專利名稱：適用于黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組的通用引物及擴增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種用于煙草病毒基因組擴增和煙草病毒病檢測的通用引物及擴增方法，尤其是適用于煙草黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組擴增和煙草黃瓜花葉病毒病檢測的通用引物及擴增方法，屬于煙草病害研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)能侵染包括爺科、十字花科、豆科等 經(jīng)濟作物在內(nèi)的1000多種單子葉和雙子葉植物，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，是世界范圍內(nèi)最重要的植物病毒之一 [I]。煙草是茄科植物，作為ー種重要的經(jīng)濟作物，在世界各地種植廣泛。黃瓜花葉病毒是危害煙草的主要病毒病害[2]。黃瓜花葉病毒是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員，具有典型的三分體正義單鏈RNA (Positive sense single.Stranded RNA, +ssRNA)基因組，三條基因組分別為RNA1、RNA2和RNA3。根據(jù)血清學(xué)和核酸序列同源性，CMV株系被劃分為3個亞組IA、IB和II [3，4]。作為ー種典型的RNA病毒，CMV基因組序列極易發(fā)生變異[5]，對于亞組I和亞組II，組內(nèi)各株系間的核酸序列同源性在88%以上，而亞組間株系核酸序列同源性只有69%-77%[1]。如此低的序列同源性，給CMV全基因組PCR擴增帶來很大困難。目前，測定CMV基因組全序列，首先要確定CMV株系，主要根據(jù)CMV基因組部分區(qū)域如CP基因和3' UTR區(qū)域的基因序列確定；再根據(jù)確定的株系設(shè)計特異性全基因組擴增引物進行擴増。這樣設(shè)計的特異性引物，用于同組其它株系或其它亞組株系基因組全序列擴增時，由于不同亞組株系間序列同源性低，引物通用性差，匹配性不高，將直接造成擴增失敗。目前還沒有可以適用于CMV所有亞組不同株系基因組全序列擴增的通用引物及一歩法RT-PCR擴增方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題而專門提供的ー種適用于黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組的通用引物及擴增方法，即提供一套能夠用于煙草CMV檢測，特別是用于煙草CMV所有亞組株系全基因組擴增的通用引物，本發(fā)明的目的還在于提供利用該套引物擴增侵染煙草黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組擴增和檢測CMV的一歩法RT-PCR方法。本發(fā)明的上述技術(shù)目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。本發(fā)明的通用引物的名稱和核苷酸序列如下Pll GTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA ；
P12 CATGTGATGGGGGAACGTGT ；
P21 GAGAAGAATGGGACGTGATATCATC ；
P22 TGGTCTCCTTTTGGAGGCCCC ；
Pll GTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA ；
P31 CGTTCTCGAAGGCATCTCTGG ；
P41 CGATTCCAGAGATGCCTTCG ；
P42 GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT ；
P51 GTAATCTTACCACTGTGTGTGTGCG ；
P52 ACGGTAGAATCAAATTTCGGCAA ；
P61 CGCTCGCCTGTTGAAGTCG ；
P42 GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT。引物配對方式如下
Pll和P12配對；P21和P22配對；P11和P31配對；P41和P42配對；P51和P52配對；P61和P42配對。利用上述的通用引物擴增CMV不同亞組株系基因組序列的方法，包括以下具體步驟
(1)提取樣品RNA，以其為模板，以本發(fā)明提供的引物，使用一歩法RT-PCR進行擴增；
(2)PCR產(chǎn)物瓊脂糖膠電泳檢測，根據(jù)產(chǎn)物條帶有無和大小判斷樣品是否有CMV感染，目的條帶回收，連接T載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞；
(3)進行藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，確定陽性菌株，陽性菌株放大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒；
(4)陽性質(zhì)粒測序，結(jié)果分析，確定是否為CMV，測序結(jié)果經(jīng)過拼接，得到CMV基因組全序列。其中步驟(I)中的RT-PCR 25 U I體系為
反應(yīng)組分_ I組分體積
權(quán)利要求
1.ー種適用于黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組的通用引物，其特征在于該通用引物的名稱和核苷酸序列如下PllGTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA ；P12 CATGTGATGGGGGAACGTGT ；P21 GAGAAGAATGGGACGTGATATCATC ；P22 TGGTCTCCTTTTGGAGGCCCC ；PllGTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA ；P31CGTTCTCGAAGGCATCTCTGG ；P41 CGATTCCAGAGATGCCTTCG ；P42 GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT ；P51 GTAATCTTACCACTGTGTGTGTGCG ；P52 ACGGTAGAATCAAATTTCGGCAA ；P61 CGCTCGCCTGTTGAAGTCG ；P42 GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的適用于黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組的通用引物，其特征在于引物配對方式如下 Pll和P12配對；P21和P22配對；P11和P31配對；P41和P42配對；P51和P52配對；P61和P42配對。
3.ー種利用權(quán)利要求I所述的通用引物擴增CMV不同亞組株系基因組序列的方法，其特征在于具體步驟如下 (1)提取樣品RNA，以其為模板，以本發(fā)明提供的引物，使用一歩法RT-PCR進行擴增； (2)PCR產(chǎn)物瓊脂糖膠電泳檢測，根據(jù)產(chǎn)物條帶有無和大小判斷樣品是否有CMV感染，目的條帶回收，連接T載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞； (3)進行藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，確定陽性菌株，陽性菌株放大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒； (4)陽性質(zhì)粒測序，結(jié)果分析，確定是否為CMV，測序結(jié)果經(jīng)過拼接，得到CMV基因組全序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用通用引物擴增CMV不同亞組株系基因組序列的方法，其特征在于步驟(I)中的RT-PCR 25 u I體系為 反應(yīng)組分I組分體積
全文摘要
一種適用于黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組的通用引物及擴增方法，即提供一套能夠用于煙草CMV檢測，特別是用于煙草CMV所有亞組株系全基因組擴增的通用引物，本發(fā)明還還提供利用該套引物擴增侵染煙草黃瓜花葉病毒不同亞組株系基因組擴增和檢測CMV的一步法RT-PCR方法。本發(fā)明的有益效果是，只需一套引物，就能擴增得到CMV不同亞組株系基因組全序列和進行CMV病毒病檢測。結(jié)合一步法RT-PCR方法，能夠大大縮短CMV基因組擴增和CMV病毒病檢測時間。該套引物通用性強，擴增產(chǎn)物單一，一步法RT-PCR擴增方法簡單、快速、高效，使用該套引物和方法能夠有效促進CMV基因組的研究工作，加快研究進程。
文檔編號C12N15/40GK102864144SQ20121039668
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者羅朝鵬, 楊軍, 王燃, 李鋒, 魏春陽, 金立鋒, 金大偉, 周小龍, 林福呈 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院