專利名稱：用于測量細胞增殖的雙標記法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及用于雙脈沖標記核酸的方法。相關(guān)領(lǐng)域的描述通常通過向在其中培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中或飼喂動物的飲用水中加入核酸糖類似 物(核苷)，或通過將其注射入待標記的動物中來進行以測定生長速率為目的的脈沖標記 細胞DNA。對DNA類似物的定時暴露(其具有將該DNA類似物摻入活躍地合成的DNA的潛 能)被定義為脈沖。用于脈沖標記DNA的標準方法包括使用5-溴2'-脫氧尿苷(BrdU) 或放射性標記的核苷類似物。用于檢測BrdU標記的DNA或放射性標記的DNA的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。例 如，可用抗BrdU單克隆抗體，然后用熒光標記的二抗處理含有BrdU標記的DNA的細胞。然 后可通過標準技術(shù)，包括板測定、熒光顯微術(shù)、成像、高內(nèi)涵篩選或流式細胞術(shù)來顯現(xiàn)和定 量熒光標記。剖析復(fù)雜的細胞過程(包括細胞增殖)，需要跟蹤生物分子(當它們在它們的原住 地(native habitat)中行使功能時)的能力。近年來，用于標記生物分子的可選工具已從 化學(xué)生物領(lǐng)域顯現(xiàn)出來一生物正交化學(xué)報道分子(bioorthogonal chemical reporter) 已描述了生物正交反應(yīng)部分用于檢測代謝物和翻譯后修飾的用途(使用疊氮化物部分作 為生物正交化學(xué)報道分子)。在通過代謝或通過化學(xué)修飾導(dǎo)入靶生物分子后，可通過使用 下列3個高選擇性反應(yīng)之一而用探針標記疊氮化物Jtaudinger連接、Cu(I)催化的疊氮 化物-炔烴環(huán)加成作用或張力提高的(strain-promoted) [3+2]環(huán)加成作用。Agard等人J Am Chem Soc. 2004Nov 24 ； 126 (46) :15046_7。生物正交化學(xué)報道分子之前已用于通過摻入核苷似類物而標記核酸。因此，可使 用生物正交標記例如Maudinger連接、疊氮化物和炔烴的Cu(I)-催化的[3+2]環(huán)加成作 用(“點擊化學(xué)”)或“無銅”點擊化學(xué)(其獨立地由Barry Siarpless和Carolyn Bertozzi 描述)脈沖標記 DNA。Sharpless 等人 Angew Chem Int Ed Engl. 2002 Mar 15 ；41 (6) 1053-7 (通過引用完全合并入本文)；Meldal等人J. Org. Chem. 2002，67，3057 (通過引用完 全合并入本文)；Agard等人 J Am Chem Soc. 2004Nov 24 ； 126 (46) 15046-7 (通過引用完全 合并入本文)；美國專利7, 122，703 ；美國申請案2003000516671。點擊化學(xué)和Staudinger 連接適合于通過直接檢測核苷酸摻入來測量細胞增殖。參見Mlic等人，Methods and Compositions for Labeling Nucleic Acids，美國申請案 20070207476和 20070099222 (于 2006年10月27日提交)(通過引用完全合并入本文)。術(shù)語“點擊化學(xué)(click chemistry)”是指在銅(I)催化劑存在的情況下進行的 [3+2]環(huán)加成反應(yīng)。銅(I)催化劑可由銅(I)離子或銅(I)螯合部分組成。銅(I)螯合部分 可以是“其特征在于存在2個或更多個可參與銅(I)離子配合物(含有多于一個的配位鍵) 的形成的極性基團的任何實體”。Salic等人，美國專利申請案20070207476 (同上)。銅(I) 螯合劑在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，包括但不限于新亞銅試劑(neocuproine)和浴銅靈二磺酸鹽 (bathocuproine disulphonate)。Salic 等人，美國專利申請 20070207476 和 Sharpless 等人，美國申請案2003000516671。[3+2]環(huán)加反應(yīng)也稱為1，3偶極環(huán)加成，其可在1，3_偶極子與親偶極試劑 (dipolarophile)之間發(fā)生。1，3-偶極子與親偶極試劑的實例在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。例如， 1，3-偶極子可以是疊氮化物，親偶極試劑可以是炔烴。用于脈沖標記DNA的點擊化學(xué)技術(shù)包括用含有反應(yīng)性不飽和基團的第一核苷類 似物處理細胞以便將第一核苷類似物摻入新合成的DNA中。然后，將細胞與包含第二反應(yīng) 性不飽和基團的連接至標記物的試劑接觸，以便在第一與第二反應(yīng)性不飽和基團之間發(fā)生 [3+2]環(huán)加成作用。用于脈沖標記DNA的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)的下列描述僅作為例子提供并且無意限定 本發(fā)明的范圍。作為使用點擊化學(xué)脈沖標記DNA的一個實例，用有效量的炔烴修飾的核苷類似物 例如乙炔基-脫氧尿嘧啶(EdU)處理細胞，進行指定的時間，以便將EdU摻入新合成的DNA。 在用EdU進行脈沖標記后，固定細胞、透化細胞，然后在銅(I)催化劑存在的情況下，將細胞 與染料標記的疊氮化物反應(yīng)。通過[3+2]環(huán)加成反應(yīng)在染料與摻入的核苷類似物之間形成 共價鍵，然后染料標記可使用標準方法(包括但不限于流式細胞術(shù)、熒光顯微術(shù)、成像、多 孔板測定或高內(nèi)涵篩選)來測量。在使用點擊化學(xué)脈沖標記DNA的第二實例中，用有效量的疊氮化物修飾的核苷類 似物例如5-疊氮基-2 ‘-脫氧尿嘧啶(AzdU)處理細胞，進行指定的時間以便將AzdU摻入 新合成的DNA。在用^dU進行該脈沖標記后，固定細胞，透化細胞，然后在銅(I)催化劑存 在的情況下將細胞與染料標記的炔烴反應(yīng)。作為疊氮化物與炔烴部分之間的[3+2]環(huán)加成 反應(yīng)的結(jié)果，形成共價鍵。然后染料標記可使用標準方法(包括但不限于流式細胞術(shù)、熒光 顯微術(shù)、成像、多孔板測定或高內(nèi)涵篩選)來測量。點擊化學(xué)的一個備選方法(已由Bertozzi等人描述)是“無銅”點擊化學(xué)反 應(yīng)，其利用緊張的(strained) [3+2]環(huán)加成反應(yīng)而不使用銅⑴催化劑。Bertozzi等 人，Compositions and methods formodif ication of biomolecules,美國專利申請案 20060110782 (2005年10月31日提交)(通過引用全部合并入本文中)。例如，可首先用有效量的疊氮化物修飾的核苷類似物例如hdU處理細胞，進行指 定的時間，以便將疊氮化物修飾的核苷類似物摻入新合成的DNA。在該^dU的脈沖后，用有 效量的具有反應(yīng)性環(huán)炔部分的化合物或分子處理細胞以便在疊氮化物與環(huán)炔部分之間發(fā) 生緊張的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)?？尚揎棴h(huán)炔以進一步包含染料標記，所述染料標記則可使用 標準方法(包括但不限于流式細胞術(shù)、熒光顯微術(shù)、成像、多孔板測定或高內(nèi)涵篩選)來測 量。可用于緊張的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)以脈沖標記DNA的環(huán)炔包括但不限于環(huán)辛炔、二氟環(huán) 辛炔、雜環(huán)炔(heterocycloalkyne)、二氯環(huán)辛炔、二溴環(huán)辛炔或二碘環(huán)辛炔?？蓪⒈绢I(lǐng)域內(nèi)已知的其他化學(xué)試劑用于脈沖標記DNA。例如，可將Bertozzi等人 描述的疊氮化物-膦化學(xué)試劑(也稱SMaudinger連接)用于檢測疊氮化物修飾的核苷類 似物例如AzdU至新合成的DNA的摻入。參見Bertozzi等人，Chemoselective ligation, 美國專利申請20070037964(2006年9月19日提交)(通過引用完全合并入本文)。首先 將細胞與有效量的疊氮化物修飾的核苷類似物例如AzdU接觸，進行指定的時間。然后，將 細胞與經(jīng)工程改造的膦部分反應(yīng)。經(jīng)工程改造的膦部分的一個實例是2- 二苯基膦-苯甲酸甲酯。當將疊氮化物-膦化學(xué)試劑用于脈沖標記DNA時，經(jīng)工程改造的膦部分還包含染 料標記。在疊氮化物與膦部分之間的反應(yīng)發(fā)生后，可使用標準方法，包括但不限于流式細胞 術(shù)、熒光顯微術(shù)、成像、多孔板測定或高內(nèi)涵篩選來測量染料標記。在一些實驗中，期望用2種不同的核苷類似物脈沖標記DNA以便可建立基線增殖 速率。目前本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，包括上述方法，需要在加入第二脈沖標記物之前，從培養(yǎng) 基或生物體除去核苷類似物的第一脈沖標記。該清洗要求導(dǎo)入了影響DNA合成的定量的假 象。因此，在本領(lǐng)域中需要用于雙脈沖標記DNA而無中間清洗步驟的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了使用2種或更多種核苷類似物來脈沖標記核酸以測量細胞核酸合 成的基線和變化的方法。在一個實施方案中，提供了用于測量細胞核酸合成的變化的方法，其中所述方法 包括a)將樣品與有效量的第一核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第一溫育樣品 (primary incubated sample)；b)將第一溫育樣品與至少一種第二核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第二溫 育樣品(secondary incubated sample)；c)將第二溫育樣品與第一標記試劑和至少一種第二標記試劑一起溫育以形成標 記的樣品；d)檢測標記的樣品，其中測量第一和至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水 平，其中將至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平相對于第一核苷或核苷酸 類似物的摻入水平的差異測量為細胞核酸合成的變化，前提是第一核苷或核苷酸或至少一種第二核苷或核苷酸包含生物正交功能部分 (bioorthogonal functional moiety)0在其他實施方案中提供了用于測量細胞RNA合成的變化的方法，用于測量細胞 DNA合成的變化的方法和用于就對細胞增殖或基因表達的影響篩選化合物的方法。在某些方面，第一和/或第二核苷類似物包含生物正交功能部分，其中所述功能 部分可經(jīng)歷[3+2]環(huán)加成反應(yīng)或Maudinger連接。在一個情況下，生物正交功能部分包含 疊氮基、炔基或膦部分。在特定的方面，核苷類似物是乙炔基-脫氧尿嘧啶(EdU)或5-疊 氮基-2'-脫氧尿嘧啶(AzdU)。至少第一或第二核苷類似物包含生物正交功能部分。在另一個實施方案中，第一或第二核苷類似物包含鹵素部分，其可以是溴、氯或 碘。在一個方面核苷類似物是BrdU。還提供了第一和至少一種第二標記試劑，其中標記試劑共價或非共價地鍵合至摻 入的核苷類似物。在一個實施方案中，第一標記試劑和第二標記試劑是包含生物正交功能 部分的標記物或抗體。在一個方面，標記物是熒光染料。在另一個方面，抗體是抗BrdU抗 體。在某些方面，生物正交功能部分是疊氮化物，其中標記試劑是羅丹明-疊氮化物、 AlexaFlllOr 350-疊氮化物、41613| 111()1 488-疊氮化物、41613|711101@555-疊氮化物、Alexa FlUor 568-疊氮化物、Alexa ρ丨U()3r 568-疊氮化物、Alexa Fluor 594-疊 氮化物、Alexa Fluor 633-疊氮化物、Alexa Fluor 647-疊氮化物、Pacific Blue 疊 氮化物、Cascade BlUe 疊氮化物、熒光素-疊氮化物、花菁-疊氮化物(cyanine_azide) 和四甲基羅丹明(ΤΜΙ0-疊氮化物。在本發(fā)明的某些實施方案中，檢測第一核苷類似物和至少一種競爭性核苷類似物 的摻入還可包括使用流式細胞術(shù)、熒光顯微術(shù)、成像、高內(nèi)涵篩選或多孔板測定。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過用下列來測量細胞增殖用有效量的第一核苷 類似物處理細胞；用有效量的至少一種第二核苷類似物處理細胞；檢測第一核苷類似物的 摻入；以及檢測至少一種競爭性核苷類似物的摻入。在本發(fā)明的某些實施方案中，在用核苷類似物的第一脈沖標記處理細胞后，應(yīng)用 特殊的處理或測試過程。此類測試處理或測試化合物可引起期望的細胞增殖的改變，如在 通過向培養(yǎng)基系統(tǒng)中或向被測試的動物加入藥物來篩選癌癥治療藥物的情況下一樣。該處 理可與來自第二核苷類似物的脈沖(例如，BrdU的加入)同時或在此之前進行，而在處理 過程中無除去或清除(在動物的情況下)第一核苷類似物的間斷。在本發(fā)明的某些實施方案中，在選自但不限于下列的細胞上進行測量細胞增殖的 方法Jurkat細胞、M0LT4細胞、HeLa細胞、C0S7細胞、CHOKl細胞、A549細胞、3T3細胞、 佛波醇刺激的外周血淋巴細胞、U266, H929、L1210、K562、EL4、SK-BR3、HL60、MCF7、A431 和 BT-474。在另一個實施方案中，提供了用于測量細胞核酸合成的變化的試劑盒，其中試劑 盒包括第一核苷或核苷酸類似物；至少一種第二核苷或核苷酸類似物，其中至少第一類 似物或所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物包含生物正交功能部分；第一標記試劑；和 第二標記試劑。另外的試劑盒組分包括緩沖劑、檢測劑和使用試劑盒組分測量細胞核酸合 成的變化的說明書。附圖概述

