專利名稱：一步法構(gòu)建陽離子化載體蛋白與玉米赤霉烯酮的偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及陽離子載體蛋白的制備及玉米赤霉烯酮-陽離子蛋白偶聯(lián)物的一步法構(gòu)建。將構(gòu)建的偶聯(lián)物作為免疫原免疫動(dòng)物，可提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，制備高質(zhì)量的抗玉米赤霉烯酮抗體。
背景技術(shù)：
玉米赤霉烯酮(karalenone)，又稱F_2毒素，玉米烯酮。其首先從有赤霉病的玉米中分離得到，玉米赤霉烯酮其產(chǎn)毒菌主要是鐮刀菌屬(Fusarium)的菌株，如禾谷鐮刀菌 (F. graminearum)和三線鐮刀菌(F. tricinctum)。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麥、大米、大麥、小米和燕麥等谷物，其中玉米的陽性檢出率為45%，最高含毒量可達(dá)到^K)9mg/ kg ；小麥的檢出率為20%，含毒量為0. 364 11. 05mg/kg。玉米赤霉烯酮的耐熱性較強(qiáng)， 110°C下處理Ih才被完全破壞。玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，主要作用于生殖系統(tǒng)，可使家畜，家禽和實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生雌性激素亢進(jìn)癥。妊娠期的動(dòng)物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流產(chǎn)，死胎和畸胎。食用含赤霉病麥面粉制作的各種面食也可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的中毒癥狀，如惡心，發(fā)冷，頭痛，神智抑郁和共濟(jì)失調(diào)等。由于ZEN污染食品的途徑很多，因此要完全杜絕ZEN的污染是不可能的，完善監(jiān)督措施和采用科學(xué)檢測(cè)方法可以在最大程度上減少ZEN對(duì)人類健康的危害。目前，ZEN的檢測(cè)方法主要有基于理化和免疫的分析方法，前者包括薄層層析法、高效液相色譜、質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳等，薄層層析法作為我國(guó)目前檢測(cè)ZEN國(guó)標(biāo)方法，雖然操作簡(jiǎn)便，成本低廉，但由于是半定量方法，靈敏度低，已經(jīng)難以滿足低檢測(cè)限的需要；而其他儀器分析方法雖然靈敏度高、重現(xiàn)性好，但同時(shí)存在著耗時(shí)、檢測(cè)儀器昂貴、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求；而酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)、免疫微柱以及免疫芯片等免疫學(xué)檢測(cè)方法由于節(jié)省時(shí)間、 成本低、操作簡(jiǎn)便，適合批量檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，正逐步受到我國(guó)各質(zhì)檢相關(guān)部門的重視。^N作為半抗原，需將其與載體蛋白偶聯(lián)后，才能具備刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體的免疫原性。但由于完全抗原制備過程復(fù)雜，ZEN利用率低，因此常常需要使用較大量的^N才能制備得到相應(yīng)的抗體；然而，“9. 11”事件后，ZEN作為一種劇毒的生物試劑被美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家嚴(yán)格控制。市場(chǎng)上該毒素標(biāo)準(zhǔn)品不僅價(jià)格高而且難以買到，這給研究^N的免疫學(xué)檢測(cè)方法帶來很大困難，也在一定程度上阻礙了免疫學(xué)方法的應(yīng)用和推廣。早期研究認(rèn)為ZEN本身性質(zhì)不活潑，不具備與載體蛋白連接的活性基團(tuán)，需將其衍生后，再與載體蛋白偶聯(lián)，即先將ZEN轉(zhuǎn)化為^N-羧基活化物GEN-Oxime，^N-O)，然后，在碳化二亞胺(l-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide，EDC)等偶聯(lián)劑的催化下，與載體蛋白發(fā)生縮合反應(yīng)，形成穩(wěn)定的^N-O-載體蛋白偶聯(lián)物。其中，第一步ZEN 的轉(zhuǎn)化率為70 % 80 %，ZEN-O的純化得率為80 % 90 %，而第二步，僅有30 % 40 %的 ZEN-O偶聯(lián)到載體蛋白上。因此，^N的總利用率在20%左右，利用率較低。綜合上述原因，研究提高ZEN利用率的偶聯(lián)物制備方法是非常必要的。