專利名稱：：γ-聚谷氨酸或其鹽類作為添加劑在乳制品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種Y-聚谷氨酸或其鹽類作為添加劑在乳制品中的應(yīng)用，屬于食品添加劑應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體『fr]言，本發(fā)明涉及一種聚谷氨酸(:h型)或y-聚谷氨酸鈉(Na型)或其與-一種或多種礦物離子(Oe2—、Zn2、Mg2+，F(xiàn)e3—'—，Cu"形成的聚氨基酸螯合鹽類，或其混合物，作為一種新型添加劑,提卨乳制品中礦物營(yíng)養(yǎng)含量，并在小腸中阻止磷酸鹽對(duì)礦物離子的沉淀而使其緩慢釋放，且能掩蔽因礦物離子的加入導(dǎo)致的對(duì)奶制品風(fēng)味和口感的破壞，同時(shí)岡大分子聚氨基酸的加入也能賦予乳制品更好的結(jié)構(gòu)特性，起到增稠、提高穩(wěn)定性、抗凍等效果。
背景技術(shù)：
：礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)在人類營(yíng)養(yǎng)中起到非常重要的作用，鈣缺乏會(huì)引起佝僂病或骨質(zhì)疏松癥，鐵缺乏會(huì)引起貧血，明顯降低工作和免疫能力。2004年"中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康現(xiàn)狀"調(diào)査報(bào)告顯示鈣缺乏程度非常嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥患者總數(shù)約在9()()()萬(wàn)人左右，占全閨總?cè)丝诘慕?%。我國(guó)居民鐵缺乏問(wèn)題也非常嚴(yán)重，貧血患病率為15.2%，絕大部分是缺鐵性貧血。乳品是營(yíng)養(yǎng)最全面的理想食品，富含人體生長(zhǎng)發(fā)育所必需的各種氨基酸和礦物元素。近年來(lái)，人們消費(fèi)乳制品的意識(shí)不斷增強(qiáng)，加之國(guó)家積極倡導(dǎo)人們消費(fèi)乳制品，乳制品成為人們?nèi)粘Ｉ铄环N革:要的營(yíng)養(yǎng)食品，乳品行業(yè)也成為我國(guó)新興而又極具發(fā)展?jié)摿κ称沸袠I(yè)，被杜會(huì)公認(rèn)為"朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)"。同時(shí)，人們購(gòu)買乳制品不僅注重"U感、U味"，更加關(guān)心其營(yíng)養(yǎng)成分及功能性、安全性,對(duì)品質(zhì)的要求不斷提高，具有優(yōu)質(zhì)、安全、風(fēng)味、便捷等特點(diǎn)的產(chǎn)品成為消費(fèi)熱點(diǎn)。目前酪蛋白磷酸肽(CPP)在食品中作為礦物質(zhì)吸收促進(jìn)劑的使用比較普遍,但因?yàn)槠鋬r(jià)格卨、水溶性差、有不良的苦味，而在應(yīng)用效果和應(yīng)用成本上受到一定的限制。研究開(kāi)發(fā)價(jià)格低廉、適合大眾食品使用的新型礦物質(zhì)吸收促進(jìn)劑仍M得十分迫切。Y-聚谷氨酸(Y-poly-glutamicacid，簡(jiǎn)寫Y-PGA)是自然界巾微生物發(fā)酵產(chǎn)生的水溶性多聚氨基酸，它具有親水性，生物可降解性，無(wú)毒性，生物可容性，無(wú)免疫原性等特征。Y-PGA具有優(yōu)良的促進(jìn)礦物質(zhì)元素吸收效果，并且水溶性好，能夠較好地掩蓋強(qiáng)化食品中所添加礦物元素的不良U味,并界f.f增稠和抗凍、降血氨等功效，因而具^(guò)廣闊的應(yīng)用前景。除了Y-PGA，其鈉、鉀、鎂或鈣鹽等也nJ作為食物營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充齊U。微生物產(chǎn)生的Y-:PGA是線性高分子多肽，黏度很大，分子量太大容易造成牛物膜屏障，導(dǎo)致礦物質(zhì)的利用率降低。針對(duì)y-PGA的不同用途，其效果受到其分子量大小影響較大，隨著分子量增大，y-P(;A的鈣螯合能力先變大，W變小，到-'定程度乂變大(Ko皿oA，1989);抗凍活性在.'定范圍內(nèi)隨Y-:PGA的分子防咸小而增大(Shihetal.，2003)。食品中常用的分子量范闈在150，000到2，000，000，最好在200,000到500，000之間(Ko皿oA,1989)。目前己經(jīng)有各種制備不同分子量Y-PGA的方法的提出，主要包括熱、酸、堿、超聲波及特殊的酶和微生物作j-tjF發(fā)生降解。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在f獲得一種Y-聚谷氨酸或其鹽類作為添加劑或作為促進(jìn)劑在乳制品中的新用途。具休而言，本發(fā)明的目的獲得--種Y-聚谷氨酸(H型)或Y-聚谷氨酸鈉(Na型)或其與一種或多種礦物離子(Ca2+,He2Zn2i，Mg2+，He3+，CU2i)形成的聚氨基酸螯合鹽類，或其混合物，作為-,中新型添加劑，提高乳制品中礦物營(yíng)養(yǎng)含量，并在小腸中阻止磷酸鹽對(duì)礦物離子的沉淀而使其緩慢釋放，且能掩蔽岡礦物離子的加入導(dǎo)致的對(duì)奶制品風(fēng)味和口感的破壞，同時(shí)因人分子聚氨基酸的加入也能賦予乳制品更好的結(jié)構(gòu)特性，起到增稠、提高穩(wěn)定性、抗凍等效果。