專利名稱：一種用于加速契達干酪成熟的修飾性瑞士乳桿菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種經(jīng)熱應激處理后的修飾性瑞士乳桿菌。
背景技術：
契達干酪原產(chǎn)于英國的契達村，屬細菌成熟的硬質干酪，因現(xiàn)在美國大量生產(chǎn)，故 又稱"美國干酪"。成品指標一般為水分39 % ，脂肪32 % ，蛋白質25 % ，食鹽1. 4% 1. 8 % 。 香味濃郁，色澤呈白色或淡黃色，質地均勻，組織細膩，具有該干酪特有的紋理圖案。
契達干酪的制作通常包括原料乳的預處理，發(fā)酵劑和凝乳酶的添加，切割、加溫 攪拌及排除乳清，凝塊的反轉堆積，破碎與加鹽，壓榨成型以及成熟等步驟。整個成熟期長 達6個月以上。若在4 1(TC條件下，則成熟期需6 12個月。因此，如何提高成熟速度， 是契達干酪制作亟待解決的問題。 在契達干酪加速成熟領域，采用修飾性發(fā)酵劑的方法中常用的菌種包括乳球菌混 合菌株(mixed lactococci strains)，德氏乳桿菌保加利亞亞種(L. bulgaricus)，干酪乳 桿菌(L. casei)，瑞士乳桿菌(L. helveticus)。瑞士乳桿菌是其中一個重要的菌種，發(fā)明人 嘗試通過提供一種新的經(jīng)熱應激修飾后的菌株，以達到加快契達干酪成熟的目的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的經(jīng)熱應激修飾的瑞士乳桿菌，用于提高契達干酪 的成熟速度。 本發(fā)明以瑞士乳桿菌(lactobacillus helveticus)作為出發(fā)菌，采用活化培養(yǎng)至 活力恢復，并進行高密度培養(yǎng)，經(jīng)過熱應激參數(shù)優(yōu)化篩選后，發(fā)現(xiàn)采用一定參數(shù)條件應激修 飾后的瑞士乳桿菌能夠顯著加快契達干酪成熟。本發(fā)明熱應激處理菌株的條件是在50 80。C下處理5 100秒，優(yōu)選60 70。C下處理10 40S，更優(yōu)選在65。C下處理30S。
具體而言，從原始凍干菌株出發(fā)獲得本發(fā)明菌株的方法包括如下步驟
1.菌株活化 菌株瑞士乳桿菌純菌株凍干粉 活化培養(yǎng)基8% 15%的脫脂奶培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)溫度25 45 。C 活化培養(yǎng)時間2 48小時 2.菌株高密度培養(yǎng) 培養(yǎng)基配方8% 15%脫脂奶，酵母提取物0. 1% 5.0%，蛋白胨O. 1% 5. 0%， CaC03 0. 1% 5. 0%，乳糖0. 1% 5. 0%， K2HP040. 05% 5. 00%。
培養(yǎng)溫度25 45。C
培養(yǎng)時間8 72小時 經(jīng)8 72小時培養(yǎng)后，菌體密度達到108 1(Tcfu/ml。
3.熱應激修飾菌株制備
采用蠕動泵、精密水浴鍋、冰浴等組合設備進行熱處理。 熱處理溫度50 80°C 熱處理時間5秒 100秒 保存條件-20。C 4。C，3天 6個月。
目標菌株選擇具有較高細胞胞內肽酶活力的乳酸菌，瑞士乳桿菌為首選。
上述方案具有良好的可重復性。經(jīng)熱應激處理后得到的菌株可以使契達干酪的成 熟時間縮短至2個月。本領域技術人員應當理解，本發(fā)明也可以直接使用已活化的菌株或 經(jīng)高密度培養(yǎng)的菌株進行熱應激處理。 本發(fā)明中，若未特別指明，百分比用"％ "符號表示，是指重量的比例；但溶液的百 分比，是指溶液100ml中含有溶質若干克。 本發(fā)明通過對瑞士乳桿菌在特定條件下進行熱激處理獲得了能夠顯著提高干酪 成熟的修飾性菌株，可以使契達干酪的成熟時間縮短至2個月，并且在質地和口感上保持 了原有的特點和風味。
具體實施例方式
以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
本發(fā)明采用如下方法進行熱應激處理 [OOSO] 1.菌株活化至活力恢復 2.高密度培養(yǎng)至菌株密度達到108 1010cfu/ml 3.采用一定的熱激條件(熱激溫度與時間)進行熱激處理 4.研究處理后的菌株性質(與干酪加工與成熟相關的性質)包括產(chǎn)酸能力、活菌 數(shù)、蛋白水解能力、脂肪分解能力、酶活力水平等，并經(jīng)實際應用在干酪制作中測定對成熟 的影響。 在本發(fā)明使用瑞士乳桿菌，經(jīng)活化培養(yǎng)后，優(yōu)化了菌株高密度培養(yǎng)條件，使菌體密 度達到108 10 fu/ml。通過熱應激溫度與時間兩因素的優(yōu)化與篩選，確定了熱應激條件 的范圍，對熱應激的菌株相關性質及對契達干酪成熟的影響進行了研究。研究后發(fā)現(xiàn)，采用 某一條件范圍內的熱應激菌株，可以明顯提高契達干酪的成熟，縮短成熟時間。