本發(fā)明利用了陽離子載體蛋白胺甲基化原理構(gòu)建了 ^N-陽離子載體蛋白的偶聯(lián)物。在^N的結(jié)構(gòu)中，由于其羰基的α -活潑氫在弱酸條件下，以烯醇式存在，可通過甲醛的偶聯(lián)作用，與載體蛋白的胺乙基發(fā)生胺甲基化偶聯(lián)。由于陽離子載體蛋白的羧基幾乎全部被胺乙基取代，因而整個(gè)蛋白帶正電，作為完全抗原免疫動(dòng)物時(shí)，較之普通蛋白的偶聯(lián)物， 陽離子載體蛋白更易與機(jī)體內(nèi)帶弱負(fù)電的細(xì)胞膜表面結(jié)合，進(jìn)而被抗原提呈細(xì)胞識(shí)別和刺激機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答，同時(shí)，也提高了機(jī)體對(duì)共價(jià)偶聯(lián)在陽離子載體蛋白半抗原GEN)的識(shí)別和應(yīng)答水平，即可刺激抗原提呈細(xì)胞對(duì)半抗原決定簇的提呈、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖。本發(fā)明中^N的總利用率在50%左右。實(shí)驗(yàn)證明，通過該法制備的偶聯(lián)物具有較好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高質(zhì)量的ZEN抗體。因此，本發(fā)明相對(duì)于傳統(tǒng)合成方法， 有操作步驟少、毒素利用率高、抗體效價(jià)高等優(yōu)點(diǎn)。本專利發(fā)明者針對(duì)兩步法存在的諸多問題，發(fā)明了用陽離子載體蛋白一步構(gòu)建玉米赤霉烯酮-載體蛋白偶聯(lián)物的方法。相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種一步構(gòu)建^N-載體蛋白偶聯(lián)物的方法。(二)技術(shù)方案為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是烯醇或者含α-活潑氫的羰基化合物，在偶聯(lián)劑甲醛的作用下，能與伯胺或仲胺進(jìn)行偶聯(lián)。根據(jù)該原理，ZEN上羰基的α -活潑氫就能夠在甲醛的偶聯(lián)作用下與含有胺乙基的陽離子蛋白反應(yīng)，得到觀N-陽離子蛋白的偶聯(lián)物。陽離子化蛋白相對(duì)于簡(jiǎn)單蛋白而言， 具有較多的胺乙基，因而整個(gè)蛋白帶正電，作為完全抗原免疫動(dòng)物時(shí)，較之普通蛋白的偶聯(lián)物，陽離子載體蛋白更易與機(jī)體內(nèi)帶弱負(fù)電的細(xì)胞膜表面結(jié)合，進(jìn)而被抗原提呈細(xì)胞識(shí)別和刺激機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答.具體步驟1.陽離子蛋白的制備載體蛋白包括牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)、血孔匙蛋白(Keyhole limpet hemocyanin, KLH)、多聚賴氨酸 (Ploy-l-lysine, PLL)和辣根過氧化物酶(HRP)。制備步驟(1)將乙二胺(ethylenediamine，EDA)加入到冰浴中的2_乙烷磺酸基 (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid, MES)緩沖液中，并用 HCl 調(diào)節(jié) pH 至弱酸性；(2)將載體蛋白溶于MES后，與上述EDA溶液混勻；(3)滴加偶聯(lián)劑EDC于⑵所述溶液中，室溫反應(yīng)后，用醋酸終止反應(yīng)；(4)將上述反應(yīng)物用去離子水充分透析；(5)將其凍干后，凍干備用。所用EDA體積在20 μ L 100 μ L之間，所用的載體蛋白質(zhì)量在5mg IOOmg之間， EDA與MES的體積比在1 25 1 5之間，MES緩沖液的pH調(diào)節(jié)到4 6。制備得到陽離子牛血清白蛋白(Cationized bovine serum albumin，cBSA)、陽離子卵清白蛋白(Calionized ovalbumin, cOVA)、陽離子血孔匙蛋白(Cationized keyhole limpet hemocyanin，cKLH)、陽離子多聚賴氨酸(Cationized ploy-l-lysine，cPLL)或陽離子辣根過氧化物酶(Cationized horseradishperoxidase, cHRP)。2. ZEN-陽離子載體蛋白偶聯(lián)物的制備ZEN-陽離子載體蛋白偶聯(lián)物包括 ZEN-cBSA、ZEN_c0VA、ZEN_cKLH、ZEN-cPLL 和 ZEN-HRPo制備步驟(1)將陽離子載體蛋白和^N分別用MES緩沖液和二甲基甲酰胺溶解后，將ZEN溶液逐滴加入到載體蛋白液中混勻；(2)在上述反應(yīng)液中加入偶聯(lián)劑甲醛，反應(yīng)后即得到^N-陽離子載體蛋白偶聯(lián)物；(3)用去離子水充分透析后，凍干備用。