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下聚谷氨酸或其鹽類作為增稠劑、穩(wěn)定劑、抗凍劑、礦物營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、礦物吸收促進(jìn)劑在乳制品中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用包括使所述的聚谷氨酸或其鹽類為H型Y-聚谷氨酸或Na型Y-聚谷氨酸鈉或與一種或多種如Ca2+，卜V+，Zn2i，Mg2、He^012+礦物離子形成的聚氨基酸螯合鹽類或其混合物，所述的Y-聚谷氨酸或其鹽類的使用分子量為5l()OOKDa，添加濃度為所述乳制品總重的0,0015%。上述的應(yīng)用的產(chǎn)品包括乳制品為殺菌乳、火菌乳、含乳飲料、乳粉、發(fā)酵乳、干酪或冰激凌。本發(fā)明的應(yīng)用方法包括所述Y-聚谷氨酸或其鹽類的添加方式為在乳制品配料時(shí)或加工過(guò)程中或加工完成后將所述的聚谷氨酸或其鹽類以溶液或T粉形式與食品其他組分均勻混合。下列用途是本發(fā)明的典型用途舉例所述的聚谷氨酸或其鹽類在殺菌乳，滅菌乳，含乳飲料中的用途，其中作為礦物營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，或作為防止乳清析出和沉淀形成的穩(wěn)定劑和或增稠劑。所述的Y-聚谷氨酸或其鹽類在乳粉中的用途，其中作為礦物吸收促進(jìn)劑和Z或礦物營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑。所述的Y-聚谷氨酸及其鹽類在酸乳用途，其中作為延緩酸奶中乳酸菌的衰廣:的抗凍劑，作為礦物吸收促進(jìn)劑和/或礦物營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑。所述的Y-聚谷氨酸或鹽類在冰激凌中的用途，其中作為使冰激凌在凝凍和硬化中形成的冰晶更細(xì)微的抗凍劑。所述的Y-聚谷氨酸或其鹽類在干酪中的用途,其中作為增強(qiáng)干酪可塑性、彈性并掩蓋其苦味的形成的穩(wěn)定劑。本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是針對(duì)上述乳制品中其它礦物營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑存在的成本高、水溶性差、穩(wěn)定性差、給食品屮帶來(lái)不良的滋氣味等問(wèn)題而提供一種成本低廉，可大批量生產(chǎn)，多功能乳制品添加劑。本發(fā)明為解決上述的問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為通過(guò)微生物發(fā)酵法大量生產(chǎn)，再通過(guò)后處理工藝，得到不同分子量及不同礦物螯合型的PGA系列產(chǎn)品，滿足在奶粉，奶酪，冰激凌,酸奶，含乳飲料及其他含乳食品等不同產(chǎn)品的應(yīng)用需求。按上述方案，本發(fā)明中使用的Y-PGA生產(chǎn)菌株為本申請(qǐng)人的農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選的地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)WX-02，該茼株于2008年4月28閂送交位于湖北省武漢市武漢人學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCCN0:M208065，其詳細(xì)內(nèi)容己經(jīng)申請(qǐng)相關(guān)發(fā)明專利，專利申請(qǐng)?zhí)枮?200810055068,'1。^利申請(qǐng)?zhí)枮?008丄0055068,4相關(guān)聯(lián)的技術(shù)方案是K齒種的分離與篩選稱取湖北應(yīng)城鹽礦高鹽環(huán)境土樣lgT滅菌試管中，加無(wú)菌水9mL，用棉塞封口，振蕩2min，然后放水浴鍋中，8(rC加熱10分鐘，再靜置)0min。冷卻后，吸取i:清液0.1mL，稀釋10-2,10-3，分別取0,2mL，涂布LB平板，37。C培養(yǎng)48h觀察結(jié)果，挑選在LB培養(yǎng)基上呈乳液狀能拉絲的單菌落,接入新鮮液體種子培養(yǎng)某屮，37。C搖床培養(yǎng)12h后，按2%的接種量分別接種到裝W50mL滅菌基本發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37i:，190r/min，振蕩培養(yǎng)36h結(jié)束發(fā)酵。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物分別取樣離心除去菌體，用3倍乙醇沉淀上清液，輕輕振蕩后丄2000iVmin離心i5min，收集沉淀物，冷凍干燥，再加入蒸餾水溶解沉淀物，透析去除離子，利用HPLC檢測(cè)產(chǎn)物。將篩選到的菌株按照規(guī)定方法進(jìn)行菌種鑒定。鑒定后獲得地衣芽胞桿菌(Bacilluslichoniformis)WX-02，該菌株丁'2008年4月281.....i送交位丁'湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏巾心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCCN():M:2()8065。地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)WX-02的菌學(xué)特征如下菌體:有桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，芽胞近似圓形，偏端生。