實施例1 本例以瑞士乳桿菌凍干菌株(6024，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)作為對 象來制備本發(fā)明菌株。制備方法包括如下步驟 1)活化培養(yǎng)將原始菌種在無菌條件下分別接種于8%的脫脂奶培養(yǎng)基上，在 25t:條件下培養(yǎng)2天； 2)高密度培養(yǎng)將步驟1)培養(yǎng)的菌種在無菌條件下分別接種1%于液體培養(yǎng)基中 (含酵母提取物O. 1%，蛋白胨0. l%，CaC03 0. 1%，乳糖0. 1%，K2HP04 0 . 05%，pH = 5. 6)。 在25t:條件下，在全自動生化反應罐里培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)結束時菌懸液中活菌數(shù)達108 1010cfu/ml。
4[OO39] 3)熱應激處理將步驟2)獲得的菌懸液，進行熱處理，處理條件為60°C ， 30秒。
4)菌株保存0-4 °C冷藏3天。
實施例2干酪應用實驗 本例采用實施例1制得的瑞士乳桿菌，來考察其在干酪加工中的應用效果。 [OO43] 實驗材料瑞士乳桿菌(6024)、實施例1制得的瑞士乳桿菌、發(fā)酵劑(購自科漢森 公司)、凝乳酶(購自科漢森公司)、純牛奶
實驗方法 實驗分組實驗組(添加實施例1制得的瑞士乳桿菌)、陰性對照(添加未經(jīng)處理 的瑞士乳桿菌6024)、空白對照(未添加瑞士乳桿菌)
干酪加工方法 Cheddar干酪的制作參照Wilkinson(1994)等人的方法，略有修改。新鮮牛乳標 準化(調整蛋白/脂肪=0. 80)后，放入干酪半自動制造機的不銹鋼槽中進行干酪制作。 首先標準化后的原料乳經(jīng)64°C 30分鐘巴氏殺菌，冷卻至3(TC接入1% (v/v)發(fā)酵劑菌種 (等體積熱激修飾后菌株同時加入作為實驗組)，經(jīng)40-50分鐘保溫后加入凝乳酶和0. 01% (w/v)氯化鈣，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)40-60分鐘待凝乳形成后，用不銹鋼切刀切割成0. 5cm見方 的小塊。切割后的小凝塊在干酪槽中在50分鐘內從3(TC均速升至38°C，并保溫15-30 分鐘后開始出料。之后，排出乳清、堆疊，緩慢收縮乳粒待pH降至5. 5-5. 6時加入食用鹽 (0. 15-0. 30g/100ml原料乳)，并繼續(xù)攪拌至混合均勻。裝入不銹鋼模具內并采用柱塞式壓 力設備進行壓搾。制好的成品真空包裝后，4-7t:保存。 結果從進入成熟期后，定期檢測干酪成熟的相關指標，包括可溶氮水平、質構特 性、微觀結構，結果表明加入熱激菌株與未添加相比，干酪的制作工藝不改變，成品組分無 顯著差異。而其它成熟指標則表明熱激菌株的添加具有促進干酪成熟的作用，如表1所示。
表1干酪成熟對比實驗
實驗 分組檢測項目14天28天56天84天
實 驗 組水溶性氮占干酪總氮％5.467.4110.5212.98
磷錫酸可溶性氮占干酪總氮％0.761.141.562.36
硬度(kg)4.52154.19843.9725
空 白. 對 昭水溶性氮占干酪總氮％5.326.349.2110.92
磷鵠酸可溶性氮占干酪總氮％0.560.811.031.46
硬度(kg)5.00474.87154.6652 從上表可以看出，實驗組56天成熟時，干酪成熟的相關指數(shù)，如水溶氮水平、磷鎢 酸可溶氮、質構特性(硬度)與84天對照組成熟干酪相當，感官檢驗無不良風味。同時，采 用透鏡電鏡分別觀察實驗組與對照組干酪在成熟56天和84天時的干酪微觀結構，觀測到 的結果與上述結論一致。 而陰性對照組，由于添加了未經(jīng)熱激處理的菌株，在干酪制作過程中產(chǎn)酸過快，使
5得凝乳、熱煮、保溫、堆疊等過程時間進程縮短，強烈干擾制作過程，造成制作完成時終產(chǎn)品 質地變軟，風味不良，產(chǎn)生酸苦味等嚴重質量缺陷，無法食用，不能做為干酪成品。
實施例3菌種制備 本例以瑞士乳桿菌凍干菌株(10532，購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)作為對 象來制備本發(fā)明菌株。制備方法包括如下步驟 1)活化培養(yǎng)將原始菌種在無菌條件下分別接種于15%的脫脂奶培養(yǎng)基上，在 45t:條件下培養(yǎng)2小時； 2)高密度培養(yǎng)將步驟1)培養(yǎng)的菌種在無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基中 (含酵母提取物5. 0%，蛋白胨5. 0%，CaC03 5. 0% ，乳糖5. 0% ，K2HP04 5 . 00% )。在45。C條 件下，在全自動生化反應罐里培養(yǎng)8小時，培養(yǎng)結束時菌懸液中活菌數(shù)可達108 1(Tcfu/ ml ; 3)熱應激處理將步驟2)獲得的菌懸液，進行熱處理，處理條件為70°C ， 8秒；
4)菌株保存-20。C冷凍保存6個月。 將上述方法制備得到的菌劑用于契達干酪的制備中(同實施例2)，結果表明，與 未添加熱激菌種相比，契達干酪的成熟時間縮短了 1個月。
