專利名稱：庚型肝炎病毒基因組全長cDNA克隆及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是庚型肝炎病毒基因組全長cDNA的克隆及其構(gòu)建方法。
1995年，美國有兩個研究小組幾乎同時分別報道了一種新型肝炎病毒，分別命名為GB病毒C(GBV-C)和庚型肝炎病毒(HGV)，簡稱為GBV-C/HGV。GBV-C/HGV可經(jīng)血傳播，在商業(yè)獻血員、血透析患者、靜脈藥癮者及乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染者中都有較高的感染率，引起輸血后肝炎及其他急、慢性肝病。GBV-C/HGV屬于黃病毒科，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約9.4kb，基因組中儀有一個開放閱讀框架(ORF)，結(jié)構(gòu)基因C、E1和E2位于氨基端，編碼結(jié)構(gòu)蛋白；非結(jié)構(gòu)基因NS2、NS3、NS4、NS5a和NS5b位于羧基端，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白；在開放閱讀框的兩側(cè)分別為5’非編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)(圖1中方框圖所示)。雖然報道的GBV-C/HGV全序列有11株之多，但全序列的讀取是根據(jù)分段克隆的基因片段的序列，迄今沒有具有整體功能的GBV-C/HGV基因組全長cDNA單個克隆?；蚱慰寺〔荒軓恼w上反映病毒的真正特性，影響了對GBV-C/HGV的深入研究。
本發(fā)明的目的是提供GBV-C/HGV基因組全長cDNA的克隆及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明構(gòu)建的庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆包含了GBV-C/HGV基因組從5’非編碼區(qū)，結(jié)構(gòu)基因C、E1、E2，非結(jié)構(gòu)基因NS2、NS3、NS4、NS5a和NS5b及3’非編碼區(qū)的全長基因。
庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建，采用重疊延伸PCR拼接基因片段和酶切、連接相結(jié)合的方法，包括如下步驟(1)合成擴增和拼接GBV-C/HGV基因片段的引物；(2)擴增和拼接GBV-C/HGV基因片段；(3)GBV-C/HGV基因片段的分段克隆(4)GBV-C/HGV基因組全長cDNA的先隆。
構(gòu)建GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆的基礎(chǔ)材料是含有GBV-C/HGV基因組不同區(qū)域基因片段的五個重組質(zhì)粒Iw5、Iwq2、Iwh6、Iw3’和Iw3(詳見文獻Li Shao et al.Biochem Biophys.Res.Commun1996；228785-791)。五個同名基因片段從3’至5’端相鄰片段互相重疊，覆蓋整個基因組(見圖1)，其中Iwq2和Iwh6兩個基因片段是用長PCR方法從病人血清中擴增而來，Iw5、Iw3’和Iw3基因片段則由5’或3’RACE方法從同一病人血清中擴增而來。
本發(fā)明利用重疊延伸PCR(SOEing and PCR)方法，將Iw5和Iwq2基因片段拼接為Iw5-q2基因片段；將Iw3和Iw3基因片段拼接得到Iw3’-3基因片段后，再與Iwh6基因片段拼接獲得Iwh6-3基因片段；將Iwq2和Iwh6拼接得到Iwq2-h6基因片段。拼接Iwq2-h6基因片段時，要求Iwq2-h6基因片段5’端與Iw5-q2基因片段的3’端互相重疊，且包括共同而且唯一的酶切位點；Iwq2-h6基因片段的3’端與Iwh6-3的5’端互相重疊，同樣包括共同且唯一的酶切位點。利用上述酶切位點及在擴增Iw5基因片段的上游引物和擴增Iw3基因片段的下游引物中加入的酶切位點，先進行GBV-C/HGV基因片段Iw5-q2、Iwq2-h6和Iwh6-3的分段克隆，獲得重組質(zhì)粒pUC-5-q2、pUC-q2-h6和pGEM-h6-3。待分段克隆成功后，再以此為基礎(chǔ)，利用限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接的方法構(gòu)建GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆pHGVqz。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點和積極效果本發(fā)明采用重疊延伸PCR(SOEing and PCR)拼接、限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接基因片段相結(jié)合的方法，構(gòu)建GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆，技術(shù)方案構(gòu)思巧妙。既避免了由數(shù)個小基因片段起始、經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、再由連接酶連接的繁雜過程，又因為采用先分段克隆再進行全長基因克隆的途徑而降低了實驗難度。GBV-C/HGV基因組全長cDNA的克隆成功，為廣泛深入地研究該病毒提供了重要實驗材料。利用GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆，可以從細胞水平到分子水平，從細胞模型到動物模型，從局部到整體等多方位、多角度地展開對GBV-C/HGV的致病性及致病機制，復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯機制，形態(tài)及形態(tài)發(fā)生等廣泛而深入的研究。


圖1為本發(fā)明中GBV-C/HGV基因組結(jié)構(gòu)及cDNA基因片段的位置，上部的方框圖代表GBV-C/HGV基因組結(jié)構(gòu)及各區(qū)基因的位置。下部的粗線圖及粗線上端的數(shù)字代表五個基因片段及其在基因組中的位置。