圖1提供了顯示用EdUdO μ Μ)的第一脈沖標記和BrdUdO μ Μ)的第二脈沖標記 處理的細胞群體的圖，如利用流式細胞術(shù)檢測的。圖被分為4個象限，第一象限Oil)位于 左上角，第二象限0^2)位于右上角，第三象限0^3)位于左下角，以及第四象限0H)位于右 下角。象限Q3(左下)中的細胞群體對于EdU(第一脈沖)和BrdU(第二脈沖)都是陰性 的。象限Q2(右上)中的細胞群體對于EdU(第一脈沖)和BrdU(第二脈沖)都是陽性的。圖2提供了顯示用EdU(IOyM)的第一脈沖標記和BrdU(10 μ M)的第二脈沖標 記處理的細胞群體的一系列圖(如通過流式細胞術(shù)檢測的)。第一個圖(左)被分成四 個象限，第一象限Oil)位于左上角，第二象限位于右上角，第三象限位于左下 角，以及第四象限0H)位于右下角。象限Q3(左下)中的細胞群體對于EdU(第一脈沖) 和BrdU(第二脈沖)都是陰性的。象限Q2(右上)中的細胞群體對于EdU(第一脈沖)和 BrdU (第二脈沖)都是陽性的。中間的圖是EdU對DNA細胞周期的圖。使用的P4 > Pl的 門控證實一些EdU陽性細胞是BrdU陰性的。此類細胞是在BrdU-摻入(第二脈沖)之前 在只摻入EdU的最初30分鐘的脈沖(第一脈沖)過程中已通過細胞周期的合成期的細胞。圖3A提供了顯示用EdU(IOyM)的第一脈沖標記和BrdU (10 μ M)的第二脈沖標記處理的細胞群體的一系列圖(如通過流式細胞術(shù)檢測的)。第一個圖(左)被分成四 個象限，第一象限Oil)位于左上角，第二象限0^2)位于右上角，第三象限0^3)位于左下 角，以及第四象限OH)位于右下角。象限Q3(左下)中的細胞群體對于EdU(第一脈沖) 和BrdU(第二脈沖)都是陰性的。象限Q2(右上)中的細胞群體對于EdU(第一脈沖)和 BrdU (第二脈沖)都是陽性的。中間的圖是EdU對DNA細胞周期的圖，門控P5 > Pl。中間 的圖顯示BrdU陽性細胞的亞群(其是EdU陰性的)，該亞群是在30分鐘的只摻入EdU的第 一脈沖后進入細胞周期的DNA合成期的細胞群體。圖:3B提供了顯示用20 μ M濃度的EdU 和10 μ M濃度的BrdU的同時脈沖處理的細胞群體的圖(如通過流式細胞術(shù)檢測的)。該圖 被分成四個象限，第一象限Oil)位于左上角，第二象限位于右上角，第三象限0^3)位 于左下角，以及第四象限OH)位于右下角。象限Q3(左下)中的細胞群體對于EdU和BrdU 都是陰性的。象限Q2(右上)中的細胞群體對于EdU和BrdU都是陽性的。該圖顯示只檢 測到來自BrdU的陽性信號并且未檢測到來自EdU的信號，從而證明BrdU優(yōu)先于EdU被摻 入。圖4提供了顯示用EdU(IOyM)的第一脈沖標記和BrdU(10 μ M)的第二脈沖標 記處理的細胞群體的一系列圖(如通過流式細胞術(shù)檢測的)。第一個圖(左)被分成四 個象限，第一象限Oil)位于左上角，第二象限0^2)位于右上角，第三象限0^3)位于左下 角，以及第四象限OH)位于右下角。象限Q3(左下)中的細胞群體對于EdU(第一脈沖) 和BrdU(第二脈沖)都是陰性的。象限Q2(右上)中的細胞群體對于EdU(第一脈沖)和 BrdU(第二脈沖)都是陽性的。Q4象限是在第一脈沖中被EdU標記但在第二脈沖中未被 BrdU的標記的細胞，因為它們已進入G2/M并且不再合成DNA。Ql象限亞群是在第一脈沖 中未被EdU標記但在第二脈沖中正好進入DNA合成期并且被BrdU標記的細胞。中間的圖 是EdU對細胞周期的圖。在中間和左邊的圖中，進入或已通過細胞周期的DNA合成期的亞 群只顯示單個標記。圖5提供了一系列圖，其顯示當用EdU和BrdU同時處理細胞時，通過流式細胞術(shù) 只檢測到用BrdU標記的DNA群體。左邊的第一個圖顯示EdU對只用EdU的單脈沖標記處 理的DNA細胞周期的圖。第二個圖顯示BrdU對只用BrdU的單脈沖標記處理的DNA細胞周 期的圖。第三和第四個圖顯示熒光核苷酸標記對用EdU和BrdU同時處理的DNA細胞周期 的雙參數(shù)圖。只有BrdU被摻入用EdU和BrdU同時處理的細胞，如第三和第四個圖中所顯 示的。圖6提供了核苷類似物至DNA內(nèi)的摻入的描述。在圖的左側(cè)，EdU被摻入DNA雙 螺旋中。當將EdU摻入DNA時，類似物是可容易地接近的，從而可使用Alexa Fluor 疊氮 化物進行標記而無需變性步驟。圖的右側(cè)顯示，變性是摻入的BrdU的標準的基于抗體的標 記所必需的。圖7提供了標記為A至C的一系列結(jié)果圖，其顯示用EdU (20 μ Μ)的第一脈沖標記 和BrdU(IOyM)的第二脈沖標記處理的細胞群體(Ramos B淋巴細胞)(如通過流式細胞術(shù) 檢測的)。圖8提供了標記為A至C的一系列結(jié)果圖，其顯示用EdU (20 μ Μ)的第一脈沖標記 和BrdU(IOyM)的第二脈沖標記處理的細胞群體(來自慢性髓性白血病細胞的Κ562人成 淋巴細胞)(如通過流式細胞術(shù)檢測的)。
圖9-1至9-3提供了標記為A至I的一系列結(jié)果圖，其顯示細胞群體(TF_Ia人成 紅細胞)。圖A至G顯示用EdU (20 μ Μ)的第一脈沖標記和BrdU (10 μ Μ)的第二脈沖標記 (使用改變的脈沖時間)處理的細胞群體(如通過流式細胞術(shù)檢測的)。圖H和I顯示只 用一個脈沖處理的細胞群體，圖H顯示只有EdU (20 μ Μ)的脈沖標記的結(jié)果，圖I顯示只用 BrdUdO μ Μ)的脈沖標記的結(jié)果，如利用流式細胞術(shù)檢測的。圖10提供了標記為A至F的一系列結(jié)果圖，其顯示用EdUQOyM)的第一脈沖標 記和BrdU(IOyM)的第二脈沖標記處理的細胞群體(ΤΗΡ-1單核細胞)(如通過流式細胞術(shù) 檢測的)。圖11顯示在7個不同的處理條件下，為EdU和BrdU共陽性0)2)、EdU和BrdU共 陰性(Q3)、BrdU陽性且EdU陰性(Ql)以及BrdU陰性且EdU陽性(Q4)的細胞(Jurkat T 細胞淋巴細胞)的百分比。圖12-1和12-2提供了標記為A至J的一系列結(jié)果圖，其顯示用EdU(20μΜ)的第 一脈沖標記和BrdU(IOyM)的第二脈沖標記處理的細胞群體(Jurkat T-細胞淋巴細胞) (如通過流式細胞術(shù)檢測的)。發(fā)明詳述引言在本文中我們描述了通過摻入生物正交核苷或核苷酸類似物(以便可雙標記新 合成的細胞核酸而無需中斷性的清洗步驟)來測量細胞核酸合成的方法。此類類似物包 括但不限于鹵代的(例如BrdU)、疊氮基修飾的類似物，炔烴修飾的類似物或膦修飾的類似 物。然后通過測量熒光信號來檢測此類類似物的摻入，其中標記物因類似物和標記物的官 能團或通過抗體而選擇性地連接至核酸類似物。對核苷(或核苷酸)類似物的定時暴露 (其具有將該類似物摻入活躍合成的細胞核酸的潛能)被定義為脈沖。脈沖可以測量基線 增殖、基線基因表達或?qū)μ囟ㄌ幚淼捻憫?yīng)。我們已發(fā)現(xiàn)，加入另外的使用不同核苷類似物(其被選擇性標記)的脈沖，提供了 測量基線增殖和隨后的增殖變化而不會引入將類似物清洗或清除出被測量的細胞或系統(tǒng) 的假象的機制。還預(yù)期可進行第三脈沖，例如，但不限于測量藥物對細胞增殖或基因表達的 相互作用的能力?？赏ㄟ^核酸的第一脈沖標記記錄基線合成速率。無需除去第一脈沖的中 斷，可開始第二脈沖。通常，除去第一脈沖標記而導(dǎo)致的對細胞的中斷改變細胞增殖的速 率并且使得評估細胞增殖的變化變得困難。此外，無清洗步驟使得所述方法與高通量篩選 (HTS)相容。用于脈沖標記核酸而不使用放射性核苷的兩個相容的方法產(chǎn)生了非常強大的 工具，該工具在一個情況下可用于評估離體或體內(nèi)癌癥治療。部分地基于這樣的概念來預(yù)測新型雙標記方法，所述概念是在加入第二類似物 之前來自第一脈沖的類似物被完全摻入，或第二類似物是第一類似物的競爭者，以便第二 類似物被選擇性地摻入新生核酸聚合物。不希望受理論束縛，已顯示，在類似物EdU和BrdU 的情況下，在EdU的存在下，BrdU被選擇性地摻入。參見，實施例3。定義在詳細地描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于特定的組合物或方法步驟，因為 其可發(fā)生變化。應(yīng)當指出，如在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，除非上下文另外明確 地指出，否則單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)所指物。因此，例如，“a fluorescentpH sensitivedye”包括許多染料，“a cell”包括許多細胞等。除非另外定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 技術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。還應(yīng)理解，當描述連接至另一個化合物的化學(xué)部分 或分子時，為了綴合的目的，這些部分以基(radical)的形式存在。為了本文中描述的本發(fā) 明的目的，定義下列術(shù)語。如本文中所使用的，術(shù)語“炔烴反應(yīng)性”是指與核苷類似物上的炔烴修飾的基團選 擇性反應(yīng)以在炔烴修飾的基團與炔烴反應(yīng)性基團之間形成共價化學(xué)鍵的化學(xué)部分。炔烴反 應(yīng)性基團的實例包括疊氮化物?！叭矡N反應(yīng)性”還可指包含與炔烴基團選擇性反應(yīng)的化學(xué)部 分的分子。如本文中所使用的，術(shù)語“疊氮化物反應(yīng)性”是指與另一個分子上的疊氮基修飾的 基團選擇性反應(yīng)以在疊氮基修飾的基團與疊氮化物反應(yīng)性基團之間形成共價化學(xué)鍵的化 學(xué)部分。疊氮化物反應(yīng)性基團的實例包括炔烴和膦(例如三芳基膦)?！隘B氮化物反應(yīng)性” 還可指包含與疊氮基選擇性反應(yīng)的化學(xué)部分的分子。如本文中所使用的，術(shù)語“疊氮化物選擇性膦染料”是指化合物、分子或試劑，所 述化合物、分子或試劑包含具有染料標記的工程改造的膦部分以便當與疊氮化物反應(yīng)時， 在工程改造的膦部分與疊氮化物之間產(chǎn)生共價鍵。術(shù)語“工程改造的膦部分”是指包含 膦和親電子部分的部分。工程改造的膦部分的一個實例是2-二苯基膦基-苯甲酸甲酯 (2-diphenylphosphanyl-benzoic acid methyl ester)。其他工程改造的膦部分在本領(lǐng)域 內(nèi)是已知的。參見，例如，Bertozzi等人，美國專利申請案20070037964。如本文中所使用的，術(shù)語“生物正交化學(xué)報道分子”或“生物正交標記試劑”是指 包含化學(xué)柄(chemical handle)的可檢測標記物，所述化學(xué)柄在摻入核酸后與存在的核苷 類似物選擇性地反應(yīng)，從而形成共價鍵。如本文中所使用的，術(shù)語“細胞”在本發(fā)明的體內(nèi)應(yīng)用的背景中意欲包括任何屬或 種的真核和原核細胞，其中哺乳動物細胞尤為吸引人?！凹毎边€意欲包括正常細胞和患病 細胞，例如癌細胞。術(shù)語“細胞增殖”和“細胞的增殖”在本文中可互換地使用并且指通過單個細胞分 裂成子細胞而進行的細胞群體的擴增，或指單個細胞至子細胞的分裂。術(shù)語“化學(xué)柄”或“生物正交部分”，如本文中所使用的，是指特定的官能團，例如 疊氮化物、炔烴、活化的炔烴、亞磷酸鹽/酯、膦等?；瘜W(xué)柄與下面定義的生物學(xué)反應(yīng)性基團 的區(qū)別在于化學(xué)柄是這樣的部分，所述部分在天然發(fā)生的生物分子中是罕見的并且對于生 物分子(例如，天然細胞成分)是化學(xué)惰性的，但當與疊氮化物-或炔烴-反應(yīng)性基團反應(yīng) 時，反應(yīng)可在生物學(xué)相關(guān)條件(例如，細胞培養(yǎng)條件，例如在不存在過熱或嚴苛的反應(yīng)物的 情況下)有效地發(fā)生。如本文中所使用的，術(shù)語“點擊化學(xué)”是指摻入的核苷類似物(核苷酸類似物)或 標記試劑上的第一反應(yīng)性不飽和基團與存在于標記試劑或核苷類似物(核苷酸類似物) 上的第二反應(yīng)性不飽和基團之間的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)的銅催化形式。該點擊化學(xué)反應(yīng)由 Sharpless 等人(Sharpless 等人，Angew Chem, Int. Ed. Engl. ,2002,41 :1596-1599)描述。如本文中所使用的，術(shù)語“競爭性核苷類似物”是指當與第一核苷類似物同時加 入細胞或生物體中時，產(chǎn)生優(yōu)先用競爭性核苷類似物而非第一核苷類似物標記的細胞群體的核苷類似物。例如，當在雙脈沖實驗中將BrdU(競爭性核苷類似物)和EdU(第一核苷 類似物)同時加入細胞中時，只有BrdU(該對核苷類似物中的競爭性核苷類似物)被摻入 DNA(參見，例如，圖5和實驗例3)。如本文中所使用的，術(shù)語“銅(I)催化劑”是指催化摻入的核苷類似物(核苷酸類 似物)或標記試劑上的第一反應(yīng)性不飽和基團與存在于標記試劑或核苷類似物(核苷酸類 似物)上的第二反應(yīng)性不飽和基團之間的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)的化合物、分子或試劑。術(shù)語 “銅(I)催化劑”包括外源性銅(I)以及銅螯合部分。