專利名稱：檢測(cè)苯丙酮尿癥pah基因7個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的試劑盒及其pcr擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因7個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的試劑盒及其PCR擴(kuò) 增方法，該檢測(cè)結(jié)果可用于臨床輔助診斷苯丙酮尿癥，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的臨床檢測(cè)技 術(shù)。
背景技術(shù)：
苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)由阿斯布喬恩·佛倫(Asbjorn· Foiling) 于1934年首次發(fā)現(xiàn)，他用經(jīng)典的有機(jī)化學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)患者尿液里含有大量的苯丙酮酸， 苯丙酮尿癥因此得名。PKU是一種由于氨基酸代謝缺陷而引起的一種常染色體隱性遺傳病， 發(fā)病率約為1/10000，雜合體頻率約為1/50，是我國(guó)法定的新生兒期進(jìn)行普查的兩種疾病 之一(另外一種是甲狀腺功能低下)。本病患兒出生時(shí)臨床表現(xiàn)正常，但如果未經(jīng)過(guò)法定的篩查及低苯丙氨酸飲食治療 的話，患兒一兩個(gè)月后便開(kāi)始出現(xiàn)異常癥狀。如皮膚、毛發(fā)和膜的色素減退，皮膚色白，頭發(fā) 呈褐色，約1/3嬰兒出現(xiàn)濕疹，也有出現(xiàn)干燥和粗糙的皮膚異常；易流涎和出汗，汗液有特 殊的霉臭或鼠樣氣味；約1/4的患兒出現(xiàn)痙攣性癲癇，加上輕癲癇發(fā)生率可達(dá)50%以上 ’大 部分患兒表現(xiàn)行為焦躁，肌張力和運(yùn)動(dòng)過(guò)度，膝、股部屈曲，走路無(wú)節(jié)制；絕大部分患兒嚴(yán)重 智力低下，頭小畸形。其發(fā)病機(jī)理在于人體必需的氨基酸苯丙氨酸被吸收后，一部分被利用合成蛋白 質(zhì)，一部分則通過(guò)酪氨酸途徑降解，此過(guò)程需要苯丙氨酸羥化酶及其輔酶四氫生物蝶啶BH4 的作用。當(dāng)此二者中任何一種缺乏時(shí)，降解反應(yīng)便不能進(jìn)行。經(jīng)典型苯丙酮尿癥是指由于 編碼苯丙氨酸羥化酶(PAH)的PAH基因發(fā)生突變，導(dǎo)致苯丙氨酸羥化酶缺陷，而不能使苯丙 氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸，苯丙氨酸在血液中堆積，并在轉(zhuǎn)氨酶的作用下形成苯丙酮酸、苯乳酸、 苯乙酸等旁路代謝產(chǎn)物；這些產(chǎn)物一部分隨尿液排出，使尿呈特殊的霉?fàn)€臭味，而更多的產(chǎn) 物則積聚在血液和腦脊液中，這對(duì)正在迅速發(fā)育的嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)造成不同程度的毒害，引 起不可逆的大腦損傷和嚴(yán)重的智力發(fā)育障礙。臨床上，在嬰兒出生經(jīng)母乳喂養(yǎng)3天后，通過(guò)足跟采血并檢測(cè)新生兒血液中苯丙 氨酸的濃度以達(dá)到PKU篩查的目的。一旦確診，目前唯一的治療方法是保持低苯丙氨酸的 攝入量，具體措施是患者長(zhǎng)期食用人工合成的含低苯丙氨酸的奶粉及其他食品。然而，這類 食品不易獲得而且價(jià)格昂貴，長(zhǎng)期食用給患者的家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，對(duì)高危胎 兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，防止患兒的出生才是有效的解決方法。人類PAH基因定位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂，S卩12q22-12q24. 2，全長(zhǎng)約90kb，其中包 含13個(gè)外顯子的長(zhǎng)度在57-892bp之間，全長(zhǎng)2. 3kb，其閱讀框架為1353bp共編碼451個(gè) 氨基酸。通過(guò)對(duì)PAH基因正常及突變序列的分析，絕大部分PAH缺乏或活性降低的病因在 于PAH基因的點(diǎn)突變，而不是由于PAH基因的全部或部分缺失。突變或?qū)е孪鄳?yīng)的氨基酸 置換，而使PAH的理化性質(zhì)改變，形成不穩(wěn)定的酶蛋白或影響PAH酶的催化活性或者產(chǎn)生終止密碼使PAH的合成提前終止，最終導(dǎo)致PAH缺乏；而剪接位點(diǎn)突變導(dǎo)致剪接異常，表達(dá)出 錯(cuò)誤的mRNA，進(jìn)而翻譯成異常的肽鏈，最終影響PAH酶的活性。由于PCR技術(shù)以及DNA測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致經(jīng)典型苯丙酮尿 癥的一系列PAH基因突變位點(diǎn)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。在PAH基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)已登記的320余種PAH 突變中，近3/4的已知突變位于外顯子5至外顯子12之間，外顯子7中的突變約占1/4。在 國(guó)內(nèi)，據(jù)研究和分析表明PKU基因突變已達(dá)25種，3/4的導(dǎo)致中國(guó)人經(jīng)典型PKU的基因突變 已經(jīng)被查清，他們分別屬于近20種不同的突變類型，而常見(jiàn)的有7種，具體見(jiàn)下表表1.中國(guó)人群PAH基因的7個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn) 表1所列的7種突變類型的總數(shù)可達(dá)中國(guó)人PKU病例的70%左右。雖然建立利 用內(nèi)含子3內(nèi)的STR(短串聯(lián)重復(fù)序列)遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，判斷高危胎兒攜帶的基 因型來(lái)開(kāi)展產(chǎn)前診斷的工作已有報(bào)道，但由于其技術(shù)本身的局限性，目前直接檢測(cè)PAH基 因中的點(diǎn)突變?nèi)匀皇菍?duì)PKU進(jìn)行基因診斷和產(chǎn)前診斷的主要途徑。目前，世界上有許多科 研機(jī)構(gòu)和生物科技公司正致力于基因突變檢測(cè)的研究，已開(kāi)發(fā)了許多有效的檢測(cè)方法，如 PCR-SSCP, TGGE, DGGE, SNaPshot、HRMA、分子信標(biāo)、DNA直接測(cè)序等，然而這些方法的缺點(diǎn)是 耗時(shí)多、花費(fèi)大、效率較低，難以廣泛推廣應(yīng)用。“分子開(kāi)關(guān)”技術(shù)是通過(guò)對(duì)高保真DNA聚合酶的保真性進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)高保真 DNA聚合酶對(duì)錯(cuò)配堿基的識(shí)別，不僅僅局限于新生DNA分子或引物3’末端，而且也能識(shí)別 3’末端上游一至數(shù)個(gè)堿基距離的錯(cuò)配。