圖2為重組質(zhì)粒pUC-5-q2的構(gòu)建流程圖。
圖3為重組質(zhì)粒pUC-q2-h6的構(gòu)建流程圖。
圖4為重組質(zhì)粒pGEM-h6-3的構(gòu)建流程圖。
圖5為重組質(zhì)粒pHGVqz的構(gòu)建流程圖。
圖2～5中的圓圖代表環(huán)狀質(zhì)粒，粗線代表基因片段，Yx(x為1-12)代表引物。粗線兩端所標數(shù)字代表該基因片段在GBV-C/HGV基因組中的位置。
圖6 GBV-C/HGV基因組全長cDNA序列GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆的具體構(gòu)建方法見如下實施例一、合成擴增和拼接基因片段的引物(見表1)，引物的設(shè)計及合成參照5個基因片段的大小，同時要盡量滿足引物設(shè)計的一般條件。
表1.擴增及拼接GBV-C/HGV基因片段的引物引物序列(5’-3’)引物在基因組中的位置極性Y1GCG AAT TCG CGG CCG CCC CCC CCC1-26 +CGG CAC TGG GTG CAA GCY2AGA GAG ACA TTG AAG GGC GAC321-341 -Y3GAC AGG GTT GGT AGG TCG TAA ATCC 109-133 +Y4CCG TCC TTG ATG ATG GAA CTG TC 4399-4421-Y5TAT GGG CAT GGC ATA CCC CT 4261-4280+Y6GAG GGC CAC GAT GAT GTT AG 8696-8715-Y7TTC TGC TCC ACT TGG CTC GCT GAGT 8416-8440+Y8CTG GAT GCC ACA ACA GGC CCC T 8881-8902-Y9AGG GGC CTG TTG TGG CAT CCAG 8881-8902+Y10 GCT CTA GAC TCG AGA ATA AAA CCCGGC CTT TGG GCC G 9353-9375-Y11 TTG TTC GAT CAT ATG GGG TCC TTC TCG C 2977-3004+Y12 GAC CGG AGT CCC TTC AAG TAT CTC CTG G 7737-7764-二、以質(zhì)粒Iw5、Iwq2、Iwh6、Iw3’和Iw3為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)分別擴增5個同名基因片段，PCR反應(yīng)條件按常規(guī)根據(jù)預(yù)擴增基因片段的長度和所用引物的Tm(解鏈溫度)值進行調(diào)整。PCR擴增和拼接反應(yīng)均應(yīng)用ExpandTMLong Template PCR系統(tǒng)。
1、Iw5基因片段的擴增(圖2)(1)Iw5質(zhì)粒(50ng/ul) 1ul10mM dNTP 1.75ulY1(30uM)0.5ulY2(30uM)0.5ul滅菌重蒸水21.25ul------------------------------------(2)10X緩沖液15ul
DNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃30秒.65℃30秒、68℃1分鐘進行35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
2、Iwq2基因片段的擴增(圖2，圖3)(1)Iwq2質(zhì)粒(50ng/ul)1ul10mM dNTP 1.75ulY3(30uM) 0.5ulY4(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 21.25ul---------------------------------------(2)10X緩沖液I 5ulDNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃ 30秒、65℃ 30秒、68℃ 6分鐘進行35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
3、Iwh6基因片段的擴增(圖3，圖4)(1)Iwh6質(zhì)粒(50ng/ul) 1ul10mM dNTP1.75ulY5(30uM) 0.5ulY6(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 21.25ul---------------------------------------(2)10X緩沖液1 5ulDNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應(yīng)94℃ 2分鐘預(yù)變性，94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃ 6分鐘進行35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃ 10分鐘。
4、Iw3’基因片段的擴增(圖4)(1)Iw3’質(zhì)粒(50ng/ul) 1ul10mM dNTP1.75ulY7(30uM) 0.5ulY8(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 21.25ul---------------------------------------(2)10X緩沖液1 5ulDNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃30秒、60℃ 30秒、68℃1分鐘進行35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
5、Iw3基因段的擴增(圖4)(1)Iw3質(zhì)粒(50ng/ul)1ul10mM dNTP1.75ulY9(30uM) 0.5ulY10(30uM) 0.5ul
滅菌重蒸水 21.25ul---------------------------------------(2)10X緩沖液1 5ulDNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應(yīng)94℃ 2分鐘預(yù)變性，94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃1分鐘進行35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃ 10分鐘。