實施例4菌種制備 本例以瑞士乳桿菌凍干菌株(1. 1877，購自中科院微生物菌種保藏中心)作為對 象來制備本發(fā)明菌株。制備方法包括如下步驟 1)活化培養(yǎng)將原始菌種在無菌條件下分別接種于10%的脫脂奶培養(yǎng)基上，在 3(TC條件下培養(yǎng)10小時； 2)高密度培養(yǎng)將步驟1)培養(yǎng)的菌種在無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基中 (含酵母提取物2. 0%，蛋白胨5. 0%， CaC032. 0%，乳糖3. 0%， K2HP042 . 00% )。在30。C條 件下，在全自動生化反應罐里培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)結束時菌懸液中活菌數(shù)達108 1(Tcfu/ ml ; 3)熱應激處理將步驟2)獲得的菌懸液，進行熱處理，處理條件為60°C ， 50秒；
4)菌株保存-2(TC冷凍保存6個月。 將上述方法制備得到的菌劑用于契達干酪的制備中(同實施例2)，結果表明，與 原始菌種相比，契達干酪的成熟時間縮短了 l個月。 在菌種制備過程中，發(fā)明人意外獲得一株綜合性狀較好的菌株，與原始菌種相比， 契達干酪成熟的時間縮短了一個半月左右。該菌株已于2009年11月18日在中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學院 微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus) SY-HSM-LH01保藏號為CGMCC No. 3454。
權利要求
一種用于加速契達干酪成熟的修飾性瑞士乳桿菌，其通過如下方法制備獲得以瑞士乳桿菌(lactobacillus helveticus)為出發(fā)菌株，經(jīng)高密度培養(yǎng)后，在50～80℃下熱應激處理5～100秒。
2. 如權利要求1所述的修飾性瑞士乳桿菌，其特征在于，經(jīng)高密度培養(yǎng)后，60 7(TC下處理10 40S。
3. 如權利要求1或2所述的瑞士乳桿菌，其特征在于，所述的出發(fā)菌種為瑞士乳桿菌6024。
4. 如權利要求1或2所述的修飾性瑞士乳桿菌，其特征在于，所述高密度培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含8 % 15 %脫脂奶，酵母提取物0. 1 % 3. 0 % ，蛋白胨0. 1 % 3. 0 % ， CaC030. 1% 3. 0%，乳糖0. 1% 3. 0%，K2HP04 0 . 05% 5. 00%;培養(yǎng)溫度為25 45°C ;培養(yǎng)時間為8小時 72小時。
5. 權利要求1 4任一項所述修飾性瑞士乳桿菌的制備方法，其包括如下步驟以瑞士乳桿菌(lactobacillus helveticus)為出發(fā)菌株，經(jīng)高密度培養(yǎng)后，在50 8(TC下熱應激處理5 100秒。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，經(jīng)高密度培養(yǎng)后，在60 7(TC下熱應激處理10 40秒。
7. 如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述高密度培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為8% 15%脫脂奶，酵母提取物0. 1% 3. 0%，蛋白胨0. 1% 3. 0%， CaC03 0. 1 % 3. 0%，乳糖0. 1% 3. 0%， K2HP040. 05% 5.00% ;培養(yǎng)溫度為25 45°C ;培養(yǎng)時間為8小時 72小時。
8. 權利要求1 4任一項所述的修飾性瑞士乳桿菌在制備契達干酪中的應用。
9. 瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus) SY-HSM-LH01保藏號為CGMCC No. 3454。
10. 權利要求9所述菌株在制備契達干酪中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種經(jīng)熱應激改造后的修飾性瑞士乳桿菌。所述修飾性瑞士乳桿菌通過如下方法制備獲得以瑞士乳桿菌(lactobacillus helveticus)為出發(fā)菌株，經(jīng)高密度培養(yǎng)后，在50～80℃下熱應激處理5～100秒。實驗表明，本發(fā)明修飾性瑞士乳桿菌能夠顯著加快契達干酪的成熟，可以使契達干酪的成熟時間縮短至2個月，并且在質地和口感上保持了原有的特點和風味。
文檔編號A23C19/032GK101748090SQ20091025242
公開日2010年6月23日 申請日期2009年12月4日 優(yōu)先權日2008年12月8日
發(fā)明者陳歷俊, 隋欣 申請人:北京三元食品股份有限公司