在LB固體培養(yǎng)朵I菌落圓形，邊緣不齊，毛發(fā)狀，菌苔干燥，不透明，蔓延，灰O色。最適生長(zhǎng)溫度30-37'C，適宜pH6.8-7.2。接觸酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性,硝酸鹽利用陽(yáng)性，檸檬酸鹽利用陽(yáng)性，明膠液化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。遺傳特性該菌株無(wú)質(zhì)粒，聚-y-谷氨酸合成酶基因位于染色休上。該菌株產(chǎn)牛聚-y-谷氨酸的性能穩(wěn)定，連續(xù)傳代2()次以上,該菌株合成聚-y-谷氨酸的能力不變。聚-y-谷氨酸產(chǎn)生菌BacillusLichcniformisWX-0216SrDNA基因序列有1263個(gè)堿基，Genebank登錄號(hào)EU564336，結(jié)合1.6SrDNA分子鑒定與前面的生理生化鑒定結(jié)果，鑒定WX-02為芽胞桿菌屬地衣芽胞桿菌。菌種培養(yǎng)、傳代和保藏地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)WX-02在常用的LB培養(yǎng)基同體斜面上3(rc-37。c培養(yǎng)，njf'rc短期保藏，y'油管可于-7(rcK期保藏作為原始菌種；生產(chǎn)菌種可從原始菌種中轉(zhuǎn)接。地衣芽胞桿菌菌株WX-02，在實(shí)驗(yàn)室條件下的長(zhǎng)期保藏按下列歩驟A、將地衣芽胞桿齒菌株WX-()2在I.B培養(yǎng)基固體斜面....匕30°C-37°C培養(yǎng)；B、刮取菌苔至無(wú)菌的20%甘油保藏管中C、于-70。C下冰筘中冷凍保藏。2、利用地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)WX-02菌株生產(chǎn)聚-Y-谷氨酸的力'法如下:種子液制備A、將冷凍保藏的地衣芽胞桿菌WX()2接種到含蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克Z升、NaCl丄0克/升、瓊脂丄5克Z升、pH為7,0的LB固休培養(yǎng)基平板上，37T培養(yǎng)24-36小時(shí)，使其活化；0033]B、將步驟A上活化的種子(菌種)轉(zhuǎn)接到含蛋白胨10克./升、酵母浸出物5克Z升、NaC:l.1.0克/升、補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅茼前調(diào)培養(yǎng)基的pH:為7,0的LB三角瓶液體種子培/卜-基中，于30。C-37。C，200rpm培養(yǎng)14-16小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期();發(fā)酵生產(chǎn)A、按照每1升培養(yǎng)基的加入量配置發(fā)酵培養(yǎng)基，配方如K:谷氨酸40-l()()g/L;葡萄糖50-丄00g/'L;檸檬酸丄0-30g/L;氯化銨3-20g/L;K2HP04*3H200.丄-2g/'L;MgS047H2〔)().卜2g/L;h'eCI36H2()().()卜().lg/L;CaCI22H2()().卜2g/L;補(bǔ)充蒸餾水至l()()()ml，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的PH為7.0-7.5(作為優(yōu)選方案該發(fā)酵培養(yǎng)基成分(g/L)為谷氨酸鈉70，葡萄糖7()，檸檬酸鈉8，氯化銨8，MnS()4H2()0,01，M:gS()47H2()0,2，K2:HP()40,8，ZnS()4,7:H2()0,2,CaCl22II200,2)。B、按發(fā)酵罐容積的60-80%投入上述發(fā)酵培養(yǎng)棊，以0,07-0.1Mpa高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，冷卻至30°C-37t:接入種子液;在30°C-37°C條件下培養(yǎng)，通氣量1:0,5-2(v/v)。(3)提取與精制將所述的地衣芽胞桿齒菌株WX-()2采用常規(guī)液體深層發(fā)酵方法生產(chǎn)，28-36小時(shí)結(jié)束發(fā)酵；然后離心除菌體，收集上淸液，并用95%的乙醇沉淀聚-Y-谷氨酸，回收得到聚-Y-谷氨酸。通過(guò)上述方法得到人于lOOOKDa分子量的Y-PGA。作為本發(fā)明主題的應(yīng)用，對(duì)發(fā)酵及提取得到的高分子Y-PGA進(jìn)行酸水解，通過(guò)控制pH值(13)、溫度(50IO(TC)和水解時(shí)間(0.58h)得到不同區(qū)間分子量(10lOOOKDa)的y-PGA的產(chǎn)品。按上述方案，本發(fā)明中得到不同礦物螯合型的PGA產(chǎn)品有兩種方式。方法之一是向Y-聚谷氨酸溶液中，加過(guò)量的C形式、形式、Zn2+形式、Mg2+形式、形式、Cu2—'—形式的可溶性鹽類(如氯化鹽，硫酸鹽，檸檬酸鹽，乙酸鹽等)，控制條件p朋8/3037。C，震蕩混合12小時(shí)，用去離子水透析除去過(guò)量的游離離子，然后再將產(chǎn)物按照常規(guī)方法進(jìn)行冷凍干燥，即得到Y(jié)-聚谷氨酸Ca21形式的螯合物、Fe21形式的螯合物、Zn21形式的螯合物、Mf形式的螯合物^63+形式的螯合物、Cu2t形式的螫合物。方法之二是將Y-聚谷氨酸溶液的PH調(diào)到2.2左右，用去離子水透析除去游離的雜離子,再用Ca2—'—形式、Fe2—形式、Zn"形式、Mg"形式、:Fe"形式、Cu"形式的氧化物或氫氧化物澄清溶液中和至p:H到67，冷凍干燥即得到Y(jié)-聚谷雙泡Ca2+形式的螯合物、Fe2^形式的螯合物、Zn2^形式的螯合物、Mg2+形式的螯合物、卜Vi形式的益合物、Cu2+形式的螯合物。