專利名稱：利用核酸酶反應進行dna單堿基突變顏色檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用核酸酶反應進行DNA單堿基突變顏色檢測的方法，屬于納米 生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
研究表明單堿基突變(SNP)與多種疾病的發(fā)生和藥物反應具有直接的相關(guān)性。在 數(shù)量龐大的DNA堿基序列中準確檢測極少數(shù)基因的變異對重大疾病的預防、早期診斷、基 因損壞研究以及制藥等重要領(lǐng)域都非常重要。迫切需要能夠進行SNP靈敏檢測的技術(shù)，單 堿基突變檢測的選擇性(也就是完全互補靶標與單堿基突變靶標的檢測信號的差異)是 SNP檢測技術(shù)最重要的指標。該技術(shù)對單堿基突變的選擇性越高，出現(xiàn)假陰性或假陽性的幾 率就越低，在復雜生物樣本和低濃度樣本中檢出目標基因的可能性就越高。因此，提高和設 計具有高單基因突變選擇性的基因檢測技術(shù)一直以來都是生物檢測技術(shù)研究最重要研究 領(lǐng)域之一。目前提高單堿基突變檢測的選擇性的方法可以大致可劃分為兩大類基于選擇性 酶反應的SNP檢測方法和基于探針工程化設計的SNP檢測方法。基于選擇性酶反應的SNP檢測方法主要依靠核酸消化酶(Nucleases)或連接酶 (Ligases)對DNA結(jié)構(gòu)的選擇性來實現(xiàn)單堿基突變的檢測。這類方法的SNP選擇性比較高， 缺點是檢測操作相對復雜，一般是多步操作，經(jīng)常還需要分離與純化的步驟?；谔结樄こ袒O計的SNP檢測方法通過設計具有不同結(jié)構(gòu)的探針來提高普通 單條直線型探針的SNP選擇性，雖這類方法不需要使用酶，但操作和設計上仍然不夠簡單， 需要大量的條件優(yōu)化。比如基于毗鄰雜交技術(shù)(Stacking Hybridization)的二元探針 (Fu，D. J. ；et al Proc. Natl. Acad. ki. U. S. Α. 1995，92，10162-10166.)，這一技術(shù)利用了 短探針在通常雜交條件下不能夠與靶標雜交形成雙鏈DNA，但是如果其雜交的位置與雙鏈 DNA結(jié)構(gòu)相鄰，就可以在優(yōu)化的條件下與靶標雜交，但是存在單堿基突變的短探針仍然不能 與靶標雜交。由于使用短探針，這種方法可以大大減少高通量SNP檢測中檢測探針的數(shù)量， 從而減少DNA檢測芯片的探針密度。缺點是操作步驟仍然不夠簡單，包括兩次甚至多次的 需要嚴格控溫的雜交過程(由于短鏈探針在室溫下不能有效雜交)，每次雜交過程前后都 需要嚴格控制條件(鹽濃度、溫度、時間、成份等)的清洗步驟。再如化學修飾的探針，例如噻唑橙(thiazole orange)修飾的FIT (Forced Intercalation)探針(ChemBioChem，2005，6，69—77)禾口 BDF(Base Discriminating Fluorescent)探針(J. Am. Chem. Soc. 2004，126，4820-4827)，這些探針在沒有靶標存在的 時候產(chǎn)生微弱的熒光，但是在靶標存在的時候發(fā)射出強的熒光信號。但是這類探針SNP檢 測的專一性極大地依賴于錯配堿基對的序列、共軛位置和鏈接DNA鏈的長度，這就限制了 方法的通用性，也為定量檢測帶來了困難。