根據(jù)高保真聚合酶的這一特征，可以認(rèn)為，高保真聚 合酶對(duì)DNA合成時(shí)的錯(cuò)配堿基存在一個(gè)“識(shí)別一逸漏一反復(fù)識(shí)別”的過(guò)程，當(dāng)引物與模板完 全配對(duì)時(shí)，則在聚合中心直接進(jìn)行聚合反應(yīng)；當(dāng)引物與模板不完全配對(duì)時(shí)，則送到酶解中心 進(jìn)行校正，其中一部分引物被校正后，即時(shí)送回聚合中心，繼續(xù)聚合反應(yīng)，而另一部分引物 由于不能被即時(shí)校正，引發(fā)聚合反應(yīng)的非成熟性終止。這種配對(duì)引物被延伸，不配對(duì)引物不 延伸的有或無(wú)的二元化效果，較好地滿足了點(diǎn)突變分析時(shí)對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行非此即彼的二元 化辨認(rèn)。故提出將耐外切酶消化的硫化磷酸修飾的堿基特異性引物與具3’ 一 5’外切酶活 性的高保真DNA聚合酶相結(jié)合，而構(gòu)成了受單堿基差異調(diào)控的納米級(jí)復(fù)合突變敏感性“分 子開(kāi)關(guān)”。該突變敏感性“分子開(kāi)關(guān)”已經(jīng)成功應(yīng)用于單基因遺傳病一神經(jīng)性耳聾GJB3中C — T突變點(diǎn)的檢測(cè)；對(duì)性染色體以及線粒體上的SNP位點(diǎn)的檢測(cè)取得成功，說(shuō)明“分子開(kāi) 關(guān)”突變檢測(cè)技術(shù)是一種簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)實(shí)用的突變檢測(cè)方法。本專利運(yùn)用突變敏感性“分子開(kāi) 關(guān)”突變檢測(cè)技術(shù)，建立了苯丙酮尿癥PAH基因的7個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，以期應(yīng)用 于苯丙酮尿癥的產(chǎn)前診斷，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因7個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的試劑盒及其PCR擴(kuò) 增方法，目的是建立引起中國(guó)人群苯丙酮尿癥的PAH基因的7個(gè)熱點(diǎn)突變的檢測(cè)方法，該檢 測(cè)結(jié)果用于判斷高危胎兒是否攜帶PAH基因突變。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的第一種技術(shù)方案是一種檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基 因七個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的試劑盒，所述試劑盒包括檢測(cè)R111X、IVS-4_1、Y204C、R243Q、W326X、 Y356X和R413P七個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的七組引物中的至少一組；第一組所述檢測(cè)RlllX熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物RlllX M 5， -ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTCAA-3，；正常模板配對(duì)引物RlllX N 5， -ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTCGA-3，；共同上游或下游引物RlllX C 5， -TGCCCCACCTCCTGCCACTT-3，；其中，所述突變模板配對(duì)引物RlllX M和正常模板配對(duì)引物RlllX N的3’端 的-3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的-2位堿基經(jīng)鎖核酸化 (LNA)修飾；第二組所述檢測(cè)IVS-4-1熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物IVS-4-1 M 5， -CAGGTGTCTCTTTTCTCCTAAC-3，；正常模板配對(duì)引物IVS-4-1 N 5， -CAGGTGTCTCTTTTCTCCTAGC-3，；共同上游或下游引物IVS-4-1 C 5’ -TTCCATCCTCAACTGGATGA-3’ ；其中，所述突變模板配對(duì)引物IVS-4-1 M和正常模板配對(duì)引物IVS-4-1 N的3’ 端的_3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的-2位堿基經(jīng)鎖核酸化 (LNA)修飾；第三組所述檢測(cè)Y204C熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物Y204C M 5’ -GTATAAAACCCATGCTTGCTGA-3’ ；正常模板配對(duì)引物Y204C N 5’ -GTATAAAACCCATGCTTGCTAA-3‘；共同上游或下游引物Y204C C 5’ -CTGATGTGGACTTACTCTGCAGG-3’ ；
6
其中，所述突變模板配對(duì)引物Y204C M和正常模板配對(duì)引物Y204C N的3’端 的-3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的-2位堿基經(jīng)鎖核酸化 (LNA)修飾；第四組所述檢測(cè)R243Q熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物R243Q M :5，-GCACTGGTTTCCGCCTCCAT-3，；正常模板配對(duì)引物R243Q N :5，-GCACTGGTTTCCGCCTCCGT-3，；共同上游或下游引物R243Q C 5，-TGTGGACCAGCCAGCAATGAAC-CCAAACCTCATTCTTGC AGCAGG-3'；其中，所述突變模板配對(duì)引物R243Q M和正常模板配對(duì)引物R243Q N的3’端 的-3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的-2位堿基經(jīng)鎖核酸化 (LNA)修飾；第五組所述檢測(cè)W326X熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物W326X M 5， -CTTTCCATTCCAGATTTACTAC-3，；正常模板配對(duì)引物W326X N 5， -CTTTCCATTCCAGATTTACTGC-3，；共同上游或下游引物W326XC 5’ -GAAGGTCATACCTGTAATTCACCA-3’ ；其中，所述突變模板配對(duì)引物W326X M和正常模板配對(duì)引物W326X N的3’端 的-3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的-2位堿基經(jīng)鎖核酸化 (LNA)修飾；第六組所述檢測(cè)Y356X熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物Y356X M 5’ -AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCATA-3’ ；正常模板配對(duì)引物Y356X N 5’ -AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCAGA-3’ ；共同上游或下游引物Y356X C 5’ -CTGTGATGTAGAAGGAATCGGGGTG-3’ ；其中，所述突變模板配對(duì)引物Y356X M和正常模板配對(duì)引物Y356X N的3’端 的-3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的-2位堿基經(jīng)鎖核酸化 (LNA)修飾；第七組所述檢測(cè)R413P熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物R413P M 5’ -TACCTCGGCCCTTCTCAGTTCCG-3，；正常模板配對(duì)引物R413P N 5’ -TACCTCGGCCCTTCTCAGTTCGG-3，；共同上游或下游引物R413P C 5’ -AACATGGCAGTGACAGACCAAGT-3’ ；其中，所述突變模板配對(duì)引物R413P M和正常模板配對(duì)引物R413P N的3’端的_3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的-2位堿基經(jīng)鎖核酸化 (LNA)修飾。