按上述方案，可將1、H分子量的、不M礦物螯合型的Y-PGA粉劑或配成-'定濃度的溶液，在乳制品配料時(shí)或加丄過(guò)程中或加工完成后將Y-聚谷氨酸及其鹽類以溶液或千粉形式與食品其他組分均勻混合，可經(jīng)過(guò)乳品加工過(guò)程中6014(TC的熱處理、-404°C的冷處理、采用常規(guī)噴霧千燥及均質(zhì)等加工處理方法而對(duì)效果影響不大。按上述方案，奶粉，奶酪，冰激凌，酸奶，含奶飲料中螯合型的Y-PGA的使用量占fe品虛^的(〗，O()lwt,%至5wt,%,使用Y-PGA的分了量范圍為5l()()OKDa。史i丫細(xì)的技術(shù)方案參見(jiàn)《具休實(shí)施方式》所描述的內(nèi)容。圖1:顯示不同分r*Y-PGA及其礦物螯合物的制備流程圖圖2:顯示Y-PGA不l「fj分子量標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)凝膠分子篩的色譜圖，按出峰時(shí)間從先到后依次對(duì)應(yīng)的分子量為800KDa，600KDa，200KDa，lOOKDa，80KDa，50KDa圖3:顯不在p:H=1，8(rC條件下水解制備的不同分了量y-PGA的凝膠分了f帝的色譜圖，按出峰時(shí)間從先到后對(duì)應(yīng)的水解時(shí)間為0h，0,5hah，2h，3h，4h.由于微牛物發(fā)酵過(guò)程中自身酶系會(huì)對(duì)y-P(;A部分酶解，產(chǎn)生l()()KI)a大小的片段，因此開(kāi)始水解的樣品會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)峰，而隨著水解進(jìn)行，分子量分布范圍變窄逐漸融合為-'個(gè)峰。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:聚-y-谷氨酸產(chǎn)生菌地衣芽胞桿菌WX-02的分離、鑒定稱取湖北應(yīng)城鹽礦高鹽環(huán)境土樣lg于滅菌試管中，加無(wú)菌水9mL，用棉塞封U，振蕩2min，然后放水浴鍋中，8(rC加熱10分鐘，再靜置3()min。冷卻后，吸取....匕清液0.1mL，稀釋丄0-2，丄0-3，分別取0,2mL，涂布LB平板，37。C培養(yǎng)48h觀察結(jié)果，挑選在LB培養(yǎng)基上呈乳液狀能拉絲的單齒落，接入新鮮液體種子培養(yǎng)基中，37。C搖床培養(yǎng)12h后，按2X的接種量分別接種到裝有50mL滅菌基本發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37IM90r/mim振蕩培養(yǎng)36h結(jié)朿發(fā)酵。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物分別取樣離心除去茼體，用3倍乙醇在沉淀l:清液，輕輕振蕩后12000r/min離心15min，收集沉淀物，冷凍干燥，再加入蒸熘水溶解沉淀物，透析去除離子，利用H:PLC檢測(cè)產(chǎn)物。將篩選到的候選菌株按農(nóng)業(yè)微生物鑒定的常規(guī)方法進(jìn)行,確定該菌株為地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheni-formis)，將旦:編號(hào)為WX-02，該菌株于2008年4月28日送交位f湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M208065。實(shí)施例2:聚-y-谷氨酸的HPLC分析方法聚-y-谷氨酸的定量分析由HPLC完成，色譜柱Agilont1100，流動(dòng)相為lOOmM叫()4加5.()%甲醇(用磷酸調(diào)pH:值至2.5)過(guò)濾，超聲波除氣，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，流速為1ml/min，谷氨酸作為定量的標(biāo)準(zhǔn)物。分子量的分析由美國(guó)Waters液相色譜儀，配備日本產(chǎn)TSKGelG6()(K)PWXL(7,8冊(cè)nX300mm)凝膠滲透色譜柱和Waters2487紫外檢測(cè)器。流動(dòng)相為25咖ol/LNa2S04:乙腈=8:1(v/v)，流速為0.5ml,Zmin，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm,提純的y-PGA作為定量的標(biāo)準(zhǔn)物。聚-Y-谷氨酸的,量測(cè)定歩驟如下取5毫升發(fā)酵離心I:清液，加3倍體積灑精沉淀PGA，溶解產(chǎn)物，加等體積濃鹽酸水解12小時(shí)，水解后把水解液加10MNaOH中和定容，經(jīng)0,22um膜過(guò)濾，測(cè)定谷氨酸的含量，再折算成聚-Y-tf氨K的產(chǎn)#。聚-Y-rf她分子量的測(cè)定步驟發(fā)酵液乏*稀f，后，PGA的水解液調(diào)ra屮偏酸性，稀釋一定倍數(shù)(濃度大約為1-5g/L)，經(jīng)0,22um膜過(guò)濾。實(shí)施例3:聚-Y-谷氨酸的液體分批發(fā)酵生產(chǎn)i、用冷凍保藏的菌種地衣芽胞桿菌WX-02為原始菌種2、斜面齒種將冷凍保藏的菌種地衣芽胞桿菌WX-02接種到LB固體斜面(成分蛋白胨10g/L、酵母浸出物5克/L、NaCl10g/L、瓊脂15克/L、滅茼前調(diào)培養(yǎng)基的pH為7.0)，30°C-37°C培/f24-36小時(shí)。