-60h，獲得菌體活力較好的 菌液。
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本發(fā)明有益效果在于 1、對海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度及膠粒大小及菌種稀釋比等條件的摸索，成功的得到了顯著提高共軛亞油酸產(chǎn)量的細(xì)胞固定化方法，使得酸奶中的共軛亞油酸含量顯著提高成為可能。 2、本發(fā)明在微生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的基礎(chǔ)上，加之細(xì)胞固定化技術(shù)的運(yùn)用，使得培養(yǎng)基中共軛亞油酸的含量達(dá)到30% 50%的提升。 3、共軛亞油酸轉(zhuǎn)化率高目前國內(nèi)生物合成共軛亞油酸的轉(zhuǎn)化率在30%左右，而采用細(xì)胞固定化技術(shù)之后，共軛亞油酸轉(zhuǎn)化率可以提高到50%以上。 4、安全性好，異構(gòu)體單一。生物合成法相比化學(xué)合成法，反應(yīng)條件溫和且污染小，安全性高，可以放心的應(yīng)用于食品等領(lǐng)域。生物合成的共軛亞油酸異構(gòu)體主要以順-9，反-11和反-10，順-12兩種異構(gòu)體為主，大大提高了其生物活性，具有明顯的保健功能。
5、可以重復(fù)使用固定化之后的乳酸菌細(xì)胞可以重復(fù)利用，大大的節(jié)約了成本，為全自動化生產(chǎn)共軛亞油酸牛奶提供了可能。
具體實施方式
實施例1 利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸的酸奶 1、將4t:保藏的可產(chǎn)共軛亞油酸的乳酸菌的斜面菌種，接種至MRS斜面培養(yǎng)基中，于4(TC恒溫培養(yǎng)。傳代兩次，以充分恢復(fù)菌種活力。從活化斜面上挑起一個完整的單菌落接入脫脂乳培養(yǎng)基，37t:靜置培養(yǎng)40h，獲得菌體活力較好的菌液。 2、將在脫脂乳中培養(yǎng)40h的菌液離心若干次，直至上清液澄清為止，取下層固相，稀釋倍數(shù)為l : 3，取菌液0.2mL與無菌的濃度為2.5X海藻酸鈉溶液混合，充分?jǐn)嚢杌靹颍粚⑸鲜龌旌暇鹤⑷霚缇⑸淦髦?，選擇7G型號的針頭，以一定的速度滴入無菌的濃度為2.5%氯化鈣溶液中，使其凝固成珠狀；凝珠在氯化鈣溶液中固定化2h后撈出，用無菌水沖洗，洗去凝珠表面的氯化鈣溶液；風(fēng)干表面水分后待用。 3、將鮮牛奶10ml預(yù)熱至6(TC，加糖0. 5g溶解過濾，同時加入經(jīng)過O. 22y m濾膜過濾的無菌亞油酸0. lml，由均質(zhì)機(jī)均質(zhì)；
4、將均質(zhì)后的溶液，85"滅菌5min ; 5、將滅菌后的溶液，用冰水冷卻至30 4(TC加入細(xì)胞固定化得到的凝珠；凝珠、嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌比例為1:1
6 、將上述溶液40 °C反應(yīng)24h ; 7、在上述溶液酸度達(dá)到80-90° T、pH4-5停止發(fā)酵，反應(yīng)結(jié)束后過濾除去凝珠，冷卻后經(jīng)0-5°C 、 10-12h后熟制成成品。 8、測定酸奶中共軛亞油酸的最大積累量為523. 39 y g/mL。
實施例2 : 利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸的酸奶 1、將4t:保藏的可產(chǎn)共軛亞油酸的乳酸菌的斜面菌種，接種至MRS斜面培養(yǎng)基中，于45t:恒溫培養(yǎng)。傳代兩次，以充分恢復(fù)菌種活力。從活化斜面上挑起一個完整的單菌落接入脫脂乳培養(yǎng)基，37t:靜置培養(yǎng)30h，獲得菌體活力較好的菌液。
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2、將在脫脂乳中培養(yǎng)40h的菌液離心若干次，直至上清液澄清為止，取下層固相，稀釋倍數(shù)為l : 2，取菌液0.2mL與無菌的濃度為2X海藻酸鈉溶液混合，充分?jǐn)嚢杌靹颍粚⑸鲜龌旌暇鹤⑷霚缇⑸淦髦?，選擇7G型號的針頭，以一定的速度滴入無菌的濃度為3X氯化鈣溶液中，使其凝固成珠狀；凝珠在氯化鈣溶液中固定化2h后撈出，用無菌水沖洗，洗去凝珠表面的氯化鈣溶液；風(fēng)干表面水分后待用。 3、將鮮牛奶10ml預(yù)熱至6(TC，加糖0. 5g溶解過濾，同時加入經(jīng)過O. 22y m濾膜過濾的無菌亞油酸0. lml，由均質(zhì)機(jī)均質(zhì)；
4、將均質(zhì)后的溶液，85"滅菌5min ; 5、將滅菌后的溶液，用冰水冷卻至30 4(TC加入細(xì)胞固定化得到的凝珠；凝珠、嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌比例為1:1