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的第一種技術(shù)方案是一種采用權(quán)利要求1所述的 試劑盒檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因七個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增方法，(1)針對(duì)不同突變位點(diǎn)的檢測(cè)，PCR擴(kuò)增采用權(quán)利要求書1所列的七組引物中的至 少一組；(2) PCR擴(kuò)增由預(yù)變性和30-40次擴(kuò)增溫度循環(huán)組成，循環(huán)條件為預(yù)變性溫度為94°C 98 °C ；變性溫度為94°C 98 °C ；退火溫度為55°C 65°C ；延伸溫度為68°C 72°C。1、上述技術(shù)方案中所述引物(primer)是PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)中重要的 組成部分，它是一小段單鏈DNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)。2、上述方案中，在運(yùn)用PCR擴(kuò)增方法時(shí)，將以上所列針對(duì)不同突變位點(diǎn)的一組引 物中，突變模板配對(duì)引物與共同上游或下游引物為一對(duì)，正常模板配對(duì)引物與共同上游或 下游引物為另外一對(duì)，這兩對(duì)引物分別與該組引物對(duì)應(yīng)檢測(cè)位點(diǎn)基因型未知的DNA模板、4 種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性高保真Pfu DNA聚合酶、10% DMS0、去離子水混合構(gòu)成2 個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)體系；分別對(duì)2個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本發(fā)明工作原理是PCR擴(kuò)增的基本原理是模仿細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過(guò)程，以 DNA互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)靶DNA變性、引物與模板DNA (待擴(kuò)增DNA) —側(cè)的互補(bǔ)序 列退火復(fù)性、耐熱性DNA聚合酶催化引物延伸等過(guò)程的多次循環(huán)，產(chǎn)生待擴(kuò)增的特異性DNA 片段。一般反應(yīng)過(guò)程是1、將反應(yīng)體系加熱至90 98°C，模板雙鏈DNA變性成為兩條單鏈 DNA，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板；2、降溫至37 60°C，使兩種引物分別與模板DNA鏈的互 補(bǔ)序列退火復(fù)性；3、升溫至70 75°C，在耐熱性DNA聚合酶催化下，四種脫氧核糖核酸按 與模板堿基配對(duì)原則沿引物5’ 一 3’方向延伸，合成模板DNA鏈的互補(bǔ)鏈。重復(fù)以上過(guò)程， 就可以出現(xiàn)待擴(kuò)增的特異性DNA片段。由于上一次循環(huán)合成的兩條互補(bǔ)鏈均可作為下一次 循環(huán)的模板DNA鏈，所以每循環(huán)一次，底物DNA的拷貝數(shù)增加一倍，因此PCR經(jīng)過(guò)η次循環(huán) 后，理論上，待擴(kuò)增的特異性DNA片段可達(dá)到2η個(gè)拷貝數(shù)。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果1、本發(fā)明采用特殊設(shè)計(jì)并經(jīng)修飾的引物，其PCR產(chǎn)物特異性非常高。利用該基因 檢測(cè)方法，在完成PCR反應(yīng)和凝膠電泳后，可直接觀察產(chǎn)物條帶的有無(wú)來(lái)判斷苯丙酮尿癥 PAH基因7個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的基因型。2、本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，無(wú)需測(cè)序，一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室或檢驗(yàn)室就可操作。3、本發(fā)明建立了的檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因7個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的PCR方法可以和 熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)生物樣本臨床檢測(cè)的自動(dòng)化以及高通量，大大提高檢測(cè)準(zhǔn) 確性和效率。


附圖1為本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)PAH基因RlllX(CGA — TGA)位點(diǎn)得到的凝膠電泳圖(兩個(gè)樣本)。附圖2為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因RlllX (CGA — TGA)位點(diǎn)的測(cè)序圖 (附圖1的樣本一)。附圖3為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因RlllX (CGA — TGA)位點(diǎn)的測(cè)序圖 (附圖1的樣本二)。附圖4為本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)PAH基因IVS_4_1 (AG — AA)位點(diǎn)得到的 凝膠電泳圖(兩個(gè)樣本)。附圖5為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因IVS_4_1 (AG — AA)位點(diǎn)的測(cè)序圖 (附圖4的樣本一)。附圖6為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因IVS_4_1 (AG — AA)位點(diǎn)的測(cè)序圖 (附圖4的樣本二)。附圖7為本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)PAH基因Y204C(TAT — TGT)位點(diǎn)得到的 凝膠電泳圖(兩個(gè)樣本)。