術(shù)語“銅螯合部分”是指特征在于存 在2個或更多個可參與銅(I)離子配合物的形成的極性基團的任何化合物、分子或試劑。如本文中所使用的，術(shù)語“無銅點擊化學(xué)”是指可在生理條件下進行的張力提高的 [3+2]環(huán)加成反應(yīng)，如由Bertozzi等人美國申請20060110782 ；Baskin等人PNAS 2007 Oct 23 ； 104 (43) :16793-7 ；Agard 等人 J Am Chem Soc. 2004 Nov 24 ； 126 (46) :15046-7 所描述 的。通過使用包含緊張的環(huán)炔部分的第一分子(通常為標記物)和包含疊氮化物部分的第 二分子(通常為核苷類似物)來完成反應(yīng)。第二分子上的疊氮化物部分在催化劑不存在的 情況下與第一分子上的緊張的環(huán)炔部分反應(yīng)，從而形成包含融合的疊氮化物/環(huán)炔環(huán)的終 綴合產(chǎn)物。如本文中所使用的，術(shù)語“可檢測的響應(yīng)”是指可通過觀察或通過儀器直接或間接 地檢測的信號的發(fā)生或其變化。通常，可檢測的響應(yīng)是導(dǎo)致波長分布模式的變化，或吸光度 或熒光的強度的變化，或光散射、熒光壽命、熒光偏振的變化，或上述參數(shù)的組合的光學(xué)響應(yīng)。如本文中所使用的，術(shù)語“染料”是指發(fā)射光以產(chǎn)生可觀察的可檢測信號的化合 物。如本文中所使用的，術(shù)語“染料標記的疊氮化物”和“疊氮化物-染料分子”是 指也用染料標記的具有反應(yīng)性疊氮化物基團的化合物或分子。實例包括但不限于羅 丹明-疊氮化物、Alexa Fluor 350-疊氮化物(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)，Alexa Fluor 488-疊氮化物(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)，Alexa Fluor 555-疊氮化物(Molecular Probes /Invitrogen , Carlskid，CA)、Alexa Fluor 568-疊氮化物(Molecular Probes /Invitrogn , Carlsbad, CA), Alexa Fluor 568-疊氮化物(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA) ,Alexa Fluor 594-疊氮化物，Alexa FlUOr 633-疊氮化物(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)、Alexa Fluor 647-疊氮化物(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)，Cascade Blue 疊氮化物(Molecular Probes / Invitrogen , Carlsbad, CA)、熒光素-疊氮化物、香豆素-疊氮化物、BODIPY-疊氮化物、花 菁-疊氮化物或四甲基羅丹明(ΤΜΙ0-疊氮化物。如本文中所使用的，術(shù)語“染料標記的環(huán)炔”是指已被進一步修飾從而包含染料標 記的環(huán)炔。術(shù)語“環(huán)炔”是指可用于緊張的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)以脈沖標記DNA的化合物或 分子。在本說明書中，環(huán)炔的實例包括但不限于環(huán)辛炔、二氟環(huán)辛炔、雜環(huán)炔、二氮環(huán)辛炔、 二溴環(huán)辛炔或二碘環(huán)辛炔。如本文中所使用的，術(shù)語“染料標記的炔烴”是指已被進一步修飾從而包含染料標記的炔烴。如本文中所使用的，術(shù)語“雙標記”是指其中用產(chǎn)生可區(qū)別的信號的兩種可檢測試 劑標記核酸聚合物的標記過程。由這樣的標記過程產(chǎn)生的核酸聚合物稱為雙標記的。如本文中所使用的，術(shù)語“有效量”是指在細胞、組織或生物體中引發(fā)相關(guān)響應(yīng)的 物質(zhì)、化合物、分子、試劑或組合物的量。例如，在細胞與核苷類似物接觸的情況下，有效量 是摻入細胞的DNA中的核苷的量。如本文中所使用的，術(shù)語“熒光團”或“產(chǎn)生熒光的(fluorogenic)”是指在結(jié)合 目的生物化合物或分析物后顯示熒光的變化的組合物。本發(fā)明的優(yōu)選熒光團包括在水性 介質(zhì)中具有高量子產(chǎn)量的熒光染料。示例性熒光團，特別地，包括咕噸(xanthene)、吲哚、 borapolyazaindacene、呋喃和苯并呋喃、花菁。本發(fā)明的熒光團可被取代以改變熒光團的 溶解度、光譜性質(zhì)或物理性質(zhì)。如本文中所使用的，術(shù)語“標記或標記物”是指當本發(fā)明的標記試劑的部分用于本 方法時保持其天然性質(zhì)(例如光譜性質(zhì)、構(gòu)象和活性)的化學(xué)部分或蛋白質(zhì)。示例性報道 分子可以是可直接檢測的(熒光團)或可間接檢測的(半抗原或酶)。此類報道分子包括 但不限于可使用輻射計數(shù)裝置測量的放射性報道分子；可目測觀察的或使用分光光度計測 量的色素、染料或其他色原(chromogen)；可使用自旋標記分析儀測量的自旋標記物；和熒 光部分，其中通過激發(fā)合適的分子加合物產(chǎn)生輸出信號，并且其可通過用可被染料吸收的 光激發(fā)來顯現(xiàn)或可以例如使用標準熒光計或成像系統(tǒng)來測量。報道分子可以是發(fā)光物質(zhì) 例如磷光體或熒光發(fā)生素(fluorogen)；生物發(fā)光物質(zhì)；化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，其中通過化學(xué)修飾 信號化合物來產(chǎn)生輸出信號；含有金屬的物質(zhì)；或酶，其中存在信號的酶依賴性二次產(chǎn)生， 例如從無色底物形成有色產(chǎn)物。報道分子還可以以化學(xué)或生物化學(xué)或惰性粒子的形式存 在，包括但不限于膠體金、微球體(microsphere)、量子點或無機晶體例如納米晶體或磷光 體(參見，例如，Beverloo，等人，Anal. Biochem. 203，326-34 (1992))。術(shù)語報道分子還可指 “標簽”或半抗原，所述標簽或半抗原可選擇性結(jié)合標記的分子以便標記的分子，當隨后加 入時，用于產(chǎn)生可檢測的信號。例如，可使用生物素、亞氨基生物素或脫硫生物素作為標簽， 然后使用辣根過氧化物酶(HRP)的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白綴合物來結(jié)合標簽， 然后使用生色底物(例如，四甲基聯(lián)苯胺)或產(chǎn)生熒光的底物例如Amplex Red或Amplex Gold (Molecular Probes, he.)來檢測HRP的存在。以相似的方式，標簽可以是半抗原或 抗原(例如，地高辛)，并且酶促標記的、熒光標記的或放射性標記的抗體可用于結(jié)合標簽。 大量的報道分子對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且包括但不限于顆粒、熒光染料、半 抗原、酶和它們的生色底物、產(chǎn)生熒光的底物和化學(xué)發(fā)光底物，以及Richard P. Haugland的 MOLECULAR PROBES HANDBOOK 0FFLU0RESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS，第 10版， 0005)(其內(nèi)容通過引用合并入本文)和其他公開來源中描述的其他報道分子。如本文中 所使用的，報道分子不是氨基酸。如本文中所使用的，術(shù)語“標記試劑”是指用于標記和檢測摻入的核苷酸類似物的 試劑。在一個情況下，標記試劑包含標記物和化學(xué)柄。在另一個情況下，標記試劑包含抗體 和標記物，其中抗體結(jié)合核苷類似物。如本文中所使用的，術(shù)語“核苷類似物”和“核苷酸類似物”可互換地使用，并且是 指在結(jié)構(gòu)上與摻入新合成的核酸中的天然核苷或核苷酸相似的分子或化合物。在核苷的情況下，當在細胞內(nèi)時，它們被磷酸化成核苷酸，然后被摻入新生核酸聚合物。核苷酸因它們 的電荷而難以穿過細胞膜并且比核苷更不穩(wěn)定，從而它們的使用通常需要用于轉(zhuǎn)染的額外 步驟和試劑，以將核苷酸轉(zhuǎn)運穿過脂雙層。以與天然核苷酸相似的方式將所述核苷類似物 摻入核酸(DNA或RNA)，其中矯正聚合酶(correctpolymerase)將類似物識別為天然核苷酸 并且在合成中不存在中斷。此類類似物包括最終用于檢測的許多不同部分，例如鹵代類似 物(溴、氯、碘等)和包含生物正交部分例如疊氮基、炔烴或膦的類似物。如本文中所使用的，術(shù)語“反應(yīng)性基團”是指能夠與另一個化學(xué)基團反應(yīng)從而形成 共價鍵，即在合適的反應(yīng)條件下是共價反應(yīng)性的基團，其通常代表另一種物質(zhì)的附著點。如 本文中所使用的，反應(yīng)性基團是指通常在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的、在正常生物學(xué)條件下反應(yīng)的 化學(xué)部分，此類反應(yīng)性基團在本文中不同于上文中定義的化學(xué)柄或生物正交功能部分例如 本發(fā)明的疊氮基和活化的炔烴部分。如本文中所提及的，反應(yīng)性基團是能夠與不同化合物 上的官能團起化學(xué)反應(yīng)以形成共價鍵的部分，例如羧酸或琥珀酰亞胺酯。反應(yīng)性基團通常 包括親核試劑、親電試劑和光激活基團。如本文中所使用的，術(shù)語“Maudinger連接”是指由Saxon和Bertozzi (E. Saxon和 C. Bertozzi, Science, 2000, 287 :2007-2010)開發(fā)的化學(xué)反應(yīng)，該反應(yīng)是經(jīng)典 Maudinger 反應(yīng)的改進。經(jīng)典Maudinger反應(yīng)是其中疊氮化物與膦或亞磷酸鹽/酯的組合產(chǎn)生氮 雜葉立德(aza-ylide)中間產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)，該中間產(chǎn)物在水解后產(chǎn)生膦氧化物和胺。 Staudinger反應(yīng)是將疊氮化物還原成胺的溫和方法；并且三苯基膦通常用作還原劑。在 Maudinger連接中，將親電阱(electrophilic trap)(通常甲酯)適當?shù)刂糜谌蓟?芳基上(通常為磷原子的鄰位)并且與疊氮化物反應(yīng)，從而產(chǎn)生氮雜-葉立德中間產(chǎn)物， 該中間產(chǎn)物在水性介質(zhì)中重排以產(chǎn)生具有酰胺基和膦氧化物功能的化合物。Maudinger 連接之所以如此命名是因為其將兩個起始分子連接在一起(附著/共價連接)，而在經(jīng)典 Staudinger反應(yīng)中，兩個產(chǎn)物在水解后未共價連接。如本文中所使用的，術(shù)語“受試化合物”和“受試處理”是指在請求保護的方法中 就其對細胞增殖或細胞周期的影響對其進行測試的任何物質(zhì)、化合物、分子、試劑、組合物 或處理。此類“受試化合物”和“受試處理”對細胞增殖的影響不受結(jié)果限制，即，它們可增 加、減少或不影響細胞增殖或細胞周期。如本文中所使用的，術(shù)語“反應(yīng)性伴侶(reactive partner) ”是指與另一個反應(yīng)性 伴侶例如本發(fā)明的核苷類似物和報道分子特異性反應(yīng)的分子或分子部分。雙標記試劑一般地，為了易于理解本發(fā)明，首先詳細地描述用于通過核苷或核苷酸類似物的 摻入而雙標記核酸的成分，然后描述雙標記方法。之后描述一些實施方案，其中將此類雙標 記的核酸用于測量細胞增殖。然后公開示例性方法。在進一步描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于描述的特定實施方案，因為其當 然可以變化。還應(yīng)理解，本文中使用的術(shù)語只是用于描述特定的實施方案而不意欲限定本 發(fā)明，因為本發(fā)明的范圍只受所附權(quán)利要求書的限定。我們在本文中描述了用于就對新生細胞核酸合成的作用篩選受試化合物的方法， 其中將兩種顏色標記用于測量與處理后的合成相比較的基線核酸合成。該方法使用被“飼 喂”給細胞并且摻入生長的核酸聚合物的核苷類似物，其中至少一個核苷類似物包含生物正交功能部分。在特定的實施方案中，提供了就對細胞增殖的作用而篩選受試化合物的方法。在 本文中，我們描述了用于雙標記的方法，其中測量基線增殖以比較體內(nèi)或離體處理細胞后 增殖的變化。這可通過使用鹵代類似物(例如BrdU)或含有化學(xué)柄的核苷類似物與含有化 學(xué)柄的核苷類似物(其可使用本發(fā)明的標記試劑來選擇性標記)的組合來完成。本發(fā)明使 用至少一種含有化學(xué)柄(在本文中也稱為生物正交功能部分)的核苷(或核苷酸)類似物。類似地，還可將該雙標記法用于測量響應(yīng)施用的處理的細胞基因表達(RNA合 成)。在該情況下，核酸類似物包含核糖，并且是RNA核苷或核苷酸類似物。該雙標記法的有利方面是，其在施用核苷類似物的第二脈沖之前不需要從培養(yǎng)基 或動物中除去核苷類似物的第一脈沖。對于第二標記的另外脈沖，該‘無清洗’處理的顯著 有利方面是，可使用第一脈沖核苷類似物，然后施用特定的處理或測試過程(其可引起細 胞增殖或基因表達的期望的改變)來進行基線細胞增殖或基因表達的測量。例如，在通過 向培養(yǎng)基系統(tǒng)或向測試的動物加入藥物而篩選癌癥治療藥物的情況下。該處理可以與來自 第二核苷類似物的脈沖同時進行或在其之前進行，而無用于除去第一類似物的處理過程的 中斷。