構(gòu)相受限的探針是近年來發(fā)展起來的另一類探 針，比如Pseudoknot結(jié)構(gòu)和具有三段雙鏈DNA (triple-stem DNA)結(jié)構(gòu)的探針(Yi Xiao, et al. Angew. Chem. Intl. Ed. 2009，48，1-6)。這類探針檢測SNP時操作簡單，SNP的選擇性也可以與利用酶檢測SNP的選擇性相當，缺點是探針需要人為設計和優(yōu)化，很難推廣使用。就信號輸出的方式而言，目前熒光檢測和電化學檢測是最主要的信號輸出方式， 這就要求對探針進行熒光或電化學基團的修飾，探針的價格貴，而且需要昂貴的熒光檢測 設備或電化學檢測設備。其中電化學檢測還需要將探針組裝在電極上，步驟繁瑣，重復性 差。這些方法不能夠滿足基礎(chǔ)設施簡單的場合使用，因此非常需要研發(fā)不需要標記探針，也 不需要復雜檢測設備，而且操作簡單的SNP檢測方法。近些年來，納米金被廣泛用于生物傳感技術(shù)中，實現(xiàn)快速、靈敏、方便和經(jīng)濟的顏 色檢測。這些技術(shù)利用納米金表面等離子共振的光學性能，獨立存在的納米金是紅色的，而 聚集在一起的納米金是藍灰色或紫色的。這種顏色變化可以使可見光的吸收波長產(chǎn)生高達 300nm的移動。這種顏色變化可以直接用肉眼觀察，無需任何復雜設備，也可以使用光譜儀 進行定量檢測。現(xiàn)有的引起納米金的聚集的方法可以分為兩大類。第一類方法是檢測物作為交聯(lián) 劑將納米顆粒聯(lián)結(jié)在一起，從而引起聚集。如DNA誘導的通過顆粒間交聯(lián)造成的聚集方法。 這類方法需要將單鏈DNA，DNA酶，RNA酶或核酸適配體連接到納米材料的表面。實驗步驟 相對繁瑣，DNA, DNA酶，RNA酶或核酸適配體的用量大。第二類方法是非交聯(lián)的納米顆粒聚 集方法，這種方法利用納米顆粒在加入檢測物后穩(wěn)定性的降低。這種穩(wěn)定性的降低是由于 納米顆粒表面用于提高納米金穩(wěn)定性的DNA分子或ATP的破壞，取代或消耗；或者由于與未 修飾納米顆粒相互作用的溶液中可以穩(wěn)定納米顆粒的ATP或單鏈DNA的減少。這類方法大 多使用未修飾的納米金顆粒。使用未修飾納米金進行檢測的方法是目前所有檢測技術(shù)中最為簡單、便宜和快速 的檢測技術(shù)，目前該方法已經(jīng)用于包括對DNA、小分子和重金屬離子在內(nèi)的多類生物分子的 檢測。這類方法多是基于雙鏈DNA結(jié)構(gòu)比單鏈DNA穩(wěn)定納米金差這一現(xiàn)象。所報道的使用 未修飾納米金對DNA進行檢測的方法就是利用互補靶標可以與探針形成雙鏈DNA，而雙鏈 DNA不能夠很好地穩(wěn)定納米金，加入適量的鹽溶液之后，納米金聚集為藍色，當靶標不能夠 與探針雜交形成雙鏈DNA的，單鏈DNA能夠很好地穩(wěn)定納米金，加入相同量的鹽溶液之后， 納米金仍然保持紅色。因此可以用于DNA的檢測。(Huixiang Li，Lewis Rothberg Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，2004，vollOl, 14036-14039.)上述采用未修飾納米金進行 DNA 檢 測的方法存在著以下不足1)這種方法需要通過精確控溫、水解或者超聲處理，才能實現(xiàn)對單堿基突變的顏 色檢測。操作不夠簡單。2)從本質(zhì)上說還是利用完全互補靶標與單堿基突變靶標的解鏈溫度(Tm)的微小 差異(一般小于幾個攝氏度)來進行單堿基突變的檢測。