3、種子液培養(yǎng)將LB固體斜面活化的種了轉(zhuǎn)接到含蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaCl丄0克/升、pH7.0的LB三角瓶液休種子培養(yǎng)基中，30°C-37°C，200rpm培養(yǎng)i4-i6小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；4、發(fā)酵罐培養(yǎng)按照每1升培養(yǎng)基的加入缺配置發(fā)酵培養(yǎng)基谷氨酸40-100克；葡萄糖50-100克;檸檬酸10-30克;氯化銨3-20克;K2IIP043II200,1-2克;MgS047II200,1-2克;FeCl3*6H:200,01-0,1克;CaCl2*2H:200,1-2克；補(bǔ)充蒸餾水至lO()Oml，pH:7,0-7,5，配置7L發(fā)酵液投入10L發(fā)酵罐，以0.07-0.1Mpa高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，冷卻至37。C按照2%的接種量接入種了液，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速400-8()()rpm,發(fā)酵溫度3()°C-37°C，通氣量1:(),5-2(v/v)，發(fā)酵至28-36小時(shí)結(jié)束發(fā)酵，檢測(cè)分析所得到的聚-y谷氨酸的濃度為38g/L。5、聚-y-谷氨酸發(fā)酵液后處理取上述發(fā)酵液7L,調(diào)節(jié)HI值3,0以下，在12000rpm轉(zhuǎn)速下，離心15分鐘，收集上淸液，超濾濃縮至2L，向濃縮發(fā)酵液巾加入6L95%的乙醇，沉淀聚-y-谷氨酸。在lOO()Orpm下離心收集沉淀，真空干燥得到252.7克干燥產(chǎn)品，在本實(shí)施例中，聚-y-谷氨酸的提取回收率為95%。實(shí)施例1挑取本申請(qǐng)人保藏的斜面地衣芽胞樸菌菌種WX-02(本發(fā)明中使用的y-PGA牛產(chǎn)菌株為本申請(qǐng)人的農(nóng)業(yè)微牛物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選的地衣芽胞桿菌(BacillusHchenif'OTmis)WX-()2，該菌株于2()()8年4月28日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編5為CCTCCN0:M208065)接入常規(guī)的LB培養(yǎng)基巾37。C活化10-1.2h后得到種子液，按3%(v/w)接種.S將該種子液接入裝有l(wèi)()Oml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三伯瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分(g/L)為谷氮酸鈉70，葡萄糖70，檸檬酸鈉8，氯化銨8，MnS04*H2()0,01，MgS047H:200,2，K2:HP()40,8，ZnS047H200,2，CaCl2*2:H2()0.2;滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7.0;在115t:高壓蒸汽下滅菌30min后使用。將所述的種子液在轉(zhuǎn)速為20()r/min，37。C的恒溫?fù)u床....匕發(fā)酵36h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為1200()r/m丄n的條件下離心20min去菌休，用2-4倍休積的95%的乙醇進(jìn)行沉淀，然后再將產(chǎn)物用常規(guī)的冷凍千燥方法，得到y(tǒng)-PGA粗產(chǎn)品。用上述制備的y-PGA配制成3%(w,Zw)的溶液，在pH=1，80"C條件下水解0,54小時(shí)，再用Na()H:調(diào)pH:至巾性，接著用去離子水透析去鹽，然后再將產(chǎn)物進(jìn)行冷凍千燥，得到不同分子量的y-PGA產(chǎn)品。用高壓液相凝膠排阻色譜測(cè)定所得樣品的分子量，結(jié)果如表1表1不同分子量y-PGA的制備<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例2取實(shí)施例1制備的各種分了量的Y-PGA樣品配成l()g/L的溶液，用2mol/L的feOH調(diào)節(jié)該溶液的pH至7，加入等休積的iOO咖olZL的CtiCl2，37。C下震蕩ih后，用去離子水進(jìn)行透析過(guò)夜，然后再將產(chǎn)物進(jìn)行冷凍千燥，即得到Y(jié)-聚谷氨酸Ca2+形式的螯合物。將PGA-Ca干物質(zhì)，再配成lOg/L溶液，用lOOmmolZL的EDTA滴定螯合鈣濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。[OO73]表2不同分子量PGA螯合鈣能力比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表2的樣品編號(hào)同表1。由以上數(shù)據(jù)可知，適當(dāng)水解后的Y-PGA對(duì)鈣離子的螯合能力更強(qiáng)，分子量位于400KDa之間的y-PGA可作為較理想的鈣離子螯合劑使用。實(shí)施例3應(yīng)用實(shí)施例(1)向鮮牛奶中加入實(shí)施例2中的'1#:PGA-Ca高速攪拌混合均勻后，在同一水平的鈣離子強(qiáng)化濃度下比較其與對(duì)照(用的CM^代杼PGA-Ca)在ii5°C，i5分鐘處理后的穩(wěn)定性效果。