在測試結(jié)束時，制備細胞以檢測標記核酸的兩個脈沖。在一個特定的方面，包含生物正交功能部分的核苷類似物用于第一脈沖，然后使 用鹵代核苷類似物進行第二脈沖。在另一個方面，包含第一生物正交功能部分的核苷類似 物用于第一脈沖，然后使用包含第二生物正交功能部分的核苷類似物進行第二脈沖。使用 本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法檢測此類摻入的類似物。對于鹵代核苷類似物，使用選擇性識別特定 鹵素部分的抗體，所述抗體包含標記物或通過包含標記物的二抗來檢測。使用包含互補 (complimentary)生物正交功能部分和標記物的試劑(其導(dǎo)致標記試劑與核苷類似物的共 價連接)檢測包含生物正交功能部分的核苷類似物。用于測量細胞增殖的該雙標記法與已知的方法顯著不同，因為1)在兩個脈沖之 間不需要清洗處理和2、利用兩種顏色、第一和第二標記物、熒光測量進行檢測的兩個脈沖 標記條件的相容性，其中一個核苷類似物包含生物正交功能部分。優(yōu)選，選擇第一和第二標 記物以使它們產(chǎn)生可區(qū)別的可檢測的信號，換句話說，可以以相同或不同的波長激發(fā)標記 物，但發(fā)射的波長不同。在一個特定方面，當使用兩種胸苷類似物時，在加入BrdU時，不必將第一脈沖核 苷5-乙炔基2'-脫氧尿苷(在本文中也稱為乙炔基尿嘧啶或EdU)從測試系統(tǒng)(細胞或 動物)中除去，因為當BrdU存在時，EdU顯示不摻入核酸。該重要特征和之前未公開的核 苷類似物的特征允許不間斷觀察基線細胞增殖測量和之后由施用特定處理而導(dǎo)致的細胞 增殖的改變的狀態(tài)。核苷和核苷酸類似物核苷和核苷酸類似物都可用于測量新生核酸合成的本方法。核苷通常用于其中向 細胞培養(yǎng)物中加入或給動物施用類似物的實驗，因為核苷類似物易于被活細胞吸收，其中 它們被磷酸化成核苷酸，然后摻入生長的核酸聚合物。相反地，核苷酸不穩(wěn)定并且在摻入細 胞之前或之后易于被酶切割，其通常比核苷更不穩(wěn)定。此外，由于來自磷酸基團的額外的電 荷，核苷酸不易被轉(zhuǎn)運入活細胞，并且通常需要轉(zhuǎn)染步驟來獲得充足的穿過細胞膜的核苷 酸的濃度。這對于其中應(yīng)當使細胞干擾保持至最低程度以正確地解釋結(jié)果的體內(nèi)或離體/體內(nèi)實驗是不理想的。因為這些原因，下列公開內(nèi)容通常提及核苷作為加入至細胞或動物 的類似物，然而這決不意欲是限定性的，其中核苷酸同樣重要。核苷類似物可以是4種DNA堿基(腺嘌呤㈧、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧 啶(T))中的任一種或4種RNA堿基(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或尿嘧啶(U)) 中的任一種的類似物，并且包括它們的三磷酸形式和亞磷酰胺形式，其中利用存在于細胞 中的聚合酶將此類類似物摻入新合成的核酸。將核苷修飾為類似物，其中它們包含最終用 于檢測該核苷和在核苷類似物存在的情況下合成所得的新生核酸聚合物的部分。在一個實施方案中，核苷類似物是鹵代類似物，包括但不限于溴、氯和碘部分。在 另一個實施方案中，核苷類似物包含化學(xué)柄或生物正交功能部分，包括但不限于疊氮基、炔 烴和膦部分。鹵代類似物在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，例如BrdU、IdU、CldU和BrUTP，并且可購 自許多提供商(Sigma, Saint Louis, MO ；Millipore, Billerica, MA ；Anaspec, SanJose, CA ；Invitrogen, Carlsbad, CA)。類似地用于檢測此類類似物的抗體也可商購獲得(Dako， Carpinteria, CA ；BD Bioscience, SanDiego, CA ；EMD Biosciences, Madison, WI)。包含適用于本文中描述的方法的生物正交功能部分的核苷類似物包括本文中定 義的任何核苷類似物，所述類似物包含可進行[3+2]環(huán)加成或Maudinger連接的反應(yīng)性生 物正交部分或化學(xué)柄。在一些實施方案中，反應(yīng)性生物正交部分可由核苷的堿基攜帶。攜 帶反應(yīng)性生物正交部分的堿基可以是嘌呤(例如，腺嘌呤或鳥嘌呤)或嘧啶(例如，胞嘧 啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶)。在某些實施方案中，堿基是尿嘧啶；在一些此類實施方案中，尿嘧 啶在5-位置上攜帶反應(yīng)性生物正交部分。在某些實施方案中，堿基是腺嘌呤；在一些此類 實施方案，腺嘌呤攜帶反應(yīng)性生物正交部分。在某些實施方案，生物正交部分間接地連接至 堿基，而在其他實施方案中，生物正交部分直接共價地連接至堿基。可用于本文中描述的 方法的核苷類似物的非限定性實例包括乙炔基尿嘧啶或EdU和5-疊氮基-2'-脫氧尿嘧 啶(在本文中也稱為疊氮基尿嘧啶或AzdU)以及它們的三磷酸形式和亞磷酰胺形式。可基 本上如C. -S. Yu和F. Oberdorfer, Synlett, 2000,1 :86-88中所述合成EdU ；并且可使用與 P. Sunthankar 等人，Anal. Biochem.，1998，258 :195-201 中描述的合成疊氮基 _dUMP 的方法 類似的方法合成 AzdU。EdU 還可從 Berry andAssociates, Inc. (Dexter, MI)商購獲得。在某些實施方案中，反應(yīng)性生物正交部分由核苷的糖(核糖和脫氧核糖)攜帶。在 某些實施方案中，將生物正交部分間接連接至糖，然而在其他實施方案中，將生物正交部分 直接且共價地連接至糖。在某些實施方案中，反應(yīng)性生物正交部分連接至核苷的磷酸部分。 攜帶反應(yīng)性生物正交部分的糖可共價連接至嘌呤(例如，腺嘌呤或鳥嘌呤)或嘧啶(例如， 胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶)。在某些實施方案中，堿基是尿嘧啶，然而在其他實施方案中， 堿基是腺嘌呤。可用于本文中描述的方法的核苷類似物的非限定性實例包括EdU、AzdU或 鏈終止雙脫氧化合物例如AZT ;3'-疊氮基-2'，3'-雙脫氧腺苷、3'-疊氮基-3'-脫 氧胸苷(AzT)、5'-疊氮基-5'-脫氧胸苷、5-(1-乙炔基)-2' -0-甲基尿苷、5-(1-丙炔 基)-2'-脫氧尿苷、5-(炔丙基氧基)-2'-脫氧尿苷、8-疊氮基-2'-脫氧腺苷、3'-疊 氮基-2'，3'-雙脫氧腺苷。反應(yīng)性生物正交部分或化學(xué)柄可以是1，3-偶極子例如腈氧化物、疊氮化物、重氮 甲烷、硝酮或腈亞胺(nitrile imine)。在某些實施方案中，1，3-偶極子是疊氮化物。備選 地，反應(yīng)性生物正交功能部分可以是親偶極物(dipolarophile)例如烯烴(例如，乙烯基、丙烯基等)或炔烴(例如，乙炔基、丙炔基等)。在某些實施方案中，親偶極物是炔烴例如乙 炔基。上述的這些生物正交功能部分是非天然、非擾亂性生物正交化學(xué)部分，其具有可 通過高選擇性反應(yīng)進行修飾的獨特的化學(xué)功能性。特別地使用標記試劑標記此類摻入的核 苷，所述標記試劑包含在細胞環(huán)鏡存在的情況下與核苷選擇性地形成共價鍵的化學(xué)柄。標記試劑試劑A在特定的實施方案中，標記試劑是一抗，其可被綴合至標記物或可被共價連接至 標記物的二抗結(jié)合，其中一抗結(jié)合摻入的核苷。在一個方面，其為抗BrdU抗體。在另一個 方面，抗體是抗IdU或抗CldU抗體。然而，還預(yù)期可選擇性結(jié)合摻入的核苷類似物的其他 抗體。試劑B在另一個實施方案中，標記試劑包含標記物和化學(xué)柄?；瘜W(xué)柄，如上文定義的，是 選擇性地與功能部分反應(yīng)以形成共價鍵的生物正交功能部分。標記或標記物如上文已提及的，標記物的作用是在標記后使得能夠顯現(xiàn)或檢測核酸聚合物，例 如，細胞中的DNA。優(yōu)選，選擇標記物(或可檢測的試劑或部分)以便其產(chǎn)生可測量的并且 其強度與標記的核酸聚合物(例如被分析的樣品中的標記的核酸聚合物)的量相關(guān)的(例 如，成比例的)信號。用于本文描述的方法和組合物中的標記試劑的標記物是在大于^Onm的波長 上展示最大吸收，并且當共價連接至修飾的核苷例如(僅以舉例的方式)，疊氮化物和炔 烴或膦時保持其光譜性質(zhì)的任何化學(xué)部分(有機的或無機的)。用于本文中描述的方法 和組合物中的標記試劑的熒光團包括但不限于芘(包括美國專利5，132,432中公開的 任何相應(yīng)的衍生化合物)、蒽、萘、吖啶、二苯乙烯、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻 唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑(NBD)、花菁(包括美國系列案 09/968，401和09/969，853中的任何相應(yīng)化合物)、羰花青(包括美國系列案09/557，275 ； 09/969，853 和 09/968，401 ；美國專利 4，981，977 ；5，268，486 ；5，569，587 ；5，569，766 ； 5，486，616 ；5，627，027 ；5，808，044 ；5，877，310 ；6，002，003 ；6，004，536 ；6，008，373 ； 6，043，025 ；6，127，134 ；6，130，094 ；6，133，445 ；和公開案 WO 02/26891，WO 97/40104，WO 99/51702, WO 01/21624 ；EP 1065250A1 中的任何相應(yīng)化合物)、喹諾酮(carbostyryl)、 卟啉、水楊酸、氨基苯甲酸鹽/酯、奧(azulene)、二萘嵌苯(perylene)、吡啶、喹啉、 borapolyazaindacene(包括美國專利 4，774，339 ；5，187，288 ；5，248，782 ；5，274，113 和 5，433，896中公開的任何相應(yīng)化合物)、咕噸(包括美國專利6，162,931 ；6, 130, 101 ； 6，229，055 ；6, 339，392 ；5, 451，343和美國系列案09/922，333中公開的任何相應(yīng)化合物)、 噁嗪(包括美國專利4，714，763中公開的任何相應(yīng)化合物)或苯并噁嗪、卡巴嗪(包括 美國專利4，810，636中公開的任何相應(yīng)化合物)、phenalenone、香豆素(包括美國專利 5，696，157 ；5, 459, 276 ；5, 501，980和5，830，912中公開的相應(yīng)化合物)、苯并呋喃(包括美 國專利4，603，209和4，849，362中公開的相應(yīng)化合物)和benzphenalenone (包括美國專 利4，812，409中公開的任何相應(yīng)化合物)和其衍生物。如本文中所使用的，噁嗪包括試鹵靈(resorufin)(包括5，242, 805中公開的任何相應(yīng)化合物)、氨基噁嗪酮、二氨基噁嗪和它 們的苯并取代類似物。用于本文中公開的方法和組合物中的標記試劑的咕噸型熒光團包括但不限于熒 光素、對甲氨基酚(包括美國專利5，227，487和5，442，045中公開的任何相應(yīng)化合物)或 羅丹明(包括美國專利5，798，276 ；5，846，737 ；美國系列案09/1 ，015中的任何相應(yīng)化 合物)。如本文中所使用的，熒光素包括苯并或二苯并熒光素、半萘并熒光素或萘并熒光 素。類似地，如本文中所使用的，對甲氨基酚包括seminaphthorhodafIuor(包括美國專利 4，945，171中公開的任何相應(yīng)化合物)。在某些實施方案中，熒光團是通過在咕噸的9-位 置上的單個共價鍵結(jié)合的咕噸。在其他實施方案中，咕噸包括在9-位置上連接的3H-咕 噸-6-醇-3-酮的衍生物、在9-位置上連接的6-氨基-3H-咕噸-3-酮的衍生物或在9-位 置上連接的6-氨基-3H-咕噸-3-亞胺的衍生物。在某些實施方案中，用于本文中描述的方法和組合物中的標記試劑的熒光 團包括咕噸(對甲氨基酚、羅丹明、熒光素和其衍生物)香豆素、花菁、芘、噁嗪和 borapolyazaindacene。在其他實施方案中，此類熒光團是磺化咕噸、氟化咕噸、磺化香豆 素、氟化香豆素和磺化花菁。還包括以商業(yè)名稱銷售并且通常稱為Alexa Fluor.DyLight, Cy Dyes、BODIPY, Oregon Green、Pacific Blue、IRDyes, FAM、FITC 和 ROX 的染料。用于標記試劑的連接的熒光團的選擇將決定修飾的核酸的吸收和熒光發(fā)射性質(zhì)。 可用于檢測修飾的核酸的熒光團標記物的物理性質(zhì)包括但不限于光譜特性(吸收、發(fā)射和 斯托克司頻移)、熒光強度、壽命、偏振和光漂白速率或其組合。所有這些物理性質(zhì)可用于 將一種熒光團與另一種熒光團相區(qū)別，從而允許多重分析。在某些實施方案，熒光團在大于 480nm的波長上具有最大吸收。在其他實施方案，熒光團在488nm至514nm處或其附近(特 別適合于通過氬離子激光器激發(fā)源的輸出來激發(fā))或M6nm附近(特別適合于通過水銀燈 來激發(fā))吸收。在其他實施方案中，熒光團可在NIR(近紅外區(qū))發(fā)射以用于組織或完整生 物體的應(yīng)用。熒光標記試劑的其他期望的性質(zhì)可包括細胞滲透性和低毒性，例如，如果將在 細胞或生物體(例如，活動物)中進行核酸聚合物的標記。在某些實施方案中，標記試劑包括串聯(lián)染料(tandem dye)或FRET染料對。這對 于獲得一組在相同波長下激發(fā)但具有不同發(fā)射光譜的標記試劑特別有用。兩種染料，當它 們十分靠近時(通常共價連接)，用作FRET對，這樣可使來自激發(fā)的第一染料(供體)的能 量轉(zhuǎn)移至第二染料(受體)，然后第二染料以更長的波長發(fā)射能量(與只激發(fā)第一染料而可 能產(chǎn)生的波長相比)。