這與傳統(tǒng)的依靠精確控溫和梯度 洗脫進行SNP檢測的方法類似，單堿基突變檢測的選擇性不高。尤其是對偏離中心位置的 突變位點，不易檢出。而且只能用于檢測較短長度的靶標，通常短于20bp。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中的問題，其目的在于提供一種利用核酸酶反應進行DNA單 堿基突變顏色檢測的方法。本發(fā)明所述的一種進行DNA單堿基突變顏色檢測的方法，其特征在于利用結(jié)構(gòu)4專一的核酸酶(以單鏈DNA專一的Sl核酸酶和雙鏈DNA專一的DSN核酸酶為例)，選擇性 地將單鏈或者雙鏈DNA降解為能夠更好穩(wěn)定納米金的單核苷酸(dNMP)和短鏈DNA，從而方 便地實現(xiàn)單堿基突變的顏色檢測，無需通過精確控溫、水解或者超聲處理。本發(fā)明的DNA單堿基突變顏色檢測方法，其特征在于該方法，如圖2所示，包括如下步驟(1)將完全互補靶標、單堿基突變靶標或不互 補靶標與探針按照等摩爾比混合在雜交緩沖溶液中，混合后的濃度在0. 1 μ Μ-50 μ M的范 圍內(nèi)；(2)加入適量的核酸酶(比如1-10υ/10μ ，比如圖2(A)所示S 1核酸酶，或者圖 2(B)所示DSN核酸酶，并在合適的溫度下保持一段時間(比如5-60min) ； (3)將反應溶液 與納米金溶液混合；反應溶液中核酸探針與納米金的摩爾比一般應大于100 1;(4)加入 適量的鹽溶液(比如含氯化鈉的磷酸鹽溶液)，通過溶液顏色變化來半定量進行DNA檢測， 也可以由紫外可見吸收(520nm和650nm)定量分析。比如，當使用單鏈DNA專一的Sl核酸 酶時(圖2(A))，完全互補的雙鏈DNA不能夠被Sl核酸酶分解，而存在單堿基突變的雙鏈 DNA能夠被Sl核酸酶分解，生成能夠很好穩(wěn)定納米金的單核苷酸dNMP，因此，在加入相同鹽 溶液時，含有完全互補雙鏈DNA的納米金溶液聚集成藍色，而含有單堿基突變DNA的納米金 溶液保持紅色。相反地，當使用雙鏈DNA專一的DSN核酸酶(圖2(B))時，完全互補的雙鏈 DNA能夠被DSN核酸酶分解，生成能夠很好穩(wěn)定納米金的單核苷酸dNMP，而存在單堿基突變 的雙鏈DNA不能夠被DSN核酸酶分解，因此，在加入相同鹽溶液時，含有完全互補雙鏈DNA 的納米金溶液保持紅色，而含有單堿基突變DNA的納米金溶液聚集成藍色。本發(fā)明利用核酸酶反應進行DNA單堿基突變顏色檢測的方法，具有如下的技術(shù)效 果1、利用核酸酶反應進行DNA單堿基突變顏色檢測，無需通過精確控溫、水解或者 超聲處理，可以直接觀察到完全互補靶標與單堿基突變靶標和不互補靶標之間的明顯顏色 差別。2、利用核酸酶反應進行DNA單堿基突變顏色檢測，由于核酸酶的高度的結(jié)構(gòu)選擇 性，以及單核苷酸(dNMP)和短鏈DNA更好的穩(wěn)定納米金的能力，將DNA單堿基突變的納米 金顏色檢測方法的選擇性大幅提高。以Sl核酸酶為例可以檢測靶標中任何突變位點。3、在現(xiàn)有技術(shù)中，利用單鏈DNA能夠比雙鏈DNA更好地穩(wěn)定未修飾納米金，實現(xiàn)對 具體DNA序列的顏色檢測。能夠與探針雜交形成雙鏈DNA的，不能夠很好地穩(wěn)定納米金，加 入適量的鹽溶液之后，納米金聚集為藍色，而不能夠與探針雜交形成雙鏈DNA的，單鏈DNA 能夠很好地穩(wěn)定納米金，加入相同量的鹽溶液之后，納米金仍然保持紅色。