附圖8為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因Y204C (TAT — TGT)位點(diǎn)的測(cè)序圖 (附圖7的樣本一)。附圖9為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因Y204C (TAT — TGT)位點(diǎn)的測(cè)序圖 (附圖7的樣本二)。 附圖10為本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)PAH基因R243Q (CGA — CAA)位點(diǎn)得到的 凝膠電泳圖(兩個(gè)樣本)。附圖11為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因R243Q (CGA — CAA)位點(diǎn)的測(cè)序 圖(附圖10的樣本一)。附圖12為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因R243Q (CGA — CAA)位點(diǎn)的測(cè)序 圖(附圖10的樣本二)。附圖13為本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)PAH基因W326X (TGG — TAG)位點(diǎn)得到的 凝膠電泳圖(一個(gè)樣本)。附圖14為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因W326X (TGG — TAG)位點(diǎn)的測(cè)序 圖。附圖15為本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)PAH基因Y356X (TAC — TAA)位點(diǎn)得到的 凝膠電泳圖(兩個(gè)樣本)。附圖16為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因Y356X (TAC — TAA)位點(diǎn)的測(cè)序 圖(附圖15的樣本一)。附圖17為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因Y356X (TAC — TAA)位點(diǎn)的測(cè)序 圖(附圖15的樣本二)。附圖18為本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)PAH基因R413P (CGC — CCC)位點(diǎn)得到的 凝膠電泳圖(兩個(gè)樣本)。附圖19為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因R413P(CGC — CCC)位點(diǎn)的測(cè)序 圖(附圖18的樣本一)。附圖20為采用Sanger直接測(cè)序法檢測(cè)PAH基因R413P(CGC — CCC)位點(diǎn)的測(cè)序 圖(附圖18的樣本二)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一一種檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因七個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的試劑盒，所述試劑 盒由 10XPCR Buffer, dNTP (各 2· 5mM)、MgS04 (25福)、七組引物(各 IOmM)以及 Pfu DNA 聚合酶(5U/yl)組成。所述七組引物是指檢測(cè)Rll IX、IVS-4-1、Y204C、R243Q、W326X、Υ356Χ 和 R413P 七 個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的七組引物；第一組所述檢測(cè)RlllX熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物RlllX M 5，-ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTOAA-3，；正常模板配對(duì)引物RlllX N 5，-ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTOGA-3，；共同上游或下游引物RlllX C:5，-TGCCCCACCTCCTGCCACTT-3，；其中，所述突變模板配對(duì)引物RlllX M和正常模板配對(duì)引物RlllX N的3’端 的-3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾(標(biāo)有“*”處)；第二組所述檢測(cè)IVS-4-1熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物IVS-4-1 M 5， -CAGGTGTCTCTTTTCTCCTA*AC-3，；正常模板配對(duì)引物IVS-4-1 N 5 ’ -CAGGTGTCTCTTTTCTCCTA*GC-3 ’ ；共同上游或下游引物IVS-4-1 C 5，-TTCCATCCTCAACTGGATGA-3，；其中，所述突變模板配對(duì)引物IVS-4-1 M和正常模板配對(duì)引物IVS-4-1 N的3’端 的-3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾(標(biāo)有“*”處)；第三組所述檢測(cè)Y204C熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物Y204C M 5， -GTATAAAACCCATGCTTGCT*GA-3，；正常模板配對(duì)引物Y204C N 5， -GTATAAAACCCATGCTTGCT*AA-3，；共同上游或下游引物Y204C C 5’ -CTGATGTGGACTTACTCTGCAGG-3’ ；其中，所述突變模板配對(duì)引物Y204C M和正常模板配對(duì)引物Y204C N的3’端 的-3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾(標(biāo)有“*”處)；第四組所述檢測(cè)R243Q熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物R243Q M :5，-GCACTGGTTTCCGCCTCOAT-3，；正常模板配對(duì)引物R243Q N :5，-GCACTGGTTTCCGCCTCOGT-3，；共同上游或下游引物R243Q C 5，-TGTGGACCAGCCAGCAATGAAC-CCAAACCTCATTCTTGC