比較了五個(gè)鈣離子強(qiáng)化濃度下，兩者的熱穩(wěn)定性效果差異。結(jié)果如表3:表3添加Y-PGA螯合鈣和離子鈣對(duì)牛奶熱穩(wěn)定性影響的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注所用牛奶原始鈣含量為1%0由以上結(jié)果可以得出，添加PGA-Ca對(duì)牛奶的熱穩(wěn)定性破環(huán)比添加離子鈣要小，可使牛奶(原始鈣含量1%。)中的鈣離子強(qiáng)化后水平達(dá)到1.31.4^。實(shí)施例4將三種分子量范闈，實(shí)施例1.巾的2#、4#、6#PGA-Na以一系列濃度加入到鮮牛奶中，高速攪拌混合均勻后，用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)測(cè)定其粘度，結(jié)果如表4:表4添加Y-PGA對(duì)牛奶的增稠效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注粘度測(cè)定條件為室溫，1#轉(zhuǎn)子，6()r/min，定時(shí)l.min后讀數(shù)。由以上數(shù)據(jù)可以得出，300KDa以上的Y-PGA的對(duì)牛奶都有較強(qiáng)的增稠效果，而小分子量的(l()OKI)a以下)的Y-PGA在濃度不高時(shí)對(duì)牛奶的粘度影響不大。實(shí)施例5向牛奶中添加2%。(w/w)的Y-:PGA(實(shí)施例1中的3#和6#)和0,4%(w/w)的金屬離子(如Ca2—;—，F(xiàn)^—'—，Z^—'—)，添加之甜先做如下處理按添加量將Y-PGA和金屬氯化物配成混合液，調(diào)節(jié)pH至78,在37。CnR蕩l小時(shí)，再加入到鮮牛奶中，均勻混合，115T:/l()miTi滅菌，常溫存放-'周后做品嘗實(shí)驗(yàn)，以只添加0.2%。的金屬氯化物的牛奶做對(duì)照。實(shí)驗(yàn)對(duì)象為任意挑選的20人(男，女各10人)，采用雙肓實(shí)驗(yàn)法，受試者對(duì)牛奶中的辛辣味、收斂味及其他不良味道打分，感覺(jué)強(qiáng)烈的打4分，有明顯感覺(jué)的打3分，稍微有感覺(jué)的打2分，感覺(jué)不到的打1.分。20人打分的平均結(jié)果如表5。表5添加YPGA對(duì)牛奶中礦物強(qiáng)化后不tlU感的掩蓋效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果顯示，在金屬螯合能力相當(dāng)情況下(如實(shí)施例2所示)，分子一:ffi對(duì)大的3#y-PGA對(duì)不良口感的掩蓋能力較好。實(shí)施例6y-PGA在全脂奶粉的添加30040()KDa(實(shí)施例1屮的4-#)的Y—聚谷氨酸鈉(Y—聚谷氨酸，或Y-聚谷氨酸礦物螯合物)以乳中干物質(zhì)重量的2%。的量計(jì)，在奶粉加丁的配料過(guò)程中與預(yù)熱到60°C的牛乳高速攪拌混合，再經(jīng)過(guò)均質(zhì)(15MPa)，殺菌(85°C/7min)，真空濃縮(至原料乳體積的丄/4/「:右)，噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度i6(TC，干燥室溫度75°C，排風(fēng)溫度75°C)，冷卻，篩粉等工序，制得營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化全脂奶粉成品。同樣也可以將Y-聚谷氨酸鈉在噴霧千燥后在以細(xì)千粉形式混入奶粉中混勻。營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化奶粉成品，呈均勻-'致的乳黃色，組織狀態(tài)干燥均勻，在水中溶解迅速不結(jié)塊。實(shí)施例7用實(shí)施例6制得的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化奶進(jìn)行鐵吸收實(shí)驗(yàn)，方法如'卜'試驗(yàn)用3周齡Wistar大鼠30只，購(gòu)自湖北省疾病控制防疫中心。詞喂缺鐵的普通商購(gòu)詞料(要求該飼料中鐵含量設(shè)定為4ppm)28天，耗竭Wistar大鼠體內(nèi)鐵的貯存。止:式試驗(yàn)期間，對(duì)照組飼喂普通全脂奶粉(商購(gòu))與其普通商購(gòu)飼料(NJ上，其中總鐵含量設(shè)定為70ppm)，實(shí)驗(yàn)組用含0.2XY-聚谷氨酸鈉的全脂奶粉代普通全脂奶粉，總鐵含.S與對(duì)照相同。不銹鋼飼養(yǎng)籠個(gè)體飼養(yǎng)(避免人鼠和其排泄物接觸)，由釆食和飲用去離子水，其它按試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)操作規(guī)范進(jìn)行。四周后稱至(各組大鼠生長(zhǎng)良好，體承:無(wú)顯著差異)，宰殺測(cè)定血液指標(biāo)及組織器官屮的鐵含量，結(jié)果如表6和表7。表6奶粉中添加Y-PGA對(duì)大鼠血液指標(biāo)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注代表無(wú).M著性差異，a、b代表差異.顯著(P<0.05)，下M表7奶粉巾添加Y-PGA對(duì)大鼠組織器官鐵含S的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由以上數(shù)據(jù)可以得出，含Y-聚谷氨酸鈉的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化奶中鐵的吸收效果較普通奶粉好。