特別有用的組合是美國專利7169939 ；6849745 ；5945526 ；5863727 ； 5800996和6967250中公開的FRET染料對。在另一個實施方案中，標記試劑包含熒光納米晶體。對于各雙標記實驗，必須基于使用的儀器選擇匹配的標記試劑組以便可在正確的 波長上適當?shù)丶ぐl(fā)和測量染料以區(qū)別基線核酸合成與因處理而導(dǎo)致的隨后的核酸合成的 變化。匹配的熒光標記染料對通常產(chǎn)生在光譜上可區(qū)別的信號。例如，在一些實施方案， 匹配對中的熒光染料不會顯著地吸收相同光譜范圍內(nèi)的光(即，它們展示不同的最大吸收 波長)并且可使用兩個不同的波長來激發(fā)(例如，相繼地激發(fā))。備選地，匹配對中的熒 光染料可發(fā)射不同光譜范圍內(nèi)的光(即，它們在激發(fā)后產(chǎn)生雙色熒光)。成對的熒光標記 物在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的(參見，例如，R. P. Haugland， “ Molecular Probes =Handbook ofFluorescent Probesand Research Chemicals,同上)。特定的標記物組的選擇將取決于待進行的標記的目的并且將由幾個因素決定，例 如標記方法的容易程度和成本、期望的樣品標記的質(zhì)量、可檢測部分對細胞或生物的作用、 檢測系統(tǒng)的性質(zhì)、由可檢測部分產(chǎn)生的信號的性質(zhì)和強度等。在特定情況下，一個標記物被 選擇用于試劑A，第二標記物被選擇用于試劑B。方法將上述雙標記成分用于本方法以通過細胞核酸的雙脈沖標記測量細胞新生核酸 的合成。用核苷類似物進行的核酸的第一脈沖標記允許確定核酸合成的基線速率。然后用 另外的第二核苷類似物進行的核酸的脈沖標記允許測量核酸合成的任何變化。該方法在脈 沖標記之間不需要可能引入假象的中間清洗步驟?？蓪⒑怂岷铣蓽y量為細胞增殖(在DNA 的情況下)或基因表達(在RNA的情況下)。此外，該方法可用于就其對細胞增殖或基因表 達的作用篩選化合物(通過在用第二核苷類似物處理的同時或在此之前用受試化合物處 理細胞或生物體)。因此，在一個實施方案中，提供了用于測量細胞核酸合成的變化的方法，其中所述 方法包括a)將樣品與有效量的第一核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第一溫育樣品；b)將第一溫育樣品與至少一種第二核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第二溫 育樣品；c)將第二溫育樣品與第一標記試劑和至少一種第二標記試劑一起溫育以形成標 記的樣品；d)檢測標記的樣品，其中測量第一和至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水 平，其中將所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平相對于第一核苷或核 苷酸類似物的摻入水平的差異測量為細胞核酸合成的變化，前提是第一核苷或核苷酸或至少一種第二核苷或核苷酸包含生物正交功能部分。因此，在一個方面，提供了用于測量可被測量為細胞增殖的細胞DNA合成的變化 的方法。在另一個方面，提供了用于測量可被測量為基因表達的細胞RNA合成的變化的方 法。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，提供了就受試化合物對細胞增殖的作用篩選所 述化合物的方法。該方法可包括在用特定化合物治療疾病的過程中測量患者的細胞增殖變 化。可從患者取出癌細胞并且培養(yǎng)于培養(yǎng)物中。可用第一脈沖確定基線DNA合成速 率，然后加入藥物和第二核苷類似物，并測定DNA合成速率的變化，所述變化在癌細胞的藥 物抗性/敏感性的情況下可容易地測定。通過加上不改變細胞增殖狀態(tài)的準確的基線合成 測量，可極大地改進對在細胞周期的不同位置刺激或阻斷DNA合成的化合物的篩選。例如，可從患者中取出乳腺癌細胞并且培養(yǎng)于培養(yǎng)物中。可通過加入EdU的第一 脈沖來確定基線細胞增殖速率。然后，用化療藥物例如他莫昔芬處理細胞，用BrdU的第二 脈沖標記處理細胞。然后通過比較EdU與BrdU的摻入來測量響應(yīng)他莫西芬的細胞增殖速 率。可在乳腺癌患者的治療過程中重復(fù)該過程以確保患者的癌細胞保持對選擇的化療劑(在該情況下，他莫西芬)的響應(yīng)。在本實例中，臨床醫(yī)生期望在用化療藥物治療之后細胞 增殖減少。一旦乳腺癌患者的細胞中DNA的雙脈沖標記顯示，在用特定的藥物治療后細胞 增殖無變化，那么臨床醫(yī)生可重新評估患者是可受益于使用該藥物的持續(xù)治療還是應(yīng)當轉(zhuǎn) 向不同的化療劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，本方法可適合于就化合物在許多疾病中對細胞增殖 的作用來篩選化合物。例如但無意限定本發(fā)明的范圍，下列是其進展受改變至正常 細胞增殖水平影響的疾病乳腺癌、白血病、結(jié)腸癌、前列腺癌等(參見，例如，美國 專利6，646，008(于2000年2月22日提交))；神經(jīng)疾病，包括神經(jīng)退行性疾病例如 亨廷頓病(Huntington ‘ sdisease)(Curtis 等人’ Increased Cell Proliferation andNeurogenesis in the Adult Human Huntington ' s disease brain,100(15)PNAS 9023-9027(2003 年 7 月 22 日))或 HIV 相關(guān)癡呆(Okamoto 等人，HIV/gpl20 Decreases Adult Neural Progenitor CellProliferation via Checkpoint Kinase-Mediated Cell-Cycleffithdrawal and Gl Arrest,1 Cell Stem Cell 230-236(2007年8 月 16 日))； 和其他增生疾病包括銀屑病、皮脂溢、濕疹、良性前列腺增生、先天性腎上腺增生、子宮內(nèi)膜 增生、鱗狀細胞增生、皮脂腺增生、克羅恩氏病、癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和淋巴瘤(參見美國 專利7，256,034 (于2004年1月5日提交))。在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及用于鑒定新型化合物的方法，所述化合物可稱 為“受試化合物”，其對細胞增殖具有期望的作用。取決于應(yīng)用，該期望的作用可以是刺激、 抑制或不影響細胞增殖。在鑒定受試化合物對細胞增殖是否具有作用的篩選方法中，已提出可就潛在有用 的藥劑的存在測定從天然來源例如植物、動物或甚至來源例如海洋、森林或土壤樣品分離 的化合物。應(yīng)理解，待篩選的受試化合物還可來源于化學(xué)組合物或人造化合物。受試化合物 還可包括蛋白質(zhì)和肽，例如通過重組DNA技術(shù)或通過其他技術(shù)(包括肽合成)產(chǎn)生的蛋白 質(zhì)和肽。受試化合物還可以是抗體，包括多克隆和單克隆抗體。受試化合物還可包括天然發(fā) 生的化合物的片段或部分，或只有作為已知化合物的活性組合才可被發(fā)現(xiàn)(否則化合物失 活)。受試化合物還可包括核酸，包括但不限于DNA ；核糖核酸(RNA)；小干擾RNA(siRNA)； 和單鏈核酸，更特別地，經(jīng)設(shè)計形成體內(nèi)三鏈體的單鏈核酸。在某些實施方案中，本發(fā)明可用于在用已知影響細胞增殖的化合物處理后測量細 胞增殖。參見，例如，Nicholas R. Cozzarelli, TheMechanism of Action of Inhibitors of DNA Synthesis,46 ANN. REV. BI0CHEM. 641-648(1977)。在本發(fā)明的某些實施方案中，給生物體施用受試化合物?？蓪ζ涫┯盟埱蟊Ｗo 的方法的生物體包括但不限于人、小鼠、大鼠、馬、牛、綿羊、兔、狗或貓?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法給生物體施用受試化合物和核苷類似物。 此類施用包括口服施用(例如，含有受試化合物和/或核苷類似物的丸劑、食物或液體的攝 入)或通過皮下、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用(例如，通過注射或局部給藥)。還可胃腸外、脊柱內(nèi) 或腦內(nèi)施用受試化合物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了測量細胞中而非生物體中的細胞增殖的方法。 可向在其中培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中加入核苷類似物。類似地，如果方法包括就受試化合物 對細胞增殖的作用而篩選受試化合物，那么可向在其中培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中加入受試化合物。受試化合物對細胞增殖的作用的上述論述也預(yù)期涉及它們對基因表達的作用，其 中測量RNA合成的變化。在本發(fā)明的特定實施方案中，通過用有效量的EdU處理細胞，然后用有效量的 BrdU處理細胞來測量細胞中的細胞增殖。使用點擊化學(xué)試劑包括硫酸銅(CuSO4)和染料標 記的疊氮化物(例如 Alexa Fluor 488-疊氮化物(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA))來檢測EdU脈沖標記。使用標準的基于抗體的方法檢測BrdU脈沖標記。參 見，例如，Jonathon Pines 等人，Assays for CDK Activity and DNAReplication in the Cell Cycle, CURRENT PROTOCOLS IN CELL BIOLOGY (Juan S. Bonifacino 等人 eds.，John ffiley&Sons, Inc. 2003) (1998)。然后使用流式細胞術(shù)測量兩種標記物。在本發(fā)明的某些實施方案中，可將該雙脈沖標記法用于評估離體或體內(nèi)癌癥療 法?？蓮幕颊呷〕霭┘毎⑴囵B(yǎng)于培養(yǎng)物中?？墒褂玫谝幻}沖確定基線DNA合成速率，然 后加入藥物和第二核苷類似物，并測定DNA合成速率的變化。不改變細胞增殖狀態(tài)的準確 基線合成測量將極大地改進篩選刺激或阻斷DNA合成的化合物的方法。在本發(fā)明的某些實施方案中，對神經(jīng)細胞進行測量細胞增殖的方法?？蓪⒃撾p脈 沖標記法用于評估對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。例如，可通過下列測量在用受試化合物處理后 神經(jīng)細胞的細胞增殖速率的改變將神經(jīng)細胞與核苷類似物的第一脈沖接觸；用受試化合 物進行處理；在使用受試化合物進行處理的同時或在此之后將神經(jīng)細胞與競爭性核苷類似 物接觸；檢測第一核苷類似物的摻入和檢測競爭性核苷類似物的摻入。因此，該雙脈沖標記 法可用于鑒定刺激或抑制神經(jīng)細胞增殖的化合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用這樣的方法就化合物對細胞增殖的作用篩選所 述化合物，所述方法包括步驟用第一核苷類似物處理細胞；用受試化合物處理細胞；在使 用受試化合物處理細胞的同時或在此之后用至少一種競爭性核苷類似物處理細胞；檢測第 一核苷類似物的摻入；和檢測第二核苷類似物的摻入。在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過下列步驟測量生物體中的細胞增殖用第一 核苷類似物處理生物體；用至少一種第二核苷類似物處理生物體；檢測第一核苷類似物的 摻入；和檢測第二核苷類似物的摻入。在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過下列步驟測量生物體中的細胞增殖用第一 核苷類似物處理生物體；用受試化合物處理生物體；在用受試化合物處理細胞的同時或在 此之后用至少一種競爭性核苷類似物處理生物體；檢測第一核苷類似物的摻入；和檢測第 二核苷類似物的摻入。照射(Illumination)本發(fā)明的化合物可以在測定后或測定期間的任何時間用產(chǎn)生可檢測的光學(xué)響應(yīng) 的波長的光來照射，并且利用檢測光學(xué)響應(yīng)的方法來觀察。在照射后，例如利用紫色或可見 波長發(fā)射燈、弧光燈、激光器或甚至陽光或普通室內(nèi)燈照射后，熒光化合物展示強烈的可見 吸收以及熒光發(fā)射。選擇的用于照射本發(fā)明的熒光化合物的設(shè)備包括但不限于手提式紫外 燈、水銀燈、氙氣燈、氬激光器、激光二極管和YAG激光器。任選地將這些照射源整合入激光 掃描器、流式細胞儀、熒光微板讀取器、標準或小型熒光計或色譜檢測器。該熒光發(fā)射任選 地通過目視觀察或通過使用任何下列裝置來檢測CCD照相機、攝像機、照相膠片、激光掃描裝置、熒光計、光電二極管、量子計數(shù)器、落射熒光顯微鏡、掃描顯微鏡、流式細胞儀、熒光 微板讀取器，或通過用于擴增信號的方法(例如光電倍增管)來檢測。在使用流式細胞儀、 熒光顯微鏡或熒光計檢查樣品的情況下，任選地將儀器用于通過可檢測的不同的光學(xué)性質(zhì) (通常通過區(qū)別本發(fā)明的第一熒光化合物的熒光響應(yīng)與第二熒光團的熒光響應(yīng))來區(qū)別和 區(qū)分本發(fā)明的第一脈沖標記試劑和第二標記試劑。在使用流式細胞儀檢查樣品的情況下， 樣品的檢查任選地包括使用分選裝置基于熒光響應(yīng)來分離樣品中的顆粒。本發(fā)明的試劑盒在另一個方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的至少一種核苷類似物和標記試劑的試 劑盒。試劑盒通常還包括在一個或多個方法(所述方法通常用于測量細胞核酸合成的變 化)中使用核苷類似物和標記試劑的說明書。在示例性實施方案中，試劑盒包括第一核苷或核苷酸類似物，至少一種第二核苷 或核苷酸類似物，其中至少第一類似物或至少一種第二核苷或核苷酸類似物包含生物正交 功能部分，第一標記試劑和第二標記試劑。另外的試劑盒成分包括緩沖劑、其他檢測試劑和 標準品。上文已提供了本發(fā)明的詳細描述，下列實施例是為了舉例說明本發(fā)明而提供的并 且不應(yīng)當解釋為是對本發(fā)明或權(quán)利要求的范圍的限制。