其中，陽離子載體蛋白與^N的質(zhì)量比例在1 1 5 1之間，二甲基甲酰胺和甲醛的體積比在1 1 5 1之間。(三)有益效果本發(fā)明以ZEN為半抗原，利用陽離子蛋白一步法合成觀N-載體蛋白偶聯(lián)物，該法具有步驟簡(jiǎn)單、ZEN利用率高等優(yōu)點(diǎn)，避免了目前所用兩步法步驟多、利用率低等缺點(diǎn)。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明專利進(jìn)一步說明。圖UEN的結(jié)構(gòu)圖2載體蛋白的陽離子化圖3ZEN與陽離子載體蛋白的偶聯(lián)機(jī)理①ZEN在弱酸性緩沖液中的烯醇化；②陽離子載體蛋白中亞胺離子的形成；③陽離子載體蛋白中的亞胺離子在甲醛作用下，與烯醇化ZEN偶聯(lián)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例ΙΖΕΝ-cBSA偶聯(lián)物的制備1. IcBSA 的制備將50 100 μ LEDA加入到500 μ L冰浴MES緩沖液中，并用HCI將ρΗ調(diào)節(jié)到5. 5 左右，再將5 IOOmg BSA溶解于50 μ L的MES緩沖液，然后，與上述EDA溶液混勻，再在上述混合液中添加2 50mg的EDC，室溫?cái)嚢? 12h后，用醋酸終止反應(yīng)，最后用去離子水充分透析48 72h，凍干備用。1. 2ZEN-CBSA偶聯(lián)物的制備將5 IOOmg的cBSA與2mg ZEN分別用500 10000 μ L去離子水和50 1000 μ L 二甲基甲酰胺溶解后，再將上述ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白質(zhì)溶液中混勻，然后迅速加入50 1000 μ L甲醛，37°C下輕搖Mh，用去離子水充分透析4 后，凍干備用。實(shí)施例2^N_c0VA偶聯(lián)物的的制備2. IcOVA 的制備
將50 100 μ L EDA加入到500 μ L冰浴MES緩沖液中，并用HCl將ρΗ調(diào)節(jié)到5. 5 左右，再將5 IOOmg OVA溶解于100 μ L的上述緩沖液，然后，與上述EDA溶液混勻，再在上述混合液中添加2 50mg的EDC，室溫?cái)嚢? 1 后，用醋酸終止反應(yīng)，最后用去離子水充分透析48 72h，凍干備用。2. 2ZEN-C0VA偶聯(lián)物的制備將5 IOOmg的cOVA與1 50mg ZEN分別用500 10000 μ L去離子水和50 1000 μ L 二甲基甲酰胺溶解后，再將上述ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白質(zhì)溶液中混勻，然后迅速加入50 IOOOyL甲醛，37°C下輕搖Mh，用去離子水充分透析4 后，凍干備用。
實(shí)施例3^N_cKLH偶聯(lián)物的制備3. IcKLH 的制備將50 100 μ L EDA加入到冰浴的500 μ LMES緩沖液中，并用HCl將ρΗ調(diào)節(jié)到 5. 5左右，再將5 IOOmg KLH溶解于800 μ L上的上述MES緩沖液，然后，與上述EDA溶液混勻，再在上述混合液中添加2 50mg的EDC，室溫?cái)嚢? 1 后，用醋酸終止反應(yīng)，最后用去離子水充分透析48 72h，凍干備用。3. 2ZEN-CKLH偶聯(lián)物的制備將5 IOOmg的cKLH與1 50mg ZEN分別用500 10000 μ L去離子水和50 1000 μ L 二甲基甲酰胺溶解后，再將上述ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白質(zhì)溶液中混勻，然后迅速加入50 IOOOyL甲醛，37°C下輕搖Mh，用去離子水充分透析4 后，凍干備用。實(shí)施例4ZEN-CPLL偶聯(lián)物的制備4. IcPLL 的制備將50 100 μ LEDA加入到冰浴的500 μ L上MES緩沖液中，并用HCl將ρΗ調(diào)節(jié)到 5. 5左右，再將5 IOOmgPLL溶解于1000 μ L的上述MES緩沖液，然后，與上述EDA溶液混勻，再在上述混合液中添加2 50mg的EDC，室溫?cái)嚢? 1 后，用醋酸終止反應(yīng)，最后用去離子水充分透析48 72h，凍干備用。4. 2ZEN-CPLL偶聯(lián)物的制備；將5 IOOmg的cPLL與1 50mg ZEN分別用500 10000 μ L去離子水和50 1000 μ L 二甲基甲酰胺溶解后，再將上述ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白質(zhì)溶液中混勻，然后迅速加入50 IOOOyL甲醛，37°C下輕搖Mh，用去離子水充分透析4 后，凍干備用。