實(shí)施例8Y-PGA鈣強(qiáng)化酸奶的制作，配料及工藝過(guò)程如下(見(jiàn)表8所示)表8Y,GA鈣強(qiáng)化酸奶的配料成分及用量<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>說(shuō)明活化的商品化發(fā)酵劑羅地亞MY105,購(gòu)自羅地亞無(wú)錫制藥有限公司1,把牛乳加熱到60。C，加入脫脂奶粉，攪拌均勻，水合2030min。2.將PGA-Ca和/':'!r糖均勻混和，在高速攪拌下緩慢加入到牛乳中。3.將牛乳均質(zhì)兩次，均質(zhì)壓力分別為2(MPa和5MPa;然后在90"C下滅菌l.Omin。4.迅速冷卻至4345。C，接種商品化發(fā)酵劑(羅地亞MY105),4245。C下發(fā)酵'lh，冷卻，冷藏后熟(27")。添加PGA-Ca可以強(qiáng)化酸奶中的鈣含量。同時(shí)發(fā)現(xiàn)冷藏過(guò)程中，對(duì)照組中乳酸菌總活齒數(shù)從第二天開(kāi)始下降，添加本發(fā)明制備的P(;A-Ca的樣品中齒數(shù)較穩(wěn)定，到第七天以后實(shí)驗(yàn)組的乳酸菌總活菌數(shù)明顯高T對(duì)照組，七天吋分別為9.1X108CFU/ml和6.6X108CFUZmL，到第十四天時(shí)分別為7.25X108CFU/ml和5.83X108CFU/ml。冷藏到9天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品均無(wú)乳清析出，滴定酸度差異不顯著，另外色澤、滋氣味等無(wú)差異，但前者口感更稠。實(shí)施例9y-:PGA在'|酪制作中的添加應(yīng)用。表9YPGA在干酪制作中的添加應(yīng)用設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>配料對(duì)照(g)實(shí)驗(yàn)組(g)凝乳嗨(科漢森公nj，嗨活力i:1—2000)0.0830.0831.將PGA-Na溶于少量水中(10%w/沐)，再與牛乳混合均勻，加熱到60°C,維持溫度，滅菌3()min。3.待牛乳冷卻到39°C，加入發(fā)酵劑，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?9°C發(fā)酵3040min，最后酸度控制在().18%().22%。4.將(^12配成10%的溶液加入到酸化的牛乳中，用IM的鹽酸調(diào)整牛乳酸度至0.21%，把凝乳酶用1%的食鹽水配成2%的溶液后加入到牛乳中，充分?jǐn)嚢?，?()°C下保溫30min，使乳凝固。5.用千酪刀將凝塊切割為0,71cm3的小立方體后，用千酪攪拌器輕輕攪拌，15min后攪拌速度稍加快，攪拌過(guò)程中控制好溫度,從開(kāi)始每3min升高11:，升溫至53°C，保溫45min。在攪拌升溫的后期，當(dāng)乳清的酸度在0,17%0,18%時(shí)，凝乳塊收縮至原來(lái)的一半大小，排出乳淸。6.將凝塊到入模具中壓榨成型，脫模后將千酪置于鹽水中腌漬,鹽水的濃度前兩天為17%18%，以后保持鹽水濃度為20%23%，溫度控制在81:,腌漬4天左右。將干酪瀝千，然后真空包裝，8°C放置成熟。添加有PGA-Na的干酪滋味和氣味正常，香味良好，質(zhì)地均勻，軟硬適中，組織極細(xì)tt,可塑性和彈性較對(duì)照強(qiáng),不易碎，有m常的紋理圖案，黃色有光澤，表皮均勻細(xì)致，沒(méi)有對(duì)照中的苦味，具體感官評(píng)分如表10。表10添加y-PGA對(duì)T酪感官指標(biāo)的影響項(xiàng)目滋味和組織狀紋理圖色澤外形包裝感官總氣味態(tài)案評(píng)分對(duì)照組38.420.66.743476.7實(shí)驗(yàn)組46.丄24.28.244.2490,7注以....匕為20人打分的平均結(jié)果，采用雙盲實(shí)驗(yàn)法,打分細(xì)則參考曾壽瀛主編《現(xiàn)代乳與乳制品加工技術(shù)》，Pi85i86:硬質(zhì)干酪感官指標(biāo)及評(píng)分。實(shí)施例l()y-PGA在巧克力奶中的添加應(yīng)用試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表11表11y-PGA在巧克力奶制作中的添加應(yīng)用設(shè)計(jì)配料對(duì)照(g)試驗(yàn)組(g)全脂奶粉(西安銀橋乳業(yè)集團(tuán))10010013<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>i.用5060°C的熱水溶解乳粉，攪拌均勻，水合2030min2.將蔗糖溶于水，煮沸152()min，冷卻至8()"C，緩慢加入PGA-Ca或卡拉膠，卨速攪拌(25003000r/min)混勻?？煽煞蹎为?dú)用熱水溶解，制成可可漿，在8595"C/2030min熱處理后，冷卻。3,將所有的原輔料混合，攪拌1525min，保證所有的物料混合均勻，加熱至60°C均質(zhì)，采用二級(jí)均質(zhì)工藝，壓力分別為2(MPa和5:M:pa。4.裝瓶后在115i:高壓蒸汽下滅菌1520min,冷卻至25i:，常溫儲(chǔ)存。存儲(chǔ)14大后，觀察鈣強(qiáng)化巧克力奶(實(shí)驗(yàn)組)和對(duì)照組中無(wú)脂肪上浮，無(wú)顆粒沉淀，無(wú)仟何不良的滋味和氣味，口感柔和。離心(3000r/min，i0min)測(cè)得實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的沉淀率分別為4.67%和4.58%，按實(shí)驗(yàn)實(shí)例4方法測(cè)得兩組的粘度分別為9.8mps和9.4mps.