實施例下列實施例描述了本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案。然而，應(yīng)當理解，這些實施例僅用 于舉例說明目的并且無意限定本發(fā)明的范圍。實施例1按照已知的細胞活躍生長所需的條件，通過提供恰當?shù)呐囵B(yǎng)基和營養(yǎng)需求來建立 制備培養(yǎng)細胞(用于測量新合成的DNA(細胞增殖))的標準方法。在本實施例中，將Jurkat 細胞培養(yǎng)物以1 4稀釋至hlO5個細胞/ml的密度。在將這些細胞培養(yǎng)2或3天后，以 20 μ M (適合于摻入正在經(jīng)歷DNA合成的細胞的DNA中的濃度)加入第一核苷類似物EdU。在 EdU存在的情況下培養(yǎng)細胞，進行30分鐘。在30分鐘的生長后并且在不除去EdU (通過在 新鮮培養(yǎng)基中清洗細胞)的情況下，以10 μ M濃度加入適當量的競爭性核苷類似物BrdU，然 后將細胞培養(yǎng)30分鐘。然后收獲、清洗細胞，用70%冰冷的ETOH固定細胞，并于4°C下貯存 96小時。然后清洗細胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進行20分鐘。加入磷酸鹽/檸 檬酸緩沖液，將細胞清洗2次，然后以ixio7mi重懸浮于ο. ι%Τι· i ton x-ioo/i % BSA/ PBS中。然后，通過加入基于點擊化學(xué)的試劑進行EdU的標記，所述試劑包括含有在Tris-緩 沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa Fluor 488-疊氮化物G95nm最大激發(fā)/519nm最大發(fā)射) (Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)的溶液。然后用 0. 1 % Triton X-100/1% BSA/PBS清洗細胞。之后，使用抗BrdU抗體Alexa F lUOr 647綴合物(650nm 最大激發(fā)/670nm 最大發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)進行 BrdU 的標記。為了檢測DNA含量，加入核酸染料SYT0X Blue stain (444nm最大激發(fā)/480nm 最大發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)和 RNA 酶(Invitrogen , Carlsbad, CA)。利用流式細胞術(shù)進行3種標記的檢測。為了檢測EdU標記，使用488nm的激發(fā)，530/30nm的帶通。為了檢測BrdU標記，使用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了 檢測DNA含量，使用405nm的激發(fā)，450/50nm的帶通。實施例2按照已知的細胞活躍生長所需的條件，通過提供恰當?shù)呐囵B(yǎng)基和營養(yǎng)需求來建立 制備培養(yǎng)細胞(用于測量新合成的DNA(細胞增殖))的標準方法。在本實施例中，將Jurkat 細胞培養(yǎng)物以1 4稀釋至hlO5個細胞/ml的密度。在將這些細胞培養(yǎng)2或3天后，以 20μΜ(適合于摻入正在經(jīng)歷DNA合成的細胞的DNA中的濃度)加入第一核苷類似物EdU。 在EdU存在的情況下培養(yǎng)細胞1小時。在1小時的生長后并且在不除去EdU(通過在新鮮 培養(yǎng)基中清洗細胞)的情況下，以10 μ M濃度加入適當量的競爭性核苷類似物BrdU，然后將 細胞培養(yǎng)30分鐘。然后收獲、清洗細胞，用70%冰冷的ETOH固定細胞，并于4°C下貯存96 小時。然后清洗細胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進行20分鐘。加入磷酸鹽/檸檬 酸緩沖液，將細胞清洗2次，然后以1x107ml重懸浮于0. 1 %Tr 1 ton X-100/1 % BSA/PBS 中。然后，通過加入基于點擊化學(xué)的試劑進行EdU的標記，所述試劑包括含有在Tris-緩 沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa Fluor 488-疊氮化物G95nm最大激發(fā)/519nm最大發(fā)射) (Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)的溶液。然后用 0. 1 % Triton X-100/1 % BSA/PBS清洗細胞。之后，使用抗BrdU抗體Alexa FlUOr 647綴合物(650nm 最大激發(fā)/670nm 最大發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)進行 BrdU 的標記。為了檢測DNA含量，加入核酸染料SYT0X Blue stain (444nm最大激發(fā)/480nm 最大發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)和 RNA 酶(Invitrogen , Carlsbad, CA)。利用流式細胞術(shù)進行3種標記的檢測。為了檢測EdU標記，使用488nm的 激發(fā)，530/30nm的帶通。為了檢測BrdU標記，使用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了 檢測DNA含量，使用405nm的激發(fā)，450/50nm的帶通。實施例1-2的結(jié)果由于在加入核苷類似物的兩個脈沖之間沒有進行可能導(dǎo)致新合成的DNA的速率 的變化的處理，因此兩種類似物的摻入應(yīng)當是相當?shù)?。在圖中，可看到幾個細胞亞群。存在 不包含任一標記的細胞(圖1，Q3象限)。此類細胞在測試期間未活躍地復(fù)制它們的DNA。還存在EdU和BrdU標記都摻入DNA中的細胞(圖1，Q2象限)。此類細胞在兩個 脈沖和處理的整個測試過程中具有持續(xù)的DNA合成。還存在只具有來自第一脈沖的標記物(EdU)的細胞群體(圖2和4)。此類細 胞在利用EdU進行標記的過程中處于合成晚期。這可在總DNA對EdU標記的圖上的定位 (mapping)中看到。到加入BrdU的脈沖時，此類細胞已停止復(fù)制它們的DNA。還存在只具有來自第二脈沖的標記物的細胞群體(圖3和4)。此類細胞在第一脈 沖期間未活躍地復(fù)制它們的DNA，但在第二脈沖期間進入DNA合成期。根據(jù)通過流式細胞術(shù) 收集的細胞群體的圖的模式，可容易地觀察和定量引起合成速率增加或減少的處理。實施例3在第三實驗中，EdU和BrdU核苷類似物的同時加入只產(chǎn)生其DNA被BrdU標記的 細胞群體(圖5)。該第三實驗證實，在加入第二標記物之前無需清洗除去第一標記物。然 后收獲、清洗細胞，用70%的冰冷ETOH固定細胞，并于4°C下貯存96小時。然后清洗細胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進行20分鐘。加入磷酸鹽/檸檬酸緩沖液，將細胞清 洗2次，然后以1x107ml重懸浮于ο. 1 %Tr i ton x-ιοο/ι % bsa/pbs中。然后，通過加 入基于點擊化學(xué)的試劑進行EdU的標記，所述試劑包括含有在TriS-緩沖鹽溶液中的CuSO4 和 Alexa Fluor 488 綴合物 G95nm 最大激發(fā) /519nm 最大發(fā)射)(Molecular probeS 丨 Invitrogen , Carlsbad, CA)的溶液。然后用 0. 1 %Tr i ton X"100/l % BSA/PBS 清洗細 胞。之后，使用抗BrdU抗體Alexa Fluor 647綴合物(650nm最大激發(fā)/670nm最大發(fā)射) (Molecular Probes /Invitrogen ,Carlsbad,CA)進行BrdU的標記。為了檢測DNA含量，加 入核酸染料SYT0X Bluestain (444nm 最大激發(fā) /480nm 最大發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)和 RNA 酶 anvitrogen ，Carlsbad, CA)。利用流式細胞術(shù)進 行3種標記的檢測。為了檢測EdU標記，使用488nm的激發(fā)，530/30nm的帶通。為了檢測 BrdU標記，使用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了檢測DNA含量，使用405nm的激發(fā)， 450/50nm的帶通。該結(jié)果證明，在兩種核苷類似物存在的情況下，只有BrdU類似物被摻入 DNA，從而確認了在加入競爭性核苷類似物之前無需清洗步驟的方法的功效。BrdU類似物顯 示與EdU競爭(當兩者在核酸合成期間都存在時)。實施例4:按照已知的細胞活躍生長所需的條件，通過提供恰當?shù)呐囵B(yǎng)基和營養(yǎng)需求來建立 制備培養(yǎng)細胞(用于測量新合成的DNA(細胞增殖))的標準方法。在本實施例中，將Jurkat 細胞培養(yǎng)物以1 4稀釋至hlO5個細胞/ml的密度。在將這些細胞培養(yǎng)2或3天后，以 20 μ M (適合于摻入正在經(jīng)歷DNA合成的細胞的DNA中的濃度)加入第一核苷類似物EdU。在 EdU存在的情況下培養(yǎng)細胞1小時。在1小時的生長后并且在不除去EdU(通過在新鮮培養(yǎng) 基中清洗細胞)的情況下，以10 μ M濃度加入適當量的競爭性核苷類似物BrdU，然后將細胞 培養(yǎng)1小時。然后收獲、清洗細胞，用70%的冰冷ETOH固定細胞，并于4°C下貯存96小時。 然后清洗細胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進行20分鐘。加入磷酸鹽/檸檬酸緩沖 液，將細胞清洗2次，然后以1x107ml重懸浮于0. 1 % TritonX/1 % BSA/PBS中。使用抗BrdU 抗體 Alexa F1U0I· 647 綴合物(650nm 最大激發(fā)/670nm 最大發(fā)射)(Molecular Probes / Invitrogen , Carlsbad, CA)進行 BrdU 的標記。然后用 0. 1% TritonX/1 % BSA/PBS 清洗 細胞。之后，通過加入基于點擊化學(xué)的試劑進行EdU的標記，所述試劑包括含有在Tris-緩 沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa FlllOr 488-疊氮化物G95nm最大激發(fā)/519nm最大 發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)的溶液。為了檢測 DNA 含量，加 入核酸染料SYT0X Blue stain (444nm 最大激發(fā) /480nm 最大發(fā)射)(Molecularfrobes / Invitrogen , Carlsbad, CA)和 RNA 酶 anvitrogen ，Carlsbad, CA)。利用流式細胞術(shù)進 行3種標記的檢測。為了檢測EdU標記，使用488nm的激發(fā)，530/30nm的帶通。為了檢測 BrdU標記，使用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了檢測DNA含量，使用405nm的激發(fā)， 450/50nm的帶通。實施例5按照已知的細胞活躍生長所需的條件，通過提供恰當?shù)呐囵B(yǎng)基和營養(yǎng)需求來建立 制備培養(yǎng)細胞(用于測量新合成的RNA(基因表達))的標準方法。在本實施例中，將HeLa 細胞培養(yǎng)物在6孔板內(nèi)的蓋玻片上以1 4稀釋至hlO5個細胞的密度。在將這些細胞培養(yǎng)2天后，以適合于摻入活躍地轉(zhuǎn)錄信使的細胞的RNA中的濃度加入第一核苷類似物EU。 在EU存在的情況下培養(yǎng)細胞1小時。在1小時的生長后并且在不除去EU(通過在新鮮培 養(yǎng)基中清洗細胞)的情況下，以10 μ M濃度加入適當量的競爭性核苷類似物BrU，然后將細 胞培養(yǎng)30分鐘。然后收獲、清洗細胞，用3.7%甲醛/PBS在4°C下固定細胞30分鐘。然后
用3%BSA/PBS清洗細胞，在1.0%T]rit()n X-100/PBS中進行透化，并通過首先用IMHCl