實(shí)施例5^N_cHRP偶聯(lián)物的制備4. IcHRP 的制備將50 100 μ LEDA加入到冰浴的500 μ L上MES緩沖液中，并用HCl將ρΗ調(diào)節(jié)到 5. 5左右，再將5 IOOmg HRP溶解于1000 μ L的上述MES緩沖液，然后，與上述EDA溶液混勻，再在上述混合液中添加2 50mg的EDC，室溫?cái)嚢? 1 后，用醋酸終止反應(yīng)，最后用去離子水充分透析48 72h，凍干備用。4. 2ZEN-CHRP偶聯(lián)物的制備；將5 IOOmg的cPLL與1 50mg ZEN分別用500 10000 μ L去離子水和50 1000 μ L 二甲基甲酰胺溶解后，再將上述ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白質(zhì)溶液中混勻，然后迅速加入50 IOOOyL甲醛，37°C下輕搖Mh，用去離子水充分透析4 后，凍干備用。上述所用MES緩沖液濃度均為0. lmol/L, HCl均為lmol/L，醋酸均為4mol/L。
ZEN-陽離子蛋白偶聯(lián)物的鑒定；采用紫外分光光度計(jì)對(duì)陽離子載體蛋白、ZEN標(biāo)品及偶聯(lián)物進(jìn)行掃描，根據(jù)其特征吸收峰來確定偶聯(lián)是否成功。結(jié)果顯示，ZEN-陽離子載體蛋白偶聯(lián)物在270nm和315nm有兩個(gè)主要的吸收峰， 前一個(gè)吸收峰是載體蛋白O80nm)的疊加峰，而后者是ZEN的另一特征吸收峰(315nm)。根據(jù)偶聯(lián)比公式，結(jié)合紫外圖譜上吸收峰波長(zhǎng)及吸光度，可以計(jì)算出ZEN與陽離子蛋白的偶聯(lián)比。
Mm/ — _A 1 * -31 Wsza^ 1 Snm_
M MMm(Α %^ ·2 8ιιιη — A 1% ·3 ISamx ^ZM-IMmJ^ZMf3 ISnir} /ε-SlSam其中Μζεν 偶聯(lián)物中^N的摩爾質(zhì)量；Mme 偶聯(lián)物中載體蛋白的摩爾質(zhì)量；A腿物.278nm 偶聯(lián)物在278nm處的吸光度；A腿物.366nm 偶聯(lián)物在366nm處的吸光度；ε ZEN. 278nm :ZEN在278nm處的摩爾吸光系數(shù)；ε ZEN. 366nm :ZEN在366nm處的摩爾吸光系數(shù)；ε ·5Θ. 278μ 載體蛋白在278nm處的摩爾吸光系數(shù)經(jīng)過計(jì)算，ZEN與陽離子蛋白的偶聯(lián)比在8. 8左右，證明了成功制備^N-陽離子蛋白偶聯(lián)物。主要參考文獻(xiàn)1. Thouvenot D, and R F Morfin. Radioimmunoassay for zearalenone and zearalanol in human serum !production, properties, and use ofporcine antibodies[J], Appl Environ Microbiol,1983,45(1) :16-232.Ildiko BV, Agnes G, Laszlo S. Monoclonal Antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay offusarium T-2 and zearalenone toxins in cereals[J]. 1994, 60(2) :729-731.3. Liu Y, Liu XJ, Yu XY, et al. Synthesis of artificial antigen and preparation of polyclonal antibodiesagainst zeranol[J]. J Anal Sci,2006,22(1) 1-4.4. Dioxn SN, Russell KL. Radioimmunoassay of the anabolic agent zeranol II. Zeranol concentrations inurine ofsheep and cattle implanted with zeranol(Ralgro)[J]. J Vet Pharmacol Therap, 1983,6 :173-179.5. Chen XJ, Liu HC, Meng FJ. Direct enzyme-linked immunoassay for zearalenone[J]. Plant PhysioICommun,1990,16 (1) :70-76 (in Chinese).6. Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Mycotoxin Zearalenone[J]. Applied andEnvironmemal Microbiology,1985,50(2) :332-336.7. James LJ, LG Mcgirr, and TK Smith. High pressure liquid chromatography of zearalenone andzearalenols in rat urine and liver[J]. J Assoc OffAnal Chem, 1982,65 :8-13.
