專利名稱：金黃色葡萄球菌腸毒素a、b基因pcr同步檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR 同步檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus，簡稱金葡菌)是動物和人類化膿感染中最常見的病原菌，在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到， 因而食品受其污染的機會很多。食品受其污染后，不僅腐敗變質(zhì)，而且部分菌株產(chǎn)生葡萄球菌腸毒素Staphylococcal Enterotoxins，SEs)。腸毒素是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)，毒力相似，抗原性不同的胞外蛋白質(zhì)。根據(jù)其抗原性可將其分為5個血清型SEA、SEB、SEC、SED和SEE，這五類稱為經(jīng)典腸毒素(其中SEC中包括SEC1、SEC2和SEC3三種亞型)，也是全球食物中毒中最常見的血清型。各型腸毒素均可引起細(xì)菌性食物中毒，其中以A、D型引起的食物中毒最多，B型和C型次之。金黃色葡萄球菌在pH值低于5的條件下很少產(chǎn)生腸毒素，當(dāng)pH值高于9. 8時，無論何型腸毒素都不能產(chǎn)生。葡萄球菌在牛奶和谷粉粥上于20 37°C下經(jīng)4 他產(chǎn)生毒素，在5 6°C低溫下18d產(chǎn)生毒素或不產(chǎn)生毒素。在含水分、蛋白質(zhì)和淀粉較多的食品中， 葡萄球菌較易繁殖并產(chǎn)生毒素，如帶菌的生肉餡，于37°C下經(jīng)18 19h產(chǎn)生毒素，若在肉餡中加入少量饅頭碎屑，在同樣溫度下只經(jīng)過他就能產(chǎn)生毒素，可見淀粉對形成毒素有促進(jìn)作用。引起金黃色葡萄球菌腸毒素中毒的食品主要為肉、奶、魚、蛋類及制品等動物性食品。糕、涼拌切粉、剩飯和米酒等也曾引起過中毒；熟肉類如在熟后污染了致病葡萄球菌， 又在20 30°C的環(huán)境下放置較長時間，則極易引起中毒；奶和奶制品以及用奶制作的冷飲和奶油糕點常是引起中毒的食品；油煎雞蛋、熏魚、油浸魚罐頭等含油脂較多的食品，在污染上致病性葡萄球菌以后也能產(chǎn)生毒素。金黃色葡萄球菌在空氣中養(yǎng)分低時較易產(chǎn)生毒素，因此帶有此菌的食品，在通風(fēng)不良的高溫下放置，極有利此菌生長并產(chǎn)生毒素。當(dāng)食品污染了葡萄球菌并同時污染了其它微生物時，葡萄球菌的繁殖則受到抑制。如食品經(jīng)加熱， 原有的各種微生物已被殺死，拮抗微生物也不復(fù)存在，熟后再一次被葡萄球菌污染，則將會促進(jìn)葡萄球菌的生長并形成毒素。金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在世界各地均有發(fā)現(xiàn)。 常發(fā)生于夏秋季節(jié)，這是因為氣溫較高，有利于細(xì)菌繁殖。但在冬季，如受到污染的食品在溫度較高的室內(nèi)保存，葡萄球菌也可繁殖并產(chǎn)生毒素。當(dāng)此細(xì)菌數(shù)> IO6個/克時，產(chǎn)生的腸毒素可引起食物中毒等病癥。目前，檢測金黃色葡萄球菌腸毒素的方法有酶聯(lián)免疫雙抗法，雙向瓊脂擴散法。酶聯(lián)免疫雙抗法的缺點是易受食物成分及葡萄球菌蛋白A的影響，檢測時間長，費用較高，不利于在基層單位推廣使用。雙向瓊脂擴散法檢測時間長，靈敏度低
發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR 同步檢測引物、其檢測試劑盒和檢測方法。本發(fā)明提供一種金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測引物，其為SEAB-F :5，-TGATAAATAYAAAGRKAAAffAMGTAG-3‘ (SEQ ID No. 1)SEAB-R :5’ -GTTACACCACCATACATRCAAG-3，(SEQ ID No. 2)。其中，Y為C或T，R為A或G，K為G或T，W為A或T，M為A或C。其中所述的引物擴增片段為SEA的566-670bp的片段和SEB的338_472bp的片段， PCR擴增產(chǎn)物長度分別為105bp和13^p。根據(jù)電泳結(jié)果，即可判斷為何種腸毒素基因。本發(fā)明還提供含有上述引物的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測試劑盒，所述試劑盒還可包括PCR緩沖液、dNTPs、無菌超純水和Taq DNA聚合酶等。本發(fā)明還提供應(yīng)用上述的試劑盒在食品中食品中檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A、B 基因的方法，其包括1)提取食品中的DNA;2)以步驟1)提取的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；3)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。其中，所述的PCR反應(yīng)體系為每20μ 1的反應(yīng)液中，含有10-50ng的模板、 20-3(^] 各上下游引物、10\ 0 緩沖液2“ 1,0. 15-0. 25mM 的 dNTPs，1-1. 5U 的 Taq DNA 聚合酶，無菌超純水補足體積。其中，所述的PCR反應(yīng)條件為951預(yù)變性％^11，951變性308，50 討1退火 30 60s，72°C延伸lmin，共25 30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。取5 10 μ 1 PCR擴增產(chǎn)物點樣于3%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測，電壓為90V，電泳時間為40min，然后于凝膠成像系統(tǒng)中成像，觀察PCR擴增產(chǎn)物有無預(yù)期的DNA特異性片段。本發(fā)明開發(fā)了同步檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因引物和試劑盒。本發(fā)明的檢測試劑盒能夠準(zhǔn)確靈敏地檢測食品中的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B, DNA最低檢測濃度為3. 58ng，而且與其他細(xì)菌無交叉反應(yīng)，特異性好，同時樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本低于傳統(tǒng)的腸毒素檢測方法，而且本發(fā)明試劑保存時間長，無放射性污染。本發(fā)明對解決大批量樣品的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B的現(xiàn)場檢測技術(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。


圖1為簡并引物SEAB特異性的瓊脂糖凝膠電泳分析圖。M =DNA Marker B ；1,8 金黃色葡萄球菌SEA ；2，9 金黃色葡萄球菌SEB ；3 陰性對照；4 金黃色葡萄球菌；5 表皮葡萄球菌；6 大腸桿菌；7 沙門氏菌。圖2為金黃色葡萄球菌腸毒素B的DNA靈敏性試驗瓊脂糖凝膠電泳分析圖。M =DNA Marker B ；1,2 :358ng ；3，4 :35. 8ng ；5，6 3. 58ng ；7，8 :358pg ；9，10 :35. 8pg。圖3為SEA、SEB在同一個PCR反應(yīng)管中反應(yīng)的電泳分析圖。M =DNA Marker B ；1 SEA、SEB在同一 PCR反應(yīng)管中擴增的結(jié)果。圖4為細(xì)菌菌數(shù)10倍系列稀釋的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析圖。M =DNAMarker B ；1 :2X106cfu/ml ；2 :2X 105cfu/ml ；3 :2X 104cfu/ml ；4 :2X 103cfu/ml ；5 :2X 102cfu/ml ；6 :1. 9 X IO1CfVml ；7 陰性對照。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1簡并引物檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A、B的PCR試劑盒的組建(1)簡并引物SEAB上、下游各15mM, 100μ L·(2) IOX PCR 緩沖液(含 Mg2+20mM)，1. 5ml。(3) dNTPs (IOmM)，1. 5ml。(4)無菌超純水，3. Oml。 (5) Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)，100 μ 1。其中，上游引物為SEAB-F :5，-TGATAAATAYAAAGRKAAAffAMGTAG-3‘ (SEQ ID No. 1)下游引物為SEAB-R :5，-GTTACACCACCATACATRCAAG-3，(SEQ ID No. 2)。實施例2試劑盒操作取簡并上游引物(SEQID No. 1)0. 5 μ 1，簡并下游引物(SEQ ID No. 2)0. 5 μ 1, 10 X PCR緩沖液2 μ 1，dNTPs 0. 5 μ 1，Taq DNA聚合酶0. 5 μ 1，無菌超純水補足至20 μ 1，放入0. 2ml的離心管中，把提取的菌體DNAl μ 1加入上述體系中，總體積為20 μ 1，離心混勻后置PCR儀上進(jìn)行自動化擴增反應(yīng)。提取菌體DNA的方法①將Iml無水乙醇、Iml氨水和Iml石油醚加入到5ml人工污染金黃色葡萄球菌腸毒素A、B的乳品樣品中，混勻。②混合物以12000xg，離心lOmin。棄去上清液，剩余的沉淀用300 μ 1 10mM/L TE(pH7. 8)溶解。將Syl(IOmgAil)的溶葡萄球菌酶加入到上述液體中，37°C水浴lh，期間不斷劇烈振蕩。③將50μ1 10%的SDS加入上述液體中，煮沸5min。④將等體積的氯仿加入上述混合液中，充分振蕩混勻，17000xg離心lOmin，棄沉
淀，保留上清液。⑤將上清液移入一新的離心管中，用0. 1倍體積2. 5M乙酸銨(pH5.4)，2.5倍體積預(yù)冷無水乙醇和5 μ 1 (10mg/ml)糖原沉淀DNA，混合物17000xg，離心20min。DNA沉淀干燥后用50 μ 1 TE溶解，置于-20°C備用。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性％iin，95°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸lmin，共30 個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。取5 μ 1 PCR擴增產(chǎn)物點樣于3%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測，電壓為90V，電泳時間為 40min，然后于凝膠成像系統(tǒng)中成像，觀察PCR擴增產(chǎn)物有無預(yù)期的DNA特異性片段。結(jié)果表明，在IOObp和130bp左右出現(xiàn)兩條特異的條帶，而陰性對照則無條帶出現(xiàn)。實驗例1以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌為對照菌，利用上述檢測方法同時對金黃色葡萄球菌腸毒素SEA菌株，金黃色葡萄球菌腸毒素SEB菌株和對照菌株進(jìn)行PCR檢測，然后對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，實驗結(jié)果見圖1。由圖可知，簡并引物 SEAB只對金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、SEB菌出現(xiàn)PCR陽性擴增反應(yīng)，對照組未出現(xiàn)特異性片段，該簡并引物顯示了良好的特異性。實驗例2靈敏性實驗提取的金黃色葡萄球菌腸毒素B的DNA經(jīng)紫外分光光度計檢測并計算其濃度。DNA 定量測定方法將提取的DNA模板進(jìn)行適度稀釋，用紫外分光光度計測定260nm波長下的 OD值，DNA含量=OD260 X 50 μ g/ml (雙鏈DNA) X 10 (稀釋倍數(shù))，經(jīng)計算得DNA含量=358ng/ μ 1，將其逐步10—1 ； 10_2 ； 10_3 ； 10_4 ； 10_5稀釋，分別取1 μ 1為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，確定DNA最低檢測濃度為3. 58ng,電泳結(jié)果見圖2所示。實驗例3簡并引物同時檢測腸毒素A、B的實驗分別取SEA、SEB菌的DNA 1μ 1為模板，加入到同一個PCR反應(yīng)管中，無菌超純水 12 μ 1，其余用量不變，PCR反應(yīng)條件也不變，電泳結(jié)果見圖3，由圖可知SEA、SEB菌的PCR 特異性片段已擴增出并分離開，說明特異性簡并引物SEAB既可以分別檢測金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、SEB菌，又可以檢測出一個樣品中是否同時含有金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、 SEB菌。不但減少了引物用量，節(jié)約成本，而且縮短了檢測時間，提高檢測效率。實驗例4菌體靈敏性實驗本實驗不可以直接進(jìn)行菌體PCR，因為金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁比較厚，煮沸不能破壞其細(xì)胞壁，因此必須提取其DNA。本實驗的目的就要建立一種能夠同時快速檢測食品中 A型和B型金黃色葡萄球菌的PCR方法。以金黃色葡萄球菌腸毒素SEB菌株作為檢測菌，營養(yǎng)肉湯過夜增菌培養(yǎng)后用無菌生理鹽水做一系列10倍稀釋，再經(jīng)平板菌落計數(shù)得知各梯度濃度為2X106、2X105、 2X 104、2X 103、2X 102、1. 9X IOlJcfuAil,分別用PCR方法進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果表明本方法的靈敏性為2X103cfu/ml，顯示了較好的靈敏性，電泳結(jié)果見圖4所示。實驗例5本發(fā)明試劑盒檢測生牛乳中的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B實施例1的試劑盒檢測了 50份生牛乳，結(jié)果見表1可知，其中有3份被檢出含有 SEA，有4份被檢出含有SEB，有2份含有SEA和SEB，產(chǎn)毒素率為18%。本試驗結(jié)果與Mork 等及Jorgensen等報告生鮮乳中葡萄球菌產(chǎn)毒素率分別為38. 0%和22. 1%，基本一致。表1金黃色葡萄球菌及其腸毒素的檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測引物，其為SEAB-F :5’ -TGATAAATAYAAAGRKAAAffAMGTAG-3',SEAB-R :5’ -GTTACACCACCATACATRCAAG-3’。其中，Y為C或T，R為A或G，K為G或T，W為A或T，M為A或C。
2.含有權(quán)利要求1所述引物的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包含PCR緩沖液、dNTPs、無菌超純水和Taq DNA聚合酶。
4.應(yīng)用權(quán)利要求2或3所述的試劑盒檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因的方法，其包括1)提取食品中的DNA;2)以步驟1)提取的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；3)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)體系為每20μ 1的反應(yīng)液中，含有10-50ng的模板、20-30pM各上下游引物、10XPCR緩沖液2μ 1、0. 15-0. 25mM的 dNTPs, 1-1. 5U的I1aq DNA聚合酶，無菌超純水補足體積。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 4min, 95°C變性30s，50 54°C退火30 60s，72°C延伸lmin，共25 30個循環(huán)，最后72°C 延伸lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測引物、其檢測試劑盒和檢測方法。本發(fā)明提供的同步檢測引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示。本發(fā)明還提供含有所述引物的PCR檢測試劑盒。本發(fā)明的檢測試劑盒能準(zhǔn)確靈敏地檢測食品中的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B，DNA最低檢測濃度為3.58ng，而且與其他細(xì)菌無交叉反應(yīng)，特異性好，同時樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，成本低。
文檔編號C12R1/445GK102534041SQ20121005420
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者劉繼超, 周偉明, 姜鐵民, 陳歷俊 申請人:北京三元食品股份有限公司