在4°C下進行10分鐘，然后用2M HCl在室溫下進行30分鐘來進行變性。然后使用硼酸 鹽緩沖液中和細胞。然后，通過加入基于點擊化學(xué)的試劑進行EU的標記，所述試劑包括含 有在Tris-緩沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa FlUOr 488綴合物G95nm最大激發(fā)/519nm 最大發(fā)射)(Molecular pr0bes Invitrogen ，Carlsbad, CA)的溶液。然后用 1.0% Triton x-ioo/3% bsa/pbs清洗和封閉細胞。之后，使用抗Brdu抗體和第二檢測抗體 Alexa Fluor 647 綴合物(650nm 最大激發(fā) /670nm 最大發(fā)射)(Molecular Probes 丨 Invitrogen , Carlsbad, CA)進行BrU的標記。為了檢測EdU標記，使用470/50nm的激發(fā)， 545/75nm的帶通。為了檢測BrdU標記，使用630/50nm的激發(fā)，695/55nm的帶通。使用標 準技術(shù)和適當?shù)臑V光片通過熒光顯微術(shù)進行2種標記的檢測。實施例6按照已知的細胞活躍生長所需的條件，通過提供恰當?shù)呐囵B(yǎng)基和營養(yǎng)需求來建立 制備培養(yǎng)細胞(用于測量新合成的RNA(基因表達))的標準方法。在本實施例中，將HeLa 細胞培養(yǎng)物在6孔板內(nèi)的蓋玻片上以1 4稀釋至hlO5個細胞的密度。在將這些細胞 培養(yǎng)2天后，以適合于摻入活躍地轉(zhuǎn)錄信使的細胞的RNA中的濃度加入第一核苷類似物 EU。在EU存在的情況下培養(yǎng)細胞1小時。在1小時的生長后并且在不除去EU(通過在新 鮮培養(yǎng)基中清洗細胞)的情況下，以10 μ M濃度加入適當量的α-鵝膏蕈堿(lOOyg/mL) 和適當量的競爭性核苷類似物BrU，然后將細胞培養(yǎng)15分鐘。讓細胞生長另外5至30分 鐘的時間。然后收獲、清洗細胞，用3.7%甲醛/PBS在4°C下固定細胞30分鐘。然后用 3% BSA/PBS清洗細胞，在1.0%Ti:itC)Il X-100/PBS中進行透化，并通過首先用IM HCl 在4°C下進行10分鐘，然后用2M HCl在室溫下進行30分鐘來進行變性。然后使用硼酸 鹽緩沖液中和細胞。然后，通過加入基于點擊化學(xué)的試劑進行EU的標記，所述試劑包括含 有在Tris-緩沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa Fluor 488綴合物G95nm最大激發(fā)/519nm
最大發(fā)射)(Molecular ^ , ^ /Invitrogen , Carlsbad, CA)的溶液。然后用 1. 0%
Probes
Triton x-100/3% bsa/pbs清洗和封閉細胞。之后，使用抗Brdu抗體和第二檢測抗體 Alexa Fluor 647 綴合物(650nm 最大激發(fā) /670nm 最大發(fā)射)(Molecular probeS / Invitrogen , Carlsbad, CA)進行BrU的標記。使用標準技術(shù)和適當?shù)臑V光片通過熒光顯 微術(shù)進行2種標記的檢測。為了檢測EdU標記，使用470/50nm的激發(fā)，545/75nm的帶通。 為了檢測BrdU標記，使用630/50nm的激發(fā)，695/55nm的帶通。實施例7按照已知的細胞活躍生長所需的條件，通過提供恰當?shù)呐囵B(yǎng)基和營養(yǎng)需求來建立 制備培養(yǎng)細胞(用于測量新合成的RNA(基因表達))的標準方法。在本實施例中，將HeLa細胞培養(yǎng)物以1 4稀釋至hlO5個細胞/ml的密度。在將這些細胞培養(yǎng)2或3天(達到 70%匯合)后，用第一核苷類似物EUTP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Iipofect)它們，以將化合物以適合于 摻入活躍地轉(zhuǎn)錄信使的細胞的RNA中的濃度遞送至細胞核。在EUTP存在的情況下培養(yǎng)細 胞15分鐘。在15分鐘的培養(yǎng)后并且在不除去EUTP的情況下，用以適當?shù)臐舛燃尤氲母?爭性核苷類似物BrUTP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞，然后讓細胞再生長另外15分鐘。然后在收獲前 讓細胞生長不同的時間。然后收獲、清洗細胞，用3. 7%甲醛/PBS在4°C下固定細胞30分 鐘。然后用3% BSA/PBS清洗細胞，在ι. o%Triton x-ioo/PBS中進行透化，并通過首先 用IM HCl在4°C下進行10分鐘，然后用2M HCl在室溫下進行30分鐘來進行變性。然后 使用硼酸鹽緩沖液中和細胞。然后，通過加入基于點擊化學(xué)的試劑進行EU的標記，所述試 劑包括含有在Tris-緩沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa Fluoj 488綴合物G95nm最大激 發(fā)/519nm 最大發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen^SCarlskid，CA)的溶液。然后用 1. 0%Tr i toil X-100/3% BSA/PBS清洗和封閉細胞。之后，使用抗BrdU抗體和第二檢測 抗體 AlexaFluor 647 綴合物(650nm最大激發(fā) /670nm最大發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)進行BrU的標記。使用標準技術(shù)和適當?shù)臑V光片通過熒光顯 微術(shù)進行2種標記的檢測。為了檢測EdU標記，使用470/50nm的激發(fā)，545/75nm的帶通。 為了檢測BrdU標記，使用630/50nm的激發(fā)，695/55nm的帶通。實施例8按照已知的細胞活躍生長所需的條件，通過提供恰當?shù)呐囵B(yǎng)基和營養(yǎng)需求來建立 制備培養(yǎng)細胞(用于測量新合成的DNA)的標準方法。在本實施例中，將HeLa細胞培養(yǎng)物 在6孔板內(nèi)的蓋玻片上以1 4稀釋至hlO5個細胞的密度。在將這些細胞培養(yǎng)2天后，以 10 μ M(適合于摻入正在經(jīng)歷DNA合成的細胞的DNA中的濃度)加入第一核苷類似物EdU。 在EdU存在的情況下培養(yǎng)細胞1小時。在1小時的生長后并且在不除去EdU(通過在新鮮 培養(yǎng)基中清洗細胞)的情況下，以IOmM加入適當量的用于標記新合成的DNA的第二核苷 類似物^dU，和加入改變細胞增殖速率的藥物，并且培養(yǎng)細胞另外30分鐘。在第二次溫育 后，以10 μ M濃度加入第三競爭性類似物BrdU，和加入改變細胞增殖速率的第二處理，并且 培養(yǎng)細胞另外30分鐘。然后收獲、清洗細胞，用3. 7%甲醛/PBS在4°C下固定細胞30分 鐘。然后用3% bsa/pbs清洗細胞，在i.o%Ti:iton x-ioo/PBS中進行透化，并通過首 先用IM HCl在4°C下進行10分鐘，然后用2M HCl在室溫下進行20分鐘來進行變性。然 后使用硼酸鹽緩沖液中和細胞。然后，通過下列來進行AzU的標記用3%的在PBS中的 BSA清洗細胞2次，并加入基于無銅點擊化學(xué)的試劑，所述試劑包括含有在Tris-緩沖鹽溶 液中的Alexa FlUQir(g) 488-限制性環(huán)炔G95nm最大激發(fā)/519nm最大發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)的溶液。在該反應(yīng)后，通過加入基于點擊化學(xué)的試 劑進行EdU的標記，所述試劑包括含有在Tris-緩沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa Fluor 594 綴合物(590nm 最大激發(fā) /615nm 最大發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)的溶液。然后用1. 0%Tr i ton X-100/3% BSA/PBS清洗和封閉細胞。之 后，使用抗BrdU抗體和第二檢測抗體Alexa Fluor 647綴合物(650nm最大激發(fā)/670nm 最大發(fā)射)(Molecular probeS /Invitrogen ，Carlsbad, CA)進行 BrdU 的標記。使用標準技術(shù)通過熒光顯微術(shù)進行3種標記的檢測。為了檢測^dU標記，使用470/50nm的激 發(fā)，545/75nm的帶通。為了檢測EdU標記，使用560/55nm的激發(fā)，645/75nm的帶通。為了 檢測BrdU標記，使用630/50nm的激發(fā)，695/55nm的通帶。實施例9按照已知的細胞活躍生長所需的條件，通過提供恰當?shù)呐囵B(yǎng)基和營養(yǎng)需求來建立 制備培養(yǎng)細胞(用于測量新合成的DNA(細胞增殖))的標準方法。在本實施例中，將Ramos 人B-淋巴細胞培養(yǎng)物以1 4稀釋至hlO5個細胞/ml的密度。在將這些細胞培養(yǎng)1或2 天后，以20 μ M(適合于摻入正在經(jīng)歷DNA合成的細胞的DNA中的濃度)加入第一核苷類似 物EdU。在EdU存在的情況下將細胞培養(yǎng)2小時。在2小時的培養(yǎng)后并且在不除去EdU (通 過在新鮮培養(yǎng)基中清洗細胞)的情況下，以10 μ M的濃度加入適當量的競爭性核苷類似物 BrdU，然后培養(yǎng)細胞2. 5小時。然后收獲、清洗細胞，用70%的冰冷ETOH固定細胞，并于4°C 下貯存96小時。然后清洗細胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進行20分鐘。加入磷 酸鹽/檸檬酸緩沖液，將細胞清洗2次，然后以1x107ml重懸浮于0. 1 % TritonX/1 % BSA/ PBS中。然后，通過加入基于點擊化學(xué)的試劑進行EdU的標記，所述試劑包括含有在Tris-緩 沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa Fluoj 647-疊氮化物(650nm最大激發(fā)/670nm最大發(fā)射) (Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)的溶液。然后用 0· 1 % TritonX/1 % BSA/ PBS清洗細胞。之后，使用抗BrdU抗體FITC綴合物G94nm最大激發(fā)/518nm最大發(fā)射) (Exalpha Biologicals, Inc. ,MaynardCalifornia)進行 BrdU 的標記。為 了檢測 DNA 含量， 加入核酸染料DAPI (358nm最大激發(fā)/461nm最大發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad,CA)0利用流式細胞術(shù)進行3種標記的檢測。為了檢測BrdU標記，使用488nm的 激發(fā)，530/30nm的帶通。為了檢測EdU標記，使用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了檢 測DNA含量，使用355nm的激發(fā)，450/50nm的帶通。圖7提供了標記為A至C的一系列結(jié)果圖，其顯示用EdU (20 μ Μ)的第一脈沖標記 和BrdU(IOyM)的第二脈沖標記處理的細胞群體，如通過流式細胞術(shù)檢測的。圖A被分成 4個象限，第一象限Oil)位于左上角，第二象限0^2)位于右上角，第三象限0^3)位于左下 角，和第四象限0H)位于右下角。象限Q3(左下，淡藍色)中的細胞群體對于EdU(第一脈 沖)和BrdU(第二脈沖)都是陰性的。象限Q2(右上，深藍色)中的細胞群體對于EdU(第 一脈沖)和BrdU(第二脈沖)都是陽性的。象限Ql(左上，淡綠色)中的細胞群體對于BrdU 是陽性的并且對于EdU是陰性的，BrdU陽性細胞的亞群(其為EdU陰性的)，該亞群是在只 使用EdU的摻入之后進入S期的細胞群體。Q4(右下，紅色)中的細胞群體對于EdU是陽性 的并且對于BrdU是陰性的，EdU陽性細胞的亞群(晚S期)(其為BrdU陰性的)，該亞群是 在BrdU-摻入前離開S期的細胞群體。圖B是BrdU對DNA含量的圖，其顯示來自圖A的相 同顏色的群體。圖C是EdU對DNA含量的圖，其顯示來自圖A的相同顏色的群體。實施例10按照已知的細胞活躍生長所需的條件，通過提供恰當?shù)呐囵B(yǎng)基和營養(yǎng)需求來建立 制備培養(yǎng)細胞(用于測量新合成的DNA(細胞增殖))的標準方法。在本實施例中，將來自 慢性髓性白血病細胞培養(yǎng)物的K562人成淋巴細胞以1 4稀釋至hlO5個細胞/ml的密 度。在將這些細胞培養(yǎng)1或2天后，以20 μ M(適合于摻入正在經(jīng)歷DNA合成的細胞的DNA 中的濃度)加入第一核苷類似物EdU。在EdU存在的情況下將細胞培養(yǎng)2小時。在2小時的培養(yǎng)后并且在不除去EdU (通過在新鮮培養(yǎng)基中清洗細胞)的情況下，以10 μ M的濃度加 入適當量的競爭性核苷類似物BrdU，然后培養(yǎng)細胞2. 5小時。然后收獲、清洗細胞，用70% 的冰冷ETOH固定細胞，并于4°C下貯存96小時。然后清洗細胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進行20分鐘。加入磷酸鹽/檸檬酸緩沖液，將細胞清洗2次，然后以1x107ml重 懸浮于0. TritonX/1% BSA/PBS中。然后，通過加入基于點擊化學(xué)的試劑進行EdU的 標記，所述試劑包括含有在Tris-緩沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa f71U()]r 647-疊氮化物 (650nm 最大激發(fā) /670nm 最大發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)的 溶液。然后用0. l^TritonX/l^BSA/PBS清洗細胞。之后，使用抗BrdU抗體FITC綴合物 (494nm 最大激發(fā)/518nm 最大發(fā)身寸)(Exalpha Biologicals, Inc. , Maynard California) 進行BrdU的標記。為了檢測DNA含量，加入核酸染料DAPI(358nm最大激發(fā)/461nm最大發(fā) 射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)。利用流式細胞術(shù)進行 3 種標記的 檢測。為了檢測BrdU標記，使用488nm的激發(fā)，530/30nm的帶通。為了檢測EdU標記，使 用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了檢測DNA含量，使用355nm的激發(fā)，450/50nm的帶