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權(quán)利要求
1.陽離子蛋白，其特征在于結(jié)構(gòu)式
2. ZEN-陽離子蛋白偶聯(lián)物，其特征在于它的分子結(jié)構(gòu)式為
3.制備權(quán)利要求1所述一種陽離子載體蛋白的方法，其特征在于包括步驟(1)制備cBSA，步驟如下將 20 100 μ L 乙二胺(ethylenediamine,EDA)加入到冰浴的 500 μ L 0. lmol/L 2-乙烷磺胺 O-(N-morpholino) ethane s μ Lfonic acid，MES)緩沖液中，并用 lmol/L HCl 將pH 調(diào)節(jié)到4 6，然后，將5 IOOmg BSA溶解在50 μ L的上述MES緩沖液后，與上述EDA溶液混勻，再在上述混合液中添加2 50mg的碳化亞二胺(l-Ethyl-3-[3-dimethylaminoprop yl]Carbodiimide，EDC)，室溫?cái)嚢? 12h，用4mol/L醋酸終止反應(yīng)，用去離子水充分透析 48 7 后，將其凍藏備用。(2)制備cOVA，步驟如下將20 100 μ L EDA加入到冰浴的500 μ L 0. lmol/L MES緩沖液中，并用lmol/L HCl 將PH調(diào)節(jié)到4 6，然后，將5 IOOmg OVA溶解在100 μ L的上述MES緩沖液后，與上述 EDA溶液混勻，再在上述混合液中添加2 50mg的碳化亞二胺EDC，室溫?cái)嚢? 12h，用 4mol/L醋酸終止反應(yīng)，用去離子水充分透析48 7 后，將其凍藏備用。(3)制備cKLH，步驟如下將20 IOOyL EDA加入到冰浴的500 μ L0. lmol/L MES緩沖液中，并用lmol/L HCl將 PH調(diào)節(jié)到4 6，然后，將5 IOOmg KLH溶解在800 μ L的上述MES緩沖液后，與上述EDA 溶液混勻，再在上述混合液中添加2 50mg的碳化亞二胺EDC，室溫?cái)嚢? 12h，用4mol/ L醋酸終止反應(yīng)，用去離子水充分透析48 7 后，將其凍藏備用。(4)制備cPLL,步驟如下將20 100 μ LEDA加入到冰浴的500 μ L 0. lmol/L MES緩沖液中，并用lmol/L HCl 將PH調(diào)節(jié)到4 6，然后，將5 IOOmg PLL溶解在1000 μ L的上述MES緩沖液后，與上述 EDA溶液混勻，再在上述混合液中添加2 50mg的碳化亞二胺EDC，室溫?cái)嚢? 12h，用 4mol/L醋酸終止反應(yīng)，用去離子水充分透析48 7 后，將其凍藏備用。(4)制備cHRP，步驟如下將20 100 μ L EDA加入到冰浴的500 μ L 0. lmol/L MES緩沖液中，并用lmol/L HCl 將PH調(diào)節(jié)到4 6，然后，將5 IOOmg HRP溶解在1000 μ L的上述MES緩沖液后，與上述 EDA溶液混勻，再在上述混合液中添加2 50mg的碳化亞二胺EDC，室溫?cái)嚢? 12h，用 4mol/L醋酸終止反應(yīng)，用去離子水充分透析48 7 后，將其凍藏備用。所用EDA體積在20 μ L 100 μ L之間，所用的載體蛋白質(zhì)量在5 IOOmg之間，EDA與 MES的體積比在1 25 1 5之間，MES緩沖液的pH調(diào)節(jié)到4 6。
4.如權(quán)利要求2所述一種^N-陽離子載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于ZEN上羰基的α-活潑氫能夠在甲醛的偶聯(lián)作用下與陽離子蛋白的胺乙基反應(yīng)，得到觀N-陽離子載體蛋白的偶聯(lián)物，能夠制備包括免疫抗原、包被抗原和酶標(biāo)記物在內(nèi)的ZEN-陽離子蛋白偶聯(lián)物，得到ZEN完全抗原。