三、PCR的5個基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后，分別用DNA聚合酶I大片段(Klenow)處理37℃1小時，去除基因片段3’端存在的“A”(腺嘌呤核苷)。
例Iw5基因片段的Klenow酶處理(圖2)Iw5基因片段(0.1ug/ul) 50ul10X Klenow緩沖液 10ulKlenow酶(10單位/ul)1ul滅菌重蒸水39ul混勻后置37℃1小時，然后酚/氯仿抽提，無水乙醇沉淀。Iwq2、Iwh6、Iw3’和Iw3基因片段的Klenow酶處理依照此例進行(圖2，圖3，圖4)。
四、重疊延伸PCR拼接Iw5-q2、Iwq2-h6、Iw3’-3和Iwh6-3基因片段，PCR反應(yīng)條件根據(jù)預(yù)拼接基因片段的長度和所用引物的Tm值進行調(diào)整。
1、Iw5-q2基因片段的拼接(圖2)(1)經(jīng)Klenow酶處理后的Iw5基因片段(0.1ug/ul)2ul經(jīng)Klenow酶處理后的Iw q2基因片段(0.1ug/ul) 2ul10mM dNTP1.75ulY1(30uM) 0.5ulY4(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水1 8.25ul--------------------------------(2) 10X緩沖液1 5ul聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃30秒、60℃1分鐘、68℃6分鐘進行35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
2、Iw3’-3基因片段的拼接(圖4)(1)經(jīng)Klenow酶處理的Iw3’基因片段(0.1ug/ul)2ul經(jīng)Klenow酶處理的Iw3基因片段(0.1ug/ul) 2ul10mM dNTP 1.75ulY7(30uM)0.5ulY10(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水18.25ul(2) 10X緩沖液15ul聚合酶混合液(3.5單位/ul)0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃30秒、60℃30秒、68℃2分鐘進行35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
3、Iwh6-3基因片段的拼接(圖4)(1)經(jīng)Klenow酶處理的Iw3’-3基因片段(0.1ug/ul)2ul經(jīng)Klenow酶處理的Iwh6基因片段(0.1ug/ul) 2ul10mM dNTP 1.75ulY5(30uM) 0.5ulY10(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 18.25ul---------------------------------(2) 10X緩沖液15ul聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃30秒、65℃30秒、68℃6分鐘進行35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
4、Iwq2-h6基因片段的拼接(圖3)(1)經(jīng)Klcnow酶處理的Iwq2基因片段(0.1ug/ul) 2ul經(jīng)Klenow酶處理的Iwh6基因片段(0.1ug/ul) 2ul10mM dNTP1.75ulY11(30uM)0.25ulY12(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 18.25ul--------------------------(2) 10X緩沖液1 5ul聚合酶混合液(3.5單位/ul)0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃30秒、65℃45秒、68℃6分鐘進行35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
五、將Iw5-q2基因片段經(jīng)EcoRI+BamHI酶切，回收約3301bp的基因片段，與經(jīng)EcoRI+BamHI酶切的pUC18載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，酶切鑒定轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒pUC-5-q2(圖2)。Iwq2-h6基因片段經(jīng)BamHI+SalI酶切，回收約3298bp的基因片段與經(jīng)BamHI+SalI酶切的pUC18載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，酶切鑒定轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒pUC-q2-h6(圖3)。Iwh6-3基因片段經(jīng)SalI+XbaI酶切，回收約2806bp的基因片段，與經(jīng)SalI+XbaI酶切的pGEM-3Zf(+)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，酶切鑒定轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒pGEM-h6-3(圖4)。
六、將重組質(zhì)粒pUC-5-q2用EcoRI+BamHI酶切，回收約3301bp的基因片段；pUC-q2-h6用BamHI+SalI酶切，回收約3298bp的基因片段pGEM-h6-3用SalI+XbaI酶切，回收約2806bp的基因片段。將回收的三個基因片段與經(jīng)EcoRI+XbaI酶切的pGEM-3Zf(+)載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMI09，挑取轉(zhuǎn)化子進行酶切鑒定，初步確定克隆GBV-C/HGV基因組全長cDNA的重組質(zhì)粒pHGVqz(圖5)。
