專利名稱：人源s100a4蛋白的基因優(yōu)化與高效表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人源S100A4基因優(yōu)化與高效表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
S100A4蛋白是以非共價(jià)鍵結(jié)合二聚體存在于細(xì)胞內(nèi)，而以共價(jià)結(jié)合二聚體分泌到細(xì)胞外。推測Ca2+結(jié)合后可導(dǎo)致S100A4蛋白構(gòu)型改變，在表面暴露出新的結(jié)合位點(diǎn)，從而可與一系列靶標(biāo)結(jié)合。胞外基質(zhì)中的S100A4蛋白是一種單體和二聚體共存的狀態(tài)，其比例受Ca2+結(jié)合程度的影響；胞內(nèi)S100A4蛋白的同源二聚體和異源二聚體形式也是同時(shí)存在。 因此，從S100A4蛋白可形成同源二聚體、異源二聚體、寡聚體的多種形式來看，其結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的可變性，這可能也是它在體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本研究采用全基因合成法合成S100A4基因。并根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，利用 Condonopt密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化從GenBank中檢索到的S100A4基因序列，全部選用偏好密碼子，設(shè)計(jì)合成S100A4序列的引物。為了便于蛋白表達(dá)，在兩端引物分別引入Nde I和)(h0 I的酶切位點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種制備并優(yōu)化人源S100A4基因的方法。本發(fā)明優(yōu)化后的S100A4序列與原序列相比，34個(gè)堿基被替換，序列中所有的 E. coli低頻密碼子均被高頻密碼子所替換。本發(fā)明還公開了上述人源S100A4蛋白分子的基因制備方法。該方法包括如下步驟(1)S100A4序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成(2) PCR合成優(yōu)化后S100A4序列并與表達(dá)載體pET3h連接，構(gòu)建pET3h_S100A4 表達(dá)載體；(3)在大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)中進(jìn)行高效表達(dá)；制備人源S100A4蛋白編碼基因可以按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行，優(yōu)選PCR法。優(yōu)選 PCR重疊引物延伸法(黃培堂等譯，J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，pl091-1113)。所述表達(dá)載體可以是常規(guī)的原核系統(tǒng)表達(dá)載體，如商業(yè)PET系列載體和國內(nèi)廣泛使用的PET3M載體，優(yōu)選PET3M載體。大腸桿菌可以是適合原核系統(tǒng)表達(dá)的配套大腸桿菌，當(dāng)使用PET類載體時(shí)，宿主菌優(yōu)選大腸桿菌E. coli BL2KDE3)系列；當(dāng)使用 PBV220載體時(shí)宿主菌可選擇多種商業(yè)上提供的大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌E. coli DH5 α。本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子設(shè)計(jì)并合成S100A4序列的引物，PCR擴(kuò)增優(yōu)化后的S100A4序列克隆至表達(dá)載體pET3h上，經(jīng)測序完全正確，再將其轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)。在 IPTG誘導(dǎo)下，在大腸桿菌E. coli BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。


圖1為人源S100A4序列中被替換的堿基示意2為合成人源S100A4基因的PCR產(chǎn)物1. 5%瓊脂糖凝膠電泳。圖3為菌落PCR法鑒定陽性pET3h_S100A4克隆圖4為表達(dá)載體pET3h_S100A4的酶切鑒定圖5為測序結(jié)果與優(yōu)化后的人源S100A4序列的比較
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明1.材料與方法1.1 材料1. 1. 1質(zhì)粒與菌株表達(dá)載體ρΕΤ3^ι、大腸桿菌E. coli BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)保存。1.1.2酶及主要試劑膠同收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自美國OMEGA公司；Nde I.Xho I.Taq DNA聚合酶及T4DNA Ligase均購自Takara公司；Pfu DNA聚合酶、DL2000核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物購自北京TIANGEN公司，低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物購自TaKaRa公司。1. 2 方法1. 2. 1人源S100A4序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成①根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，利用Condonopt密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化從GenBank中檢索到的人源S100A4基因序列；
②全部選用偏好密碼子，設(shè)計(jì)合成人源S100A4序列的引物(表1)。
③為了便于蛋白表達(dá)，在兩端引物分別引入了Nde I和B10 I的酶切位點(diǎn)。 表1人源S100A4的全合成引物
Table 1. oligonucleotide primers with mutual overlaps
名稱
引物序列
1 2
3
4
5
6
7
8
j0432f一 104trxr
atggcgtgcccgctggaaaaagccctggatgtgatggtgtccaccttccacaaat 55 gttcagtttgaatttgtcaccttctttgcccgagtatttgtggaaggtggacacc 55 acaaattcaaactgaacaaatctgaactgaaagaactgctgacccgcgaact 52 gcagcttcatcggtgcgtttgcccaggaagctcggcagttcgcgggtcagcagtt 55 cgcaccgatgaagctgctttccagaaactgatgagcaacctggacagcaaccgcg 55 ggaagacacagtattcctggaagtccacttcgttgtcgcggttgctgtccaggtt 55 ggaatactgtgtcttcctgtcctgcatcgccatgatgtgtaacgaattctttg 53 tcattttttgcgcggctgtttatccgggaagccttcaaagaattcgttacac 52