5.如權(quán)利要求2所述一種^N-陽離子載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法，其特征是偶聯(lián)劑甲
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于包括步驟(1) ZEN-cBSA的制備，步驟如下將5 IOOmg cBSA與1 50mg ZEN分別用500 `10000 μ L去離子水和50 1000 μ L 二甲基甲酰胺溶解，再將ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白質(zhì)溶液中，混勻后，迅速加入50 1000 μ L甲醛，37 °C下輕搖Mh，充分反應(yīng)后即得到 ZEN-cBSA,接著用去離子水充分透析4 后，凍干備用。(2)ZEN-cOVA的制備，步驟如下將5 IOOmg的cOVA與1 50mg ZEN分別用500 10000 μ L去離子水和50 1000 μ L 二甲基甲酰胺溶解，再將ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白質(zhì)溶液中，混勻后，迅速加入50 1000 μ L甲醛，37 °C下輕搖Mh，充分反應(yīng)后即得到 ZEN-cOVA,接著用去離子水充分透析4 后，凍干備用。(3)ZEN-cKLH的制備，步驟如下將5 IOOmg cKLH與1 50mg ZEN分別用500 10000 μ L去離子水和50 1000 μ L 二甲基甲酰胺溶解，再將ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白質(zhì)溶液中，混勻后，迅速加入50 IOOOyL甲醛，37°C下輕搖Mh，充分反應(yīng)后即得到 ^N-cKLH，用去離子水充分透析4 后，凍干備用。(4)ZEN-cPLL的制備，步驟如下將5 IOOmg cPLL與1 50mg ZEN分別用500 10000 μ L去離子水和50 1000 μ L 二甲基甲酰胺溶解，再將ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白質(zhì)溶液中，混勻后，迅速加入50 1000 μ L甲醛，37 °C下輕搖Mh，充分反應(yīng)后即得到 ZEN-cPLL,接著用去離子水充分透析4 后，凍干備用。(5)ZEN-cHRP的制備，步驟如下將5 IOOmg cHRP與1 50mg ZEN分別用500 10000 μ L去離子水和50 1000 μ L 二甲基甲酰胺溶解，再將ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白質(zhì)溶液中，混勻后，迅速加入50 1000 μ L甲醛，37 °C下輕搖Mh，充分反應(yīng)后即得到 ZEN-cHRP,接著用去離子水充分透析4 后，凍干備用。其中，陽離子載體蛋白與ZEN的質(zhì)量比例在1 1 5 1之間，二甲基甲酰胺和甲醛的體積比在1 1 5 1之間。
全文摘要
本發(fā)明根據(jù)胺甲基化反應(yīng)反應(yīng)原理，利用玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)中羰基碳的α-活潑氫，以甲醛為偶聯(lián)劑，與陽離子蛋白中的胺乙基發(fā)生縮合反應(yīng)，一步法構(gòu)建玉米赤霉烯酮-陽離子載體蛋白偶聯(lián)物。該法較之目前采用先將玉米赤酶烯酮衍生化為羧基活化物后，再與載體蛋白縮合偶聯(lián)的兩步法，具有步驟少、操作簡(jiǎn)單、利用率高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/08GK102295697SQ201010209199
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月25日
發(fā)明者李曉紅, 李蒙, 楊美華, 高源 , 齊云 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所