專利名稱：植物病毒表達(dá)載體及其用于在植物基因組中產(chǎn)生遺傳型變異的用途的制作方法
植物病毒表達(dá)載體及其用于在植物基因組中產(chǎn)生遺傳型變
異的用途發(fā)明的領(lǐng)域和背景本發(fā)明在其一些實施方案中涉及植物病毒表達(dá)載體，并且更特別但非排它地，涉 及該病毒表達(dá)載體用于在植物基因組中產(chǎn)生遺傳型變異的用途。作物的遺傳修飾和改進(jìn)以及新品種的保護(hù)是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的基礎(chǔ)。在過去的若干年 中，從各種大基因組測序工程中獲得了巨量的數(shù)據(jù)，這使得在農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)中產(chǎn)生顯著 的進(jìn)步。此類技術(shù)包括植物基因組序列的基因表達(dá)、基因修飾、位點(diǎn)特異性基因誘變和基因 打靶，這發(fā)展了基礎(chǔ)植物研究模式并且可直接用于農(nóng)業(yè)上重要的植物物種的遺傳改良和保 護(hù)。將源自土壤桿菌(Agrobacterium)的外源DNA分子(例如，T-DNA)整合至植物基 因組中，整合入可通過稀有切割限制性酶產(chǎn)生的天然雙鏈斷裂處(DSB)。這些DSB可通過 植物非同源末端接合(NHEJ)蛋白識別并修復(fù)，并且導(dǎo)致了外源DNA頻繁地整合到這些隨機(jī) 位點(diǎn)中[Salomon 等，EMBO J(1998) 17 :6086-6095 Jzfira 等，Plant Physiol (2003) 133 1011-1023，Tzfira 等，Trends Genet (2004) 20 :375-383] DSB 還可以導(dǎo)致經(jīng)改進(jìn)的在植 物細(xì)胞中基于同源重組(HR)的基因打靶[Puchta等，Proc Natl Acad Sci USA(1996) 93 5055-5060]。在鋅指核酸酶(ZFN)作為用于基因組修飾的新工具的領(lǐng)域的最新進(jìn)展給植物基 因組中DSB的位點(diǎn)特異性誘導(dǎo)和用于植物物種基因打靶及植物保護(hù)的基于NHEJ的方法的 發(fā)展帶來了新的希望。ZFN是合成的限制性酶，可將其特異地設(shè)計為結(jié)合并切割dsDNA序列 的幾乎任意的長片段(參見

圖1)。ZFN顯示適于應(yīng)用非病毒載體在植物物種中位點(diǎn)特異性 地誘導(dǎo)基因組 DSB [Lloyd 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (2005) 102 :2232-2237 ；Tovkach 等，The Plant Journal (2009) 57,747-757] 在人類[Moehle 等，Proc Natl Acad Sci USA (2007) 104 :3055-3060]和昆蟲基因組[Beumer 等，Genetics (2006) 172 :2391-2403]中 也顯示了類似的效果。植物病毒作為載體以在植物中引入并表達(dá)非病毒基因的用途已得到了很好的證 實[例如，Donson 等，Proc Natl Acad Sci USA. (1991)88 :7204-8 ； Chapman 等，Plant J. (1992) 2 :549-57 ；Dolja 等，Virology (1998) 252 :269-74]。用經(jīng)修飾的病毒感染植 物比再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物(如上所述)更簡單且更快，因為植物病毒通常很小(3000至 10，000核苷酸之間)，容易操作，具有進(jìn)入植物細(xì)胞的固有能力，導(dǎo)致異源基因的迅速表達(dá) 并且將增殖以產(chǎn)生高拷貝量的目標(biāo)基因。已改造了病毒載體以用于遞送遺傳材料并在植 物中表達(dá)重組蛋白[例如，Pogue, Annu. Rev. Phytopathol. (200 40 :45-74 ;Gleba，等， Curr. Opin. Plant Biol. (2004)7 :182-188 ；Dolja 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89 10208-10212 ；RNA病毒載體的US專利號5316931和US專利號5811653]。病毒表達(dá)系統(tǒng)被 認(rèn)為是瞬時表達(dá)系統(tǒng)，因為病毒載體不整合至宿主基因組中，然而，取決于使用何種病毒， 病毒復(fù)制和基因表達(dá)可維持很長的時間(長達(dá)數(shù)周或數(shù)月)。至今，沒有記載或建議病毒載體用于在植物基因組中引入DSB的用途。
相關(guān)技術(shù)美國專利7，229，829號公開了攜帶用于遞送至植物中的異源核酸序列的TRV載體 (TRV-RNA1和TRV-RNA2)，其用于轉(zhuǎn)化植物和植物細(xì)胞。具體地，美國專利7，229，829號教 導(dǎo)了誘導(dǎo)基因沉默的病毒(VKS)的載體，包括設(shè)計用于抑制宿主植物基因表達(dá)(例如，用 于敲除基因表達(dá)而不需要遺傳轉(zhuǎn)化該植物的反義轉(zhuǎn)錄物)的載體，或設(shè)計用于表達(dá)異源核 酸(例如，介導(dǎo)基因沉默或基因抑制的核酸)的載體。美國
發(fā)明者A·朱克, A·瓦因斯坦 申請人:丹齊格創(chuàng)新有限公司, 耶路撒冷希伯來大學(xué)伊森姆研究發(fā)展公司