gcIcatatgIgcgtgcccgctggaaaaag1. 2. 2PCR合成優(yōu)化后S100A4序列以設(shè)計(jì)的引物互為模板，采用分段合成法合成S100A4基因。即以1、2號引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，膠回收產(chǎn)物為片段1 ；以7、8號引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收產(chǎn)物為片段2;以3、4、5 和6號引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收產(chǎn)物為片段3。1 8號引物濃度均為5ymol/L。然后，分別將片段1、2和3稀釋10倍后，互為模板，PCR擴(kuò)增后膠同收PCR產(chǎn)物，即為人源S100A4
基因全長。1. 2. 3 表達(dá)載體 pET3h_S100A4 的構(gòu)建①以人源S100A4基因全長片段為模板，10432F和104TRXR為引物，以pfu酶進(jìn)行 PCR擴(kuò)增引入酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C 30s, 52. 5°C 20s, 72°C 40s，10 個(gè)循環(huán)；94°C 30s, 60°C 20s, 72°C 40s，25 個(gè)循環(huán)，再 72°C延伸 5min。②1. 5%凝膠電泳后回收純化PCR產(chǎn)物。③用Nde I, Xho I雙酶切S100A4的PCR產(chǎn)物，所得產(chǎn)物與經(jīng)同樣酶切的pET3h 質(zhì)粒用T4DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)中，PCR篩選陽性
轉(zhuǎn)化子。2.結(jié)果2. 1優(yōu)化后的S100A4序列優(yōu)化后的序列與原序列相比，共34個(gè)堿基被替換，序列中所有的E. coli低頻密碼子均被高頻密碼子所替換(圖1)。2. 2合成序列的PCR結(jié)果優(yōu)化后S100A4序列大小為306bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，在 300-350bp之間的位置出現(xiàn)一特異性條帶，與理論值大小相符。(圖2)2. 3表達(dá)載體pET3h_S100A4的酶切鑒定挑取轉(zhuǎn)化子菌落，10432F和104TR)(R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中1_5號泳道有約 306bp片段擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3)。以Nde I和Xho I雙酶切表達(dá)載體pET3h_S100A4，1_5號泳道在約306bp大小有一條帶(圖4)，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。2. 4S100A4合成序列的測序結(jié)果由測序結(jié)果看出，合成的S100A4序列與優(yōu)化后的S100A4序列一致，無點(diǎn)突變和移碼突變等。這表明，成功構(gòu)建了表達(dá)載體pET3h-S100A4。(圖5)
權(quán)利要求
1.權(quán)利要求1所述的人源S100A4蛋白的基因優(yōu)化與高效表達(dá)，其特征在于包括如下步驟(1)人源S100A4序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成①根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，利用Condonopt密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化從GenBank中檢索到的S100A4基因序列；②全部選用偏好密碼子，設(shè)計(jì)合成S100A4序列的引物。③為了便于蛋白表達(dá)，在兩端引物分別引入了Nde I和B10 I的酶切位點(diǎn)。(2)PCR合成優(yōu)化后S100A4序列 PCR法合成。(3)表達(dá)載體pET3h-S100A4的構(gòu)建①以人源S100A4基因全長片段為模板，以pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增引入酶切位點(diǎn)。②用NdeI, Xho I雙酶切S100A4純化后的PCR產(chǎn)物，所得產(chǎn)物與pET3h質(zhì)粒連接并轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主大腸桿菌E. coli BL2KDE3)中，PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子。(4)在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行高效表達(dá)①將陽性單克隆菌，接種于5mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37°C，160r/m過夜培養(yǎng)。②次日將過夜培養(yǎng)的菌液按1 50的比例重新轉(zhuǎn)接400mL的LB(含Amp)培養(yǎng)基中。 30°C條件下，160rpm振蕩培養(yǎng)池后，加入lmol/L的IPTG溶液1. aiil，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4- 后，以8000rpm收集菌體，用PH為7. 4，0. 2mol/L PB溶液重懸菌體后加入一定量的EDTA溶液，進(jìn)行超聲破碎菌體。超聲破碎條件功率200W，超聲處理30s，間隔20s，循環(huán)50次。③破碎后，4°C8000rpm離心lOmin，分別收集上清和沉淀。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人源S100A4蛋白的基因優(yōu)化與高效表達(dá)的方法。本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，通過設(shè)計(jì)并合成優(yōu)化人源S100A4序列的引物，以設(shè)計(jì)的引物互為模板，PCR擴(kuò)增獲得了能高效表達(dá)的優(yōu)化人源S100A4基因，并與表達(dá)載體連接，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。
文檔編號C12N15/12GK102337269SQ20101023458
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者佘曉俊, 劉子泉, 劉洪濤, 安改紅, 崔博, 張娜, 徐傳香, 王天輝, 王德剛, 陳學(xué)偉, 陳昀贇 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所