10AGCAGG-3'；其中，所述突變模板配對(duì)引物R243Q M和正常模板配對(duì)引物R243Q N的3’端 的-3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾(標(biāo)有“*”處)；第五組所述檢測(cè)W326X熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物W326X M 5， -CTTTCCATTCCAGATTTACT*AC -3，；正常模板配對(duì)引物W326X N 5， -CTTTCCATTCCAGATTTACT*GC -3，；共同上游或下游引物W326X C 5’ -GAAGGTCATACCTGTAATTCACCA-3’ ；其中，所述突變模板配對(duì)引物W326X M和正常模板配對(duì)引物W326X N的3’端 的-3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾(標(biāo)有“*”處)；第六組所述檢測(cè)Y356X熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物Y356X M 5’ -AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCA*TA-3，；正常模板配對(duì)引物Y356X N 5’ -AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCA*GA-3‘；共同上游或下游引物Y356X C 5， -CTGTGATGTAGAAGGAATCGGGGTG-3，；其中，所述突變模板配對(duì)引物Y356X M和正常模板配對(duì)引物Y356X N的3’端 的-3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾(標(biāo)有“*”處)；第七組所述檢測(cè)R413P熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物R413P M 5’ -TACCTCGGCCCTTCTCAGTTOCG-3’ ；正常模板配對(duì)引物R413P N 5’ -TACCTCGGCCCTTCTCAGTTOGG-3’ ；共同上游或下游引物R413P C 5， -AACATGGCAGTGACAGACCAAGT-3，；其中，所述突變模板配對(duì)引物R413P M和正常模板配對(duì)引物R413P N的3’端 的_3，-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾(標(biāo)有“*”處)。實(shí)施例二 一種采用實(shí)施例一所述的試劑盒檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因熱點(diǎn)突變位 點(diǎn)的PCR擴(kuò)增方法，包括下列步驟第一步準(zhǔn)備DNA(1)、從兩個(gè)人體中抽取血液得到兩個(gè)血液樣本。(2)、從兩個(gè)血液樣本中獲取DNA，即血液樣本中白細(xì)胞基因組DNA樣品準(zhǔn)備。試劑準(zhǔn)備抗凝劑每IOOml抗凝劑含0. 48g檸檬酸，1. 32g檸檬酸鈉，1. 47g葡萄糖。紅細(xì)胞裂解液:10mmol/LTris-HCl, pH 7. 6 ；5mmol/L MgCl2 ；
IOmmol/L NaCl ；白細(xì)胞裂解液:10mmol/LTris-HCl, pH 7. 6 ；10mmol/L EDTA (pH 8.0)50mmol/L NaCl10mg/ml 蛋白酶 K(Protease K) :10mg Protease K 溶于 Iml ddH20(雙蒸水)，分 裝，于-20°C保存。使用時(shí)，在4°C融化。從兩個(gè)血樣中獲取DNA過(guò)程①、取3ml新鮮血液加0. 5ml抗凝劑，混勻，1500rpm離心lOmin，小心吸取紅細(xì)胞 與血清之間呈一層乳白色的白細(xì)胞到一個(gè)新的15ml離心管。②、加IOml紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻，放置lOmin，并經(jīng)常對(duì)溶液進(jìn)行混勻以充分 裂解紅細(xì)胞。③、1500rpm離心lOmin，棄上清，沉淀為白細(xì)胞。④、加白細(xì)胞裂解液3ml，加50 μ 1 10% SDS和50 μ 1的10mg/ml蛋白酶K，50°C溫 育過(guò)夜。⑤、加等體積苯酚氯仿(1 1)，輕柔混勻15次，5000rpm離心lOmin，取上層水溶液。⑥、加60 μ 1 5mol/L NaCl，輕輕混勻。再加2/3體積異丙醇，輕輕混勻5min，可見(jiàn) 白色絮狀沉淀即基因組DNA。⑦、8000g離心 lOmin，棄上清。⑧、加體積濃度為70%的乙醇10ml，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，使管壁都充分接觸到乙醇。⑨、8000g離心5min，棄上清，室溫風(fēng)干明顯的乙醇液滴，不要使白色沉淀干透，否 則基因組DNA難溶于水。⑩、加無(wú)菌去離子水500 μ 1，置于搖床，室溫輕輕搖2h。之后，4°C過(guò)夜，使其充分 溶解。第二步對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增利用PCR擴(kuò)增方法，以第一步獲取的基因組DNA為模板，采用以下一組(兩對(duì))引 物(5’ 一 3’ )進(jìn)行擴(kuò)增①、突變模板配對(duì)引物對(duì)突變模板配對(duì)引物RlllX M :ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTC*AA共同上游或下游引物RlllX C :TGCCCCACCTCCTGCCACTT②、正常模板配對(duì)引物對(duì)正常模板配對(duì)引物RlllX N :ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTC*GA同上游或下游引物 Rl 1IX C TGCCCCACCTCCTGCCACTT注標(biāo)有“*”號(hào)處的磷酸二酯鍵經(jīng)磷硫酰修飾。具體操作為①、將上述兩對(duì)引物分別與獲取的兩個(gè)血液樣本的DNA、4種堿基、MgSO4溶液、PCR 反應(yīng)緩沖液、耐熱性Pfu DNA聚合酶、去離子水按一定比例混合構(gòu)成四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)體系， 具體見(jiàn)下表 ②、對(duì)上述反應(yīng)體系進(jìn)行PCR循環(huán)。PCR循環(huán)條件見(jiàn)下表 第三步苯丙酮尿癥PAH基因Rl IlX (CGA — TGA)突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)結(jié) 果分析采用凝膠電泳系統(tǒng)對(duì)上述DNA擴(kuò)增后的體系做凝膠電泳，得到的凝膠電泳圖如附 圖1所示，根據(jù)凝膠電泳對(duì)應(yīng)產(chǎn)物電泳條帶的有無(wú)來(lái)判斷PAH基因R111X(CGA —TGA)突變 位點(diǎn)的基因型。具體判斷方法如下(1)當(dāng)突變模板配對(duì)引物與共同上游或下游引物組成的一對(duì)引物對(duì)未知的DNA模 板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果觀察到目的電泳條帶則表明該未知DNA模板在相應(yīng)的檢測(cè)位點(diǎn)含有
突變型基因。(2)當(dāng)正常模板配對(duì)引物與共同上游或下游引物組成的一對(duì)引物對(duì)未知的DNA模 板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果觀察到目的電泳條帶則表明該未知DNA模板在相應(yīng)的檢測(cè)位點(diǎn)含有
正常型基因。(3)當(dāng)上述兩對(duì)引物都對(duì)未知DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增并通過(guò)電泳觀察到目的條帶，則 表明該檢測(cè)位點(diǎn)為雜合型；如果上述兩對(duì)引物只有其中一對(duì)引物的電泳結(jié)果觀察到目的產(chǎn) 物條帶，而另外一對(duì)引物沒(méi)有觀察到目的產(chǎn)物條帶，則表明該檢測(cè)位點(diǎn)為有目的條帶的一 對(duì)引物對(duì)應(yīng)的純合子，即純合突變或者純合正常。