ο圖8提供了標記為A至C的一系列結(jié)果圖，其顯示用EdU (20 μ Μ)的第一脈沖標記 和BrdU(IOyM)的第二脈沖標記處理的細胞群體，如通過流式細胞術(shù)檢測的。圖A被分成 4個象限，第一象限Oil)位于左上角，第二象限0^2)位于右上角，第三象限0^3)位于左下 角，和第四象限0H)位于右下角。象限Q3(左下，淡藍色)中的細胞群體對于EdU(第一脈 沖)和BrdU(第二脈沖)都是陰性的。象限Q2(右上，深藍色)中的細胞群體對于EdU(第 一脈沖)和BrdU(第二脈沖)都是陽性的。象限Ql(左上，淡綠色)中的細胞群體對于BrdU 是陽性的并且對于EdU是陰性的，BrdU陽性細胞的亞群(其為EdU陰性的)，該亞群是在只 使用EdU的摻入之后進入S期的細胞群體。Q4(右下，紅色)中的細胞群體對于EdU是陽性 的并且對于BrdU是陰性的，EdU陽性細胞的亞群(晚S期)(其為BrdU陰性的)，該亞群是 在BrdU-摻入前離開S期的細胞群體。圖B是BrdU對DNA含量的圖，其顯示來自圖A的相 同顏色的群體。圖C是EdU對DNA含量的圖，其顯示來自圖A的相同顏色的群體。實施例11按照已知的細胞活躍生長所需的條件，通過提供恰當?shù)呐囵B(yǎng)基和營養(yǎng)需求來建立 制備培養(yǎng)細胞(用于測量新合成的DNA(細胞增殖))的標準方法。在本實施例中，將TF-Ia 人成紅細胞培養(yǎng)物以1 4稀釋至hlO5個細胞/ml的密度。培養(yǎng)基含有GM-CSF或粒細胞 巨噬細胞集落刺激因子以用于生長。在將這些細胞培養(yǎng)1或2天后，以20 μ M(適合于摻入 正在經(jīng)歷DNA合成的細胞的DNA中的濃度)加入第一核苷類似物EdU。在EdU存在的情況 下培養(yǎng)細胞，進行表1中所列的時間。在初始培養(yǎng)之后并且在不除去EdU(通過在新鮮培養(yǎng) 基中清洗細胞)的情況下，以10 μ M的濃度加入適當量的競爭性核苷類似物BrdU，然后培養(yǎng) 細胞，進行表1中所列的時間。然后收獲、清洗細胞，用70%的冰冷ETOH固定細胞，并于4°C 下貯存直至使用。然后清洗細胞，將其在室溫下重懸浮于4M HCL中，進行20分鐘。加入磷 酸鹽/檸檬酸緩沖液，將細胞清洗2次，然后以1x107ml重懸浮于0. 1 % TritonX/1 % BSA/ PBS中。然后，通過加入基于點擊化學(xué)的試劑進行EdU的標記，所述試劑包括含有在Tris-緩 沖鹽溶液中的CuSO4和Alexa piuor 647-疊氮化物(650nm最大激發(fā)/670nm最大發(fā)射) (Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad, CA)的溶液。然后用 0· 1 % TritonX/1 % BSA/PBS清洗細胞。之后，使用抗BrdU抗體FITC綴合物G94nm最大激發(fā)/518nm最大發(fā)射) (ExalphaBiologicals, Inc. ,Maynard California)進行 BrdU 的標記。為 了檢測 DNA 含量， 加入核酸染料DAPI (358nm最大激發(fā)/461nm最大發(fā)射)(Molecular Probes /Invitrogen , Carlsbad,CA)0利用流式細胞術(shù)進行3種標記的檢測。為了檢測BrdU標記，使用488nm的 激發(fā)，530/30nm的帶通。為了檢測EdU標記，使用633nm的激發(fā)，660/20nm的帶通。為了檢 測DNA含量，使用355nm的激發(fā)，450/50nm的帶通。
表 權(quán)利要求
1.用于測量細胞核酸合成的變化的方法a)將樣品與有效量的第一核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第一溫育樣品；b)將第一溫育樣品與至少一種第二核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第二溫育樣Pm ；C)將第二溫育樣品與第一標記試劑和至少一種第二標記試劑一起溫育以形成標記的 樣品；d)檢測標記的樣品，其中測量所述第一和至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平，其中將所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平相對于所述第一核苷或核 苷酸類似物的摻入水平的差異測量為細胞核酸合成的變化，前提是所述第一核苷或核苷酸或所述至少一種第二核苷或核苷酸包含生物正交功能 部分。
2.用于測量細胞DNA合成的變化的方法a)將樣品與有效量的第一核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第一溫育樣品；b)將第一溫育樣品與至少一種第二核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第二溫育樣Pm ；C)將第二溫育樣品與第一標記試劑和至少一種第二標記試劑一起溫育以形成標記的 樣品；d)檢測標記的樣品，其中測量第一和至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平， 其中將所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平相對于所述第一核苷或核 苷酸類似物的摻入水平的差異測量為細胞DNA合成的變化，前提是所述第一核苷或核苷酸或所述至少一種第二核苷或核苷酸包含生物正交功能 部分。
3.用于測量細胞RNA合成的變化的方法a)將樣品與有效量的第一核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第一溫育樣品；b)將第一溫育樣品與至少一種第二核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第二溫育樣Pm ；C)將第二溫育樣品與第一標記試劑和至少一種第二標記試劑一起溫育以形成標記的 樣品；d)檢測標記的樣品，其中測量第一和至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平， 其中將所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平相對于所述第一核苷或核 苷酸類似物的摻入水平的差異測量為細胞RNA合成的變化，前提是所述第一核苷或核苷酸或所述至少一種第二核苷或核苷酸包含生物正交功能 部分。
4.權(quán)利要求1的方法，其中在用所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物進行處理的同 時或在此之前，用受試化合物處理樣品。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一類似物包含生物正交功能部分。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種第二類似物包含生物正交功能部分。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一類似物或所述至少一種第二類似物包含鹵素部分。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物正交功能部分可經(jīng)歷[3+2]環(huán)加成反應(yīng)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物正交功能部分可經(jīng)歷Maudinger連接反應(yīng)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物正交功能部分包含疊氮基、炔烴或膦部分。
11.權(quán)利要求1的方法，其中第一和第二類似物的至少一種，但非全部，是乙炔基-脫氧 尿嘧啶(EdU)。
12.權(quán)利要求1的方法，其中第一和第二類似物的至少一種，但非全部，是5-疊氮 基-2'-脫氧尿嘧啶(AzdU)。
13.權(quán)利要求7的方法，其中鹵素部分是溴、氯或碘。
14.權(quán)利要求1的方法，其中第一和第二類似物的至少一種，但非全部，是BrdU。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一標記試劑和第二標記試劑是包含生物正交功能 部分的標記物或抗體。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述生物正交功能部分可經(jīng)歷[3+2]環(huán)加成反應(yīng)。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述生物正交功能部分可經(jīng)歷Maudinger連接反應(yīng)。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述生物正交功能部分是疊氮基、炔烴或膦部分。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述標記物是熒光染料。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗體是抗BrdU抗體。
21.權(quán)利要求15的方法，其中所述第一標記試劑或第二標記試劑是染料標記的疊氮化物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述染料標記的疊氮化物選自羅丹明-疊氮化物、Alexa piUC)i: 350-疊氮化物、Alexa piuor 488-疊氮化物、 Alexa Fluor 555-疊氮化物、Alexa Fluor 568-疊氮化物、Alexa fluor 568-疊氮化 物、Alexa Fluor 594-疊氮化物、Alexa Fluor 633-疊氮化物、Alexa Fluor 647-疊 氮化物、Alexa FlUOr 680-疊氮化物、Pacific Blue 疊氮化物、Cascade Blue 疊氮化 物、熒光素-疊氮化物、花菁-疊氮化物、dapoxyl-疊氮化物和四甲基羅丹明(TMI )-疊氮 化物。
23.權(quán)利要求1的方法，其中以使第一核苷類似物與標記試劑之間形成共價鍵的方式， 將第一標記試劑與第二溫育樣品一起溫育。
24.權(quán)利要求1的方法，其中以使第二核苷類似物與標記試劑之間形成共價鍵的方式， 將第二標記試劑與第二溫育樣品一起溫育。
25.權(quán)利要求1的方法，其中利用流式細胞術(shù)檢測所述第一核苷類似物和所述至少一 種第二核苷類似物的摻入。
26.權(quán)利要求1的方法，其中利用熒光顯微術(shù)檢測所述第一核苷類似物和所述至少一 種第二核苷類似物的摻入。
27.權(quán)利要求1的方法，其中通過多孔板測定檢測所述第一核苷類似物和所述至少一 種第二核苷類似物的摻入。
28.權(quán)利要求1的方法，其中通過成像來檢測所述第一核苷類似物和所述至少一種第 二核苷類似物的摻入。
29.權(quán)利要求1的方法，其中通過高內(nèi)涵篩選來檢測所述第一核苷類似物和所述至少 一種第二核苷類似物的摻入。
30.權(quán)利要求1的方法，其中樣品是生物體或細胞培養(yǎng)物中的細胞。
31.就對細胞增殖或基因表達的作用篩選化合物的方法，其包括a)將樣品與有效量的第一核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第一溫育樣品；b)用受試化合物處理第一溫育樣品以形成處理的樣品；c)在用受試化合物處理第一溫育樣品的同時或在此之后將處理的樣品與至少一種第 二核苷或核苷酸類似物一起溫育以形成第二溫育樣品；d)將第二溫育樣品與第一標記試劑和至少一種第二標記試劑一起溫育以形成標記的 樣品；e)檢測標記的樣品，其中測量第一和至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平， 其中將所述至少一種第二核苷或核苷酸類似物的摻入水平相對于所述第一核苷或核苷酸類似物的摻入水平的差異測量為篩選的化合物對細胞增殖或基因表達的作用，前提是所述第一核苷或核苷酸或所述至少一種第二核苷或核苷酸包含生物正交功能 部分。
32.權(quán)利要求30的方法，其中樣品是生物體或細胞培養(yǎng)物中的細胞。
33.用于測量細胞核酸合成的變化的試劑盒，其中所述試劑盒包括a)第一核苷或核苷酸類似物；b)至少一種第二核苷或核苷酸類似物，其中至少所述第一類似物或所述至少一種第二 核苷或核苷酸類似物包含生物正交功能部分；c)第一標記試劑；和d)第二標記試齊LU
全文摘要
本發(fā)明提供了利用核酸的雙脈沖標記來測量細胞新生核酸合成的方法。使用核苷類似物進行的核酸的第一脈沖標記允許確定基線核酸合成速率。使用第二核苷類似物進行的核酸的脈沖標記允許測量核酸合成的任何變化?？蓪⒑怂岷铣蓽y量為細胞增殖(DNA)或基因表達(RNA)。該方法在脈沖標記之間不需要潛在地引入假象的中間清洗步驟。此外，該方法通過在用競爭性核苷類似物進行處理的同時或在此之前用受試化合物處理細胞或生物體，可用于就對細胞增殖的作用篩選化合物。
文檔編號C12Q1/68GK102119223SQ200980117709
公開日2011年7月6日 申請日期2009年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日
發(fā)明者J·布拉德福, S·克拉克 申請人:生命技術(shù)公司