6 、將上述溶液40 。C反應(yīng)24h ; 7、在上述溶液酸度達(dá)到80-90° T、pH4-5停止發(fā)酵，反應(yīng)結(jié)束后過濾除去凝珠，冷卻后經(jīng)0-5°C 、 10-12h后熟制成成品。 8、測定酸奶中共軛亞油酸的最大積累量為517. 60 y g/mL。 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸的酸奶，其特征在于以鮮牛奶、糖、亞油酸為底物，通過菌種生物轉(zhuǎn)化技術(shù)制備的酸奶，其底物的組分為鮮牛奶85-95％糖5-15％亞油酸0.055-1％
2. —種制備利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸酸奶的方法，其特征在于酸奶的制 備工藝為，(1) 將鮮牛奶預(yù)熱至50 6(TC，加糖溶解過濾，同時加入經(jīng)過O. 22iim濾膜過濾的無 菌亞油酸，由均質(zhì)機(jī)均質(zhì)；(2) 將均質(zhì)后的溶液，85t:滅菌5min或95。C滅菌15s ;(3) 將滅菌后的溶液，用冰水冷卻至30 4(TC加入細(xì)胞固定化得到的凝珠；(4) 將上述溶液30-40。C反應(yīng)10-50h ;(5) 在上述溶液酸度達(dá)到80-90° T、 pH4-5停止發(fā)酵，反應(yīng)結(jié)束后過濾除去凝珠，冷卻 后經(jīng)0-5°C 、 10-12h后熟制成成品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸酸奶的制備方法，其特 征在于所述接種其中包括細(xì)胞固定化法得到的凝珠、嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸酸奶的制備方法， 其特征在于所述接種細(xì)胞固定化法得到的凝珠、嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌比例為i : o.i-i : 1，接種量為2%-6%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3、4所述的利用固定化技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸酸奶的制備方法，其 特征在于所述細(xì)胞固定化得到的凝珠工藝方法為將在脫脂乳中培養(yǎng)10-40h的菌液離心若干次，直至上清液澄清為止，取下層固相，稀釋倍數(shù)為i : 0.5-1 : 4，取取占鮮奶體積的2-6%的菌液菌液與無菌的濃度為0. 5-3%海藻酸鈉溶液混合，充分?jǐn)嚢杌靹?；將上述混?菌液注入滅菌注射器中，選擇7G-27G型號的針頭，以一定的速度滴入無菌的濃度為1-5% 氯化鈣溶液中，使其凝固成珠狀；凝珠在氯化鈣溶液中固定化O. l-2h后撈出，用無菌水沖 洗，洗去凝珠表面的氯化鈣溶液；風(fēng)干表面水分后待用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞固定化得到的凝珠工藝方法，其特征在于所述的菌種 制備方法為，將4t:保藏的可產(chǎn)共軛亞油酸的乳酸菌的斜面菌種，接種至MRS斜面培養(yǎng)基 中，于30-45t:恒溫培養(yǎng)。傳代兩次，以充分恢復(fù)菌種活力。從活化斜面上挑起一個完整的 單菌落接入脫脂乳培養(yǎng)基，37t:靜置培養(yǎng)24-60h，獲得菌體活力較好的菌液。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供一種富含共軛亞油酸酸奶及生產(chǎn)方法。共軛亞油酸是由必需脂肪酸亞油酸衍生的共軛雙烯的多種位置與幾何異構(gòu)體的總稱，被證實具有很多的生理活性。固定化細(xì)胞技術(shù)是指用物理或化學(xué)的手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持生物活性、反復(fù)使用的方法。我們研究發(fā)現(xiàn)通過固定化細(xì)胞技術(shù)可以大幅度提高酸奶中共軛亞油酸含量，而目前市售酸奶中的共軛亞油酸的含量普遍較低，故將本發(fā)明應(yīng)用于酸奶生產(chǎn)中，利用固定化細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)富含共軛亞油酸的酸奶，使其中的共軛亞油酸的含量大幅提高，使其生理功能更加突出。
文檔編號A23C9/13GK101755911SQ20091024873
公開日2010年6月30日 申請日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者李鵬, 王際輝 申請人:大連工業(yè)大學(xué)