GBV-C/HGV全長基因片段與載體的連接pGEM-3Zf(+)/EcoRI+XbaI(0.1ug/ul)5-q2/EcoRI+BamHI(50ng/ul)q2-h6/BamHI+SalI(25ng/ul)h6-3/SalI+XbaI (60ng/ul)10X連接酶緩沖液 1.5ul連接酶(5u/ul) 1ul滅菌重蒸水 3.5ul混勻后14℃過夜。次日取連接物的三分之一進行轉(zhuǎn)化。
七、提取pHGVqz質(zhì)粒進行核苷酸序列測定。GBV-C/HGV基因組全長cDNA序列長9373bp(圖6)，與報道的GBV-C/HGV序列高度同源，但部分核苷酸發(fā)生了改變，結(jié)果表明，我們已成功地構(gòu)建了GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆。
GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆的成功，為深入研究該病毒提供了重要實驗材料。以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)可以進行多方面的研究，例如(一)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)在原核、真核(含昆蟲)細胞系統(tǒng)進行基因表達。
(二)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進行基因檢測、抗原檢測和抗體檢測研究。
(三)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進行有關(guān)GBV-C/HGV在體外細胞系統(tǒng)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯機制、病毒形態(tài)及形態(tài)發(fā)生研究。
(四)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進行致病性與免疫性研究。
(五)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進行基因治療、反義核酸治療及生物(多肽)藥物研究。
(六)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進行核酸疫苗、重組基因工程疫苗及疫苗免疫研究。
(七)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進行各種動物感染模型、轉(zhuǎn)基因動物模型及基因敲除動物模型的研究。
(八)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進行肽庫及抗體庫的構(gòu)建、篩選研究。
權(quán)利要求
1.庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆，其特征在于該克隆包含了GBV-C/HGV基因組從5’非編碼區(qū)，結(jié)構(gòu)基因C、E1、E2，非結(jié)構(gòu)基因NS2、NS3、NS4、NS5a和NS5b及3’非編碼區(qū)9373bp的全長基因。
2.一種庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建方法，其特征在于采用的是重疊延伸PCR拼接基因片段和酶切、連接相結(jié)合的方法，包括如下步驟(1)合成擴增和拼接GBV-C/HGV基因片段的引物；(2)擴增和拼接GBV-C/HGV基因片段；(3)GBV-C/HGV基因片段的分段克?。?4)GBV-C/HGV基因組全長cDNA的克隆。
3.按權(quán)利要求2所述的庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建方法，其特征在于利用重疊延伸PCR方法，將Iw5和Iwq2基因片段拼接為Iw5-q2基因片段；將Iw3’和Iw3基因片段拼接得到Iw3’-3基因片段后，再與Iwh6基因片段拼接獲得Iwh6-3基因片段；將Iwq2和Iwh6拼接得到Iwq2-h6基因片段；拼接Iwq2-h6基因片段時，要求Iwq2-h6基因片段5’端與Iw5-q2基因片段的3’端互相重疊，且包括共同而且唯一的酶切位點；Iwq2-h6基因片段的3’端與Iwh6-3的5’端互相重疊，同樣包括共同且唯一的酶切位點，利用上述酶切位點及在擴增Iw5基因片段的上游引物和擴增Iw3基因片段的下游引物中加入的酶切位點，先進行GBV-C/HGV基因片段Iw5-q2、Iwq2-h6和Iwh6-3的分段克隆，獲得重組質(zhì)粒pUC-5-q2、pUC-q2-h6和pGEM-h6-3；待分段克隆成功后，再以此為基礎(chǔ)，利用限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接的方法構(gòu)建GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆pHGVqz。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,是庚型肝炎病毒基因組全長cDNA的克隆及其構(gòu)建方法。以覆蓋GBV－C/HGV基因組全長cDNA的5個較小的基因片段為起始材料,經(jīng)過重疊延伸PCR、酶切、連接和轉(zhuǎn)化等,完成GBV－C/HGV基因組全長cDNA的克隆。GBV－C/HGV基因組全長cDNA克隆的成功,為研究GBV－C/HGV的致病性及致病機制、復(fù)制及轉(zhuǎn)錄和翻譯機制、形態(tài)及形態(tài)發(fā)生、基因及血清學(xué)特異診斷、核酸及基因工程疫苗和各種動物模型的建立等提供了重要材料。
文檔編號C12N15/51GK1202524SQ9811089
公開日1998年12月23日 申請日期1998年6月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月15日
發(fā)明者戚中田, 朱分祿, 邵力, 何建文, 潘衛(wèi), 崔曉紅, 朱詩應(yīng), 宋燕斌 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)