從附圖1中可以看出，1號(hào)血液樣本在含有突變模板配對(duì)引物對(duì)和正常模板 配對(duì)引物對(duì)的兩個(gè)體系中擴(kuò)增均得到目的產(chǎn)物條帶(第1、3泳道)，則1號(hào)樣本的 RlllX(CGA-TGA)位點(diǎn)為雜合突變(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖2所示)。2號(hào)血液樣 本在含有突變模板配對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增沒(méi)有得到目的產(chǎn)物條帶(第2泳道)，而只在 含有正常模板配對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增得到目的產(chǎn)物條帶(第4泳道)，則2號(hào)樣本的 RlllX(CGA-TGA)位點(diǎn)為純合正常(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖3所示)。實(shí)施例三一種實(shí)施例一所述的試劑盒檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的 PCR擴(kuò)增方法實(shí)驗(yàn)條件及判斷方法均與實(shí)施例二相同，血樣樣本也為兩個(gè)(與實(shí)施例二均不 同)。采用以下一組(兩對(duì))引物檢測(cè)IVS-4-1 (AG — AA)突變位點(diǎn)，每對(duì)引物對(duì)應(yīng)的產(chǎn) 物片段大小為176bp，其核苷酸序列為(5’ 一 3’)①、突變模板配對(duì)引物對(duì)突變模板配對(duì)引物IVS-4-1M :CAGGTGTCTCTTTTCTCCTA*AC共同上游或下游引物IVS-4-1C TTCCATCCTCAACTGGATGA②、正常模板配對(duì)引物對(duì)正常模板配對(duì)引物IVS-4-1N :CAGGTGTCTCTTTTCTCCTA*GC共同上游或下游引物IVS-4-1C TTCCATCCTCAACTGGATGA注標(biāo)有“*”號(hào)處的磷酸二酯鍵經(jīng)磷硫酰修飾。得到的凝膠電泳圖如附圖4所示，從圖中可以看出，1號(hào)血液樣本在含有突變模板 配對(duì)引物對(duì)和正常模板配對(duì)引物對(duì)的兩個(gè)體系中擴(kuò)增均得到目的產(chǎn)物條帶(第1、3泳道)， 則1號(hào)血液樣本的IVS-4-1 (AG — AA)位點(diǎn)為雜合突變(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖5所 示)。2號(hào)血液樣本在含有突變模板配對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增沒(méi)有得到目的產(chǎn)物條帶(第2 泳道)，而只在含有正常模板配對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增得到目的產(chǎn)物條帶(第4泳道)，則 2號(hào)樣本的IVS-4-1 (AG — AA)位點(diǎn)為純合正常(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖6所示)。實(shí)施例四一種實(shí)施例一所述的試劑盒檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的 PCR擴(kuò)增方法實(shí)驗(yàn)條件及判斷方法均與實(shí)施例二相同，血樣樣本也為兩個(gè)(與前述實(shí)施例均不 同)。采用以下一組(兩對(duì))引物檢測(cè)Y204C(TAT — TGT)突變位點(diǎn)，每對(duì)引物對(duì)應(yīng)的產(chǎn) 物片段大小為134bp，其核苷酸序列為(5’ 一 3’)①、突變模板配對(duì)引物對(duì)突變模板配對(duì)引物Y204C M :GTATAAAACCCATGCTTGCT*GA共同上游或下游引物Y204C C :CTGATGTGGACTTACTCTGCAGG②、正常模板配對(duì)引物對(duì)正常模板配對(duì)引物Y204C N :GTATAAAACCCATGCTTGCT*AA共同上游或下游引物Y204C C CTGATGTGGACTTACTCTGCAGG注標(biāo)有“*”號(hào)處的磷酸二酯鍵經(jīng)磷硫酰修飾。得到的凝膠電泳圖如附圖7所示，從圖中可以看出，1號(hào)血液樣本在含有突變模板
14配對(duì)引物對(duì)和正常模板配對(duì)引物對(duì)的兩個(gè)體系中擴(kuò)增均得到目的產(chǎn)物條帶(第1、3泳道)， 則1號(hào)樣本的Y204C(TAT — TGT)位點(diǎn)為雜合突變(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖8所示)。 2號(hào)樣本在含有突變模板配對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增沒(méi)有得到目的產(chǎn)物條帶(第2泳道)，而 只在含有正常模板配對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增得到目的產(chǎn)物條帶(第4泳道)，則2號(hào)樣本的 Y204C(TAT — TGT)位點(diǎn)為純合正常(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖9所示)。實(shí)施例五一種實(shí)施例一所述的試劑盒檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的 PCR擴(kuò)增方法實(shí)驗(yàn)條件及判斷方法均與實(shí)施例二相同，血樣樣本也為兩個(gè)(與前述實(shí)施例均不 同)。采用以下一組(兩對(duì))引物檢測(cè)R243Q (CGA — CAA)突變位點(diǎn)，每對(duì)引物對(duì)應(yīng)的產(chǎn) 物片段大小為234bp，其核苷酸序列為(5’ 一 3’)①、突變模板配對(duì)引物對(duì)突變模板配對(duì)引物R243Q M :GCACTGGTTTCCGCCTCC*AT共同上游或下游引物R243QC :TGTGGACCAGCCAGCAATGAA_CCCAAACCTCATTCTTGCAGC AGG②、正常模板配對(duì)引物對(duì)正常模板配對(duì)引物R243Q N :GCACTGGTTTCCGCCTCC*GT共同上游或下游引物R243QC :TGTGGACCAGCCAGCAATGAA_CCCAAACCTCATTCTTGCAGC AGG注標(biāo)有“*”號(hào)處的磷酸二酯鍵經(jīng)磷硫酰修飾。得到的凝膠電泳圖如附圖10所示，從圖中可以看出，1號(hào)血液樣本在含有突變模 板配對(duì)引物對(duì)和正常模板配對(duì)引物對(duì)的兩個(gè)體系中擴(kuò)增均得到目的產(chǎn)物條帶(第1、3泳 道)，則1號(hào)樣本的R243Q(CGA —CAA)位點(diǎn)為雜合突變(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖11所 示)。2號(hào)樣本在含有突變模板配對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增沒(méi)有得到目的產(chǎn)物條帶(第2泳 道)，而只在含有正常模板配對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增得到目的產(chǎn)物條帶(第4泳道)，則2 號(hào)樣本的R243Q(CGA — CAA)位點(diǎn)為純合正常(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖12所示)。實(shí)施例六一種實(shí)施例一所述的試劑盒檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的 PCR擴(kuò)增方法實(shí)驗(yàn)條件及判斷方法均與實(shí)施例二相同，血樣樣本為一個(gè)(與前述實(shí)施例均不 同)。采用以下一組(兩對(duì))引物檢測(cè)W326X (TGG — TAG)突變位點(diǎn)，每對(duì)引物對(duì)應(yīng)的產(chǎn) 物片段大小為121bp，其核苷酸序列為(5’ 一 3’)①、突變模板配對(duì)引物對(duì)突變模板配對(duì)引物W326X M :CTTTCCATTCCAGATTTACT*AC共同上游或下游引物W326X C :GAAGGTCATACCTGTAATTCACCA②、正常模板配對(duì)引物對(duì)正常模板配對(duì)引物W326X N :CTTTCCATTCCAGATTTACT*GC共同上游或下游引物W326X C :GAAGGTCATACCTGTAATTCACCA注標(biāo)有“*”號(hào)處的磷酸二酯鍵經(jīng)磷硫酰修飾。
得到的凝膠電泳圖如附圖13所示，從圖中可以看出，血液樣本在含有突變模板配 對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增沒(méi)有得到目的產(chǎn)物條帶(右側(cè)泳道)，而只在含有正常模板配對(duì)引 物對(duì)的體系中擴(kuò)增得到目的產(chǎn)物條帶(左側(cè)泳道)，該血液樣本的W326X(TGG —TAG)位點(diǎn) 為純合正常(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖14所示)。實(shí)施例七一種實(shí)施例一所述的試劑盒檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的 PCR擴(kuò)增方法實(shí)驗(yàn)條件及判斷方法均與實(shí)施例二相同，血樣樣本也為兩個(gè)(與前述實(shí)施例均不 同)。采用以下一組(兩對(duì))引物檢測(cè)Y356X (TAC — TAA)突變位點(diǎn)，每對(duì)引物對(duì)應(yīng)的產(chǎn) 物片段大小為145bp，其核苷酸序列為(5’ 一 3’)①、突變模板配對(duì)引物對(duì)突變模板配對(duì)引物Y356X M :AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCA*TA共同上游或下游引物Y356X C CTGTGATGTAGAAGGAATCGGGGTG②、正常模板配對(duì)引物對(duì)正常模板配對(duì)引物Y356X N :AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCA*GA共同上游或下游引物Y356X C CTGTGATGTAGAAGGAATCGGGGTG注標(biāo)有“*”號(hào)處的磷酸二酯鍵經(jīng)磷硫酰修飾。得到的凝膠電泳圖如附圖15所示，從圖中可以看出，1號(hào)血液樣本在含有突變模 板配對(duì)引物對(duì)和正常模板配對(duì)引物對(duì)的兩個(gè)體系中擴(kuò)增均得到目的產(chǎn)物條帶(第1、3泳 道)，則1號(hào)樣本的Y356X (TAC — TAA)位點(diǎn)為雜合突變(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖16所 示)。2號(hào)血液樣本在含有突變模板配對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增沒(méi)有得到目的產(chǎn)物條帶(第2 泳道)，而只在含有正常模板配對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增得到目的產(chǎn)物條帶(第4泳道)，則 2號(hào)樣本的Y356X(TAC — TAA)位點(diǎn)為純合正常(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖17所示)。實(shí)施例八一種實(shí)施例一所述的試劑盒檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的 PCR擴(kuò)增方法實(shí)驗(yàn)條件及判斷方法均與實(shí)施例二相同，血樣樣本為一個(gè)(與前述實(shí)施例均不 同)。采用以下一組(兩對(duì))引物檢測(cè)R413P (CGC — CCC)突變位點(diǎn)，每對(duì)引物對(duì)應(yīng)的產(chǎn) 物片段大小為371bp，其核苷酸序列為(5’ 一 3’)①、突變模板配對(duì)引物對(duì)突變模板配對(duì)引物R413P M :TACCTCGGCCCTTCTCAGTTC*CG共同上游或下游引物R413P C AACATGGCAGTGACAGACCAAGT②、正常模板配對(duì)引物對(duì)正常模板配對(duì)引物R413P N :TACCTCGGCCCTTCTCAGTTC*GG共同上游或下游引物R413P C AACATGGCAGTGACAGACCAAGT注標(biāo)有“*”號(hào)處的磷酸二酯鍵經(jīng)磷硫酰修飾。得到的凝膠電泳圖如附圖18所示，從圖中可以看出，1號(hào)血液樣本在含有突變模 板配對(duì)引物對(duì)和正常模板配對(duì)引物對(duì)的兩個(gè)體系中擴(kuò)增均得到目的產(chǎn)物條帶(第1、3泳 道)，則1號(hào)樣本的R413P(CGC —CCC)位點(diǎn)為雜合突變(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖19所示)。2號(hào)樣本在含有突變模板配對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增沒(méi)有得到目的產(chǎn)物條帶(第2泳 道)，而只在含有正常模板配對(duì)引物對(duì)的體系中擴(kuò)增得到目的產(chǎn)物條帶(第4泳道)，則2 號(hào)樣本的R413P(CGC —CCC)位點(diǎn)為純合正常(該樣本的DNA測(cè)序圖如附圖20所示)。
上述實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人 士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明 精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因七個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括檢測(cè)R111X、IVS 4 1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P七個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的七組引物中的至少一組；第一組所述檢測(cè)R111X熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物R111X M5’ ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTCAA 3’；正常模板配對(duì)引物R111X N5’ ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTCGA 3’；共同上游或下游引物R111X C5’ TGCCCCACCTCCTGCCACTT 3’；其中，所述突變模板配對(duì)引物R111X M和正常模板配對(duì)引物R111X N的3’端的 3， 2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的 2位堿基經(jīng)鎖核酸化(LNA)修飾；第二組所述檢測(cè)IVS 4 1熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物IVS 4 1 M5’ CAGGTGTCTCTTTTCTCCTAAC 3’；正常模板配對(duì)引物IVS 4 1 N5’ CAGGTGTCTCTTTTCTCCTAGC 3’；共同上游或下游引物IVS 4 1 C5’ TTCCATCCTCAACTGGATGA 3’；其中，所述突變模板配對(duì)引物IVS 4 1 M和正常模板配對(duì)引物IVS 4 1 N的3’端的 3， 2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的 2位堿基經(jīng)鎖核酸化(LNA)修飾；第三組所述檢測(cè)Y204C熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物Y204C M5’ GTATAAAACCCATGCTTGCTGA 3’；正常模板配對(duì)引物Y204C N5’ GTATAAAACCCATGCTTGCTAA 3’；共同上游或下游引物Y204C C5’ CTGATGTGGACTTACTCTGCAGG 3’；其中，所述突變模板配對(duì)引物Y204C M和正常模板配對(duì)引物Y204C N的3’端的 3， 2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的 2位堿基經(jīng)鎖核酸化(LNA)修飾；第四組所述檢測(cè)R243Q熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物R243Q M5’ GCACTGGTTTCCGCCTCCAT 3’；正常模板配對(duì)引物R243Q N5’ GCACTGGTTTCCGCCTCCGT 3’；共同上游或下游引物R243Q C5’ TGTGGACCAGCCAGCAATGAACC CAAACCTCATTCTTGCAGCAGG 3’；其中，所述突變模板配對(duì)引物R243Q M和正常模板配對(duì)引物R243Q N的3’端的 3， 2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的 2位堿基經(jīng)鎖核酸化(LNA)修飾；第五組所述檢測(cè)W326X熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物W326X M5’ CTTTCCATTCCAGATTTACTAC 3’；正常模板配對(duì)引物W326X N5’ CTTTCCATTCCAGATTTACTGC 3’；共同上游或下游引物W326X C5’ GAAGGTCATACCTGTAATTCACCA 3’；其中，所述突變模板配對(duì)引物W326X M和正常模板配對(duì)引物W326X N的3’端的 3， 2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的 2位堿基經(jīng)鎖核酸化(LNA)修飾；第六組所述檢測(cè)Y356X熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物Y356X M5’ AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCATA 3’；正常模板配對(duì)引物Y356X N5’ AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCAGA 3’；共同上游或下游引物Y356X C5’ CTGTGATGTAGAAGGAATCGGGGTG 3’；其中，所述突變模板配對(duì)引物Y356X M和正常模板配對(duì)引物Y356X N的3’端的 3， 2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的 2位堿基經(jīng)鎖核酸化(LNA)修飾；第七組所述檢測(cè)R413P熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示突變模板配對(duì)引物R413P M5’ TACCTCGGCCCTTCTCAGTTCCG 3’；正常模板配對(duì)引物R413P N5’ TACCTCGGCCCTTCTCAGTTCGG 3’；共同上游或下游引物R413P C5’ AACATGGCAGTGACAGACCAAGT 3’；其中，所述突變模板配對(duì)引物R413P M和正常模板配對(duì)引物R413P N的3’端的 3， 2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾或者3’端的 2位堿基經(jīng)鎖核酸化(LNA)修飾。
2. 一種采用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因七個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的 PCR擴(kuò)增方法，其特征在于(1)針對(duì)不同突變位點(diǎn)的檢測(cè)，PCR擴(kuò)增采用權(quán)利要求書1所列的七組引物中的至少一組；(2)PCR擴(kuò)增由預(yù)變性和30-40次擴(kuò)增溫度循環(huán)組成，循環(huán)條件為 預(yù)變性溫度為94°C 98 °C ；變性溫度為94°C 98°C ； 退火溫度為55°C 65°C ； 延伸溫度為68°C 72°C。
全文摘要
一種檢測(cè)苯丙酮尿癥PAH基因7個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的試劑盒及其PCR擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是經(jīng)耐3’→5’核酸外切酶酶切修飾的突變檢測(cè)引物在高保真DNA聚合酶參與的PCR反應(yīng)中，其產(chǎn)物特異性非常高，可直接觀察凝膠電泳的產(chǎn)物條帶的有無(wú)來(lái)判斷PAH基因相應(yīng)突變位點(diǎn)的基因型。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，無(wú)需測(cè)序，一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室就可操作；本發(fā)明建立的方法和熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)生物樣本臨床檢測(cè)的自動(dòng)化以及高通量，大大提高檢測(cè)準(zhǔn)確性和效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101899518SQ20101023458
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者何曉輝, 李紅, 王進(jìn), 秦正紅, 陳瑛 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué);蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司