實(shí)施例llY-PGA在冰激凌制作中的添加應(yīng)用，參考一般冰激凌的成分要求乳脂肪8%14%,非脂肪乳固體8%1.2%，糖類13%16%，乳化穩(wěn)定劑0,3%0,5%，總固形物32%40%，計(jì)算得到的具體配料及工藝過(guò)程如表12的設(shè)計(jì)表12Y-:PGA在冰激凌制作中的添加應(yīng)用設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>1.將牛乳加熱至501:，維持溫度,在攪拌條件下依次加入蔗糖、PGA-Ca(或CMC,配10%w/V溶液加入)，單脂，稀奶油和甜煉乳，混料完畢后控制酸度在0,18%0,2%。2.將混合料加熱到65"C/「:右，均質(zhì)，壓力控制在20MPti。3.在8:rC保持3()s滅菌后，迅速冷卻至5°C，再將溫度控制在24H老化4h。4.冷卻到-2-5"C在凝凍攪拌器中凝凍，灌裝成型，放入-35。C的低溫冷柜中硬化后，于-25。C冷藏。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照相比冰晶形成更細(xì)微，且組織持久性更好，釆用蒸熘水定容法(SB/T10012-1992)測(cè)定得到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的膨脹率分別為69%和62%,另采川義獻(xiàn)(MRMuse,RWHartel.IcecreamstructuralelementsthataffectmeltingrateandHardness[J],DairySci，2()(M，87:1-10)提供的方法測(cè)的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組熔化率分別為丄.丄2%/min和i.67%/min，可見(jiàn)yPGA(聚-y-谷氨酸鹽類)對(duì)冰激凌的組織結(jié)構(gòu)改善效果較CMC(羧甲基纖維素鈉)更強(qiáng)。權(quán)利要求γ-聚谷氨酸或其鹽類作為增稠劑、穩(wěn)定劑、抗凍劑、礦物營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑或礦物吸收促進(jìn)劑在乳制品中的應(yīng)用，其特征在于，所述的γ-聚谷氨酸或其鹽類為H型γ-聚谷氨酸或Na型γ-聚谷氨酸鈉或與一種或多種如Ca2+，F(xiàn)e2+，Zn2+，Mg2+，F(xiàn)e3+，Cu2+礦物離子形成的聚氨基酸螯合鹽類或其混合物，所述的γ-聚谷氨酸或其鹽類的使用分子量為5～1000KDa，添加濃度為所述乳制品總重的0.001～5％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的乳制品包括殺菌乳、滅菌乳、含乳飲料、乳粉、發(fā)酵乳、T酪或冰激凌。3.根據(jù)權(quán)利要求i所述的應(yīng)用，其中所述Y-聚谷氨酸或其鹽類的添加方式為在乳制品配料時(shí)或加工過(guò)程中或加工完成后將所述的Y-聚谷氨酸或其鹽類以溶液或千粉形式與食品其他組分均勻混合。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于在殺菌乳，滅菌乳，含乳飲料中的應(yīng)用，其中作為礦物營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，或作為防止乳清析出和沉淀形成的穩(wěn)定劑和/或增稠劑。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于在乳粉屮的應(yīng)用，其屮作為礦物吸收促進(jìn)劑和/或礦物營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在f在酸乳中的應(yīng)用，其中作為延緩酸奶中乳酸菌的衰亡的抗凍劑。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于在冰激凌中的應(yīng)用，其中作為使冰激凌在凝凍和硬化中形成的冰晶更細(xì)微的抗凍劑。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于在千酪巾的應(yīng)用，其巾作為增強(qiáng)千酪可塑性、彈性并掩蓋其苦味的形成的穩(wěn)定劑。全文摘要本申請(qǐng)為γ-聚谷氨酸或其鹽類作為添加劑在乳制品中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種γ-聚谷氨酸(H型)或γ-聚谷氨酸鈉(Na型)或其與一種或多種礦物離子(如Ca2+，F(xiàn)e2+，Zn2+，Mg2+，F(xiàn)e3+，Cu2+)形成的聚氨基酸螯合鹽類，或其混合物作為增稠劑、穩(wěn)定劑、抗凍劑、礦物營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、礦物吸收促進(jìn)劑在乳制品(如殺菌乳、滅菌乳、發(fā)酵乳，含乳飲料、乳粉、干酪或冰激凌)中作為添加劑的應(yīng)用。文檔編號(hào)A23C9/152GK101692851SQ20091027242公開(kāi)日2010年4月14日申請(qǐng)日期2009年10月20日優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日發(fā)明者冀志霞,柯云,王楊波,陳守文,雍陽(yáng)春申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué);