專利名稱：菠蘿蔗糖合成酶基因Ac-Sy1、編碼蛋白質(zhì)以及其基因克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因及其克隆方法，同時涉及基因的編碼蛋白質(zhì)，具體涉及一種菠蘿 蔗糖合成酶基因AC-Syl、編碼蛋白質(zhì)以及基因克隆方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到果 實品質(zhì)改良的基因研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蔗糖合成酶(SS)是一種存在于細胞質(zhì)中的可溶性酶，由分子量為83 IOOkD的 亞基構(gòu)成的四聚體，蔗糖合成方向最適PH值在8. 0 9. 5，蔗糖裂解方向最適pH值5. 5 6. 5，催化如下可逆反應(yīng)Suc+UDP — — Fru+UDPG,它在蔗糖代謝中是起合成還是分解的 作用與其酶蛋白是否被磷酸化有關(guān)(Amor等，1995 ；Tanase和Yamaki，2000 ；Tanase等， 2002)。由于蔗糖合成酶具有分解和合成蔗糖的雙重屬性(龔榮高等，2004)，所以在調(diào)控蔗 糖代謝中可能起更重要的作用，在缺少轉(zhuǎn)化酶的情況下，SS分解方向是催化蔗糖分解的關(guān) 鍵酶，維持其質(zhì)量濃度的平衡具有重要意義。不同種類的果實，蔗糖合成酶在糖積累中的作 用也有差異，并且決定了果實中積累的糖的成分。梨(Moriguchi等，1998)、‘紅富士’蘋果(王永章和張大鵬，2001)、‘糯米糍’荔枝 (王惠聰?shù)龋?003)果實糖的積累主要受SS活性的調(diào)控。桃果實成熟過程中SS活性與蔗糖 的積累呈顯著正相關(guān)(范爽等，2006)。栽培型番茄中也發(fā)現(xiàn)，果實發(fā)育前期，SS活性與淀 粉和果糖的含量呈顯著正相關(guān)(劉以前等，2006;齊紅巖等，2006)。在番茄果實發(fā)育早期， 改變SS活性直接影響果實干物質(zhì)的積累速率和蔗糖分解指數(shù)，轉(zhuǎn)入反義SS基因明顯抑制 花和果實中的SS活性，SPS活性也同時隨著降低，番茄幼果中淀粉積累減少，幼果中蔗糖的 卸出能力下降。這說明SS直接影響到幼果中蔗糖的輸入能力(D’Aoust等，1999)。在葡萄 柚果實從細胞活躍期到膨大中期，汁囊中SS的合成活性逐漸升高，而分解活性迅速降低， 在各組織中，維管束和維管束卸出區(qū)SS活性最高，表明在維管束組織中SS具有重要的生理 功能(Lowell 和 Tomlinson, 1989 ；Nolte 和 Koch, 1993)。甜瓜上研究發(fā)現(xiàn)，甜基因型的品種比不甜基因型的品種積累的糖更多，這證實了 糖積累主要受基因型的控制(Hubbard等，1989)。酶基因的研究大多從克隆開始。目前國 外研究者已經(jīng)成功地將SS基因從梨、桃、番木瓜、馬鈴薯、胡蘿卜、玉米、甘蔗等作物中克隆 出來。雷美華等(2008)所克隆的甘蔗蔗糖酶合成基因SuSy2，該基因全長約為7.5kb，與 Lingle等(2001)報道的甘蔗蔗糖合成酶(SuSy2)基因序列相似性達到99. 15%，推導的氨 基酸序列同源性達到100%。該序列包含約119kb的上游啟動子調(diào)控區(qū)域，16個外顯子，15 個內(nèi)含子，3'不翻譯區(qū)，開放讀碼框(ORF)編碼802個氨基酸，氨基酸序列中存在糖代謝關(guān) 鍵酶家族保守的14-3-3蛋白磷酸化位點Ser/Thr。目前在柑橘、番茄、咖啡、玉米和棉花等作物中有許多有關(guān)蔗糖合成酶的基因克隆 和表達的研究，但在菠蘿研究領(lǐng)域中仍屬空白。菠蘿的SS基因的獲得，能夠為下一步菠蘿 品質(zhì)改良的研究奠定良好的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種菠蘿果實蔗糖合成酶基因Ac-Syl的核苷酸序列，其 核苷酸序列如SEQ ID N0:1，含360bp。本發(fā)明的另一個目的是提供一種菠蘿果實蔗糖合成酶基因Ac-Syl編碼的蛋白序 列，含120個氨基酸殘基，位于糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2。同時，本發(fā)明還提供該蔗糖合成酶基因Ac-Syl的克隆方法。本發(fā)明所提供的蔗糖合成酶基因，來自菠蘿(Ananas comosus)，命名為Ac-Syl基 因，核苷酸序列如SEQ ID NO =I0上述菠蘿蔗糖合成酶基因Ac-Syl編碼的蛋白質(zhì)，來自菠蘿(Ananas comosus)，命 名為Ac-Syl蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2。上述菠蘿蔗糖合成酶基因Ac-Syl的克隆方法，包括如下步驟(1)選用菠蘿果實作為實驗材料，采用改良SDS法提取菠蘿果實中的總RNA，RNA含 量及質(zhì)量采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。(2)以獲得的總RNA為模板，采用Takara公司生產(chǎn)的mRNA Selective PCR Kit Ver 1. 1進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。(3)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST信息設(shè)計菠蘿Ac-Syl基因編碼區(qū)引物正向引物 5，-GACCGGTCTAAGCCCATCATCT-3，和反向引物5，-ACAAGTCATAG CCTCCACCACA GT-3，，以 cDNA為模板，用Takara的Εχ-Taq進行PCR擴增，反應(yīng)程序如下85°C變性Imin，55°C復(fù)性 lmin，72°C延伸 2min，30 個循環(huán)后，72°C IOmin0(4)PCR產(chǎn)物回收后與pGEM-T easy Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε· coli DH 5 α 感受態(tài)細胞，采用藍白斑法篩選陽性克隆；篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進一步驗證后測序，獲得 Ac-Syl 基因。本發(fā)明的有益效果是菠蘿蔗糖合成酶基因的成功研究，為下一步菠蘿品質(zhì)改良的研究奠定良好的基 石出。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并 不限制本發(fā)明的范圍。菠蘿蔗糖合成酶基因Ac-Syl的分子克隆選用巴厘菠蘿果實作為實驗材料，提取果肉中的總RNA。以獲得的總RNA為摸板， 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST信息設(shè)計菠蘿Ac-Syl基因編碼區(qū)引物正向 引物5，-GACCGGTCTAAGCCCATCATCT-3，，反向引物5，-ACAAGTCATAGCCTCCACCACAGT-3，。采 用 Takara 的 Εχ-Taq 酶進行 PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物回收后與 pGEM-T easyVector (Promega)連 接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε. coli DH 5α感受態(tài)細胞，采用藍白斑篩選陽性克隆。篩選的陽性克隆 經(jīng)PCR進一步驗證后測序，獲得Ac-Syl基因。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種菠蘿果實蔗糖合成酶基因Ac Sy1，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO1。
2.—種權(quán)利要求1所述菠蘿蔗糖合成酶基因Ac-Syl編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于其氨 基酸序列如SEQ ID NO :2ο
3.—種權(quán)利要求1所述菠蘿蔗糖合成酶基因Ac-Syl的克隆方法，其特征在于包括如 下步驟(1)選用菠蘿果實作為實驗材料，采用改良SDS法提取菠蘿果實中的總RNA，RNA含量 及質(zhì)量采用瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)以獲得的總RNA為模板，采用Takara公司生產(chǎn)的mRNASelective PCR Kit Ver 1. 1 進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ；(3)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST信息設(shè)計菠蘿Ac-Syl基因編碼區(qū)引物正向引物 5，-GACCGGTCTAAGCCCATCATCT-3，和反向引物5，-ACAAGTCATAG CCTCCACCACA GT-3，，以 cDNA為模板，用Takara的Εχ-Taq進行PCR擴增，反應(yīng)程序如下85°C變性Imin，55°C復(fù)性 lmin, 72°C延伸 2min, 30 個循環(huán)后，72°C延伸 IOmin ；(4)PCR產(chǎn)物回收后與pGEM-Teasy Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε. coli DH 5α感受態(tài) 細胞，采用藍白斑法篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進一步驗證后測序，獲得Ac-Syl 基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及菠蘿果實中的一種蔗糖合成酶基因Ac-Sy1基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；本發(fā)明還涉及其基因的克隆方法采用改良SDS法提取菠蘿果實中的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測該菠蘿果實中的總RNA，以總RNA為摸板，以O(shè)ligo dT為引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，以cDNA為模板，用Takara的Ex-Taq進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy Vector連接，轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，經(jīng)PCR進一步驗證后測序，獲得Ac-Sy1基因；本發(fā)明的基因可為科學調(diào)控菠蘿果實品質(zhì)提供理論依據(jù)。
文檔編號C12N15/52GK101899452SQ201010196680
公開日2010年12月1日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月8日
發(fā)明者姚艷麗, 孫光明, 張秀梅, 杜麗清, 謝江輝 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所