這種進行DNA檢 測的方法需要通過精確控溫、水解或者超聲處理，利用完全互補靶標與單堿基突變靶標較 小的解鏈溫度(Tm)差異，實現(xiàn)對單堿基突變的顏色檢測，因此對單堿基突變檢測的選擇性 差，僅能檢測某些對Tm影響較大的突變位點，而且靶標的長度較短(一般小于20bp)。利用 核酸酶反應進行DNA單堿基突變顏色檢測，可以檢測出較長靶標(比如80bp)中的單堿基 突變，而且突變的位置既可以在接近端部，也可以在中間位置(詳見實施例8)。本發(fā)明涉及一種利用核酸酶反應進行DNA單堿基突變顏色檢測的方法。在該方法 中，當互補靶標或者單堿基突變靶標存在的時候，這些靶標與探針雜交形成雙鏈DNA。當不 互補靶標存在的時候，靶標與探針都保持單鏈DNA狀態(tài)。隨后加入體系中的具有結(jié)構(gòu)選擇 性的核酸酶，可以選擇性地降解雙鏈DNA、存在錯配的雙鏈DNA或者單鏈DNA，所產(chǎn)生的單核苷酸或者短鏈DNA能夠比未降解的雙鏈或單鏈DNA更好地穩(wěn)定未修飾納米金，在加入等量 的鹽溶液后，納米金呈現(xiàn)不同的穩(wěn)定性(顏色)，從而實現(xiàn)對單堿基突變的顏色檢測。本發(fā) 明的這種將結(jié)構(gòu)選擇性酶和未修飾納米金相結(jié)合的便捷的顏色檢測方法，還可以用來檢測 蛋白質(zhì)，酶，小分子，金屬離子和細菌等。本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點可以通過下面的實施例 來體現(xiàn)。需要指出的是，以下實施例僅用來舉例說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以進行各種各樣 的變化和修改。


圖1 (A)和⑶是本發(fā)明所使用的未修飾13nm金顆粒的不同放大倍數(shù)的透射電鏡 (TEM)圖像，(C)為紫外可見吸收譜。樣品在測量紫外可見吸收前稀釋10倍，特征吸收峰在 519nm。圖2 (A)和⑶是利用Sl核酸酶和DSN核酸酶反應進行DNA單堿基突變顏色檢測 的原理圖。圖3 (A)和⑶是納米金溶液與雙鏈DNA，單鏈DNA和dNMP混合后加入鹽溶液后的 紫外可見吸收光譜圖和納米金顏色反應的照片。圖4 (A)和(B)分別是本發(fā)明一個實施例中使用Sl核酸酶進行堿基突變的納米金 顏色檢測的紫外可見吸收光譜圖和納米金顏色反應的照片。納米金溶液與鹽孵育5min后 測定吸收光譜及拍攝照片。圖5(A) 圖5(H)分別是本發(fā)明一個實施例中使用0. 1 (A)，0. 2 (B)，0. 3 (C)， 0. 4 (D)，0. 5 (E)，0. 75 (F)，及IU μ L-1 (G)的Sl核酸酶進行單堿基突變(IM-AC)的納米金顏 色檢測的紫外可見吸收譜圖及鑒別因子與酶濃度的關(guān)系(H)。納米金溶液與鹽孵育aiiin后 測定吸收光譜。圖6㈧ 圖6(G)分別是本發(fā)明一個實施例中使用不同Sl核酸酶的反應時間 進行單堿基突變(IM-AC)的納米金顏色檢測的紫外可見吸收譜圖10min(A)，20min(B)， 25min (C), 30min (D), 35min (E), 45min (F)及鑒別因子與酶反應時間的關(guān)系圖(G)。納米金 溶液與鹽孵育anin后測定吸收光譜。圖7是本發(fā)明一個實施例中使用Sl核酸酶進行不同類型與不同位點單堿基突變 的納米金顏色檢測的紫外可見吸收譜圖。納米金溶液與鹽孵育anin后測定吸收光譜。圖8㈧和⑶是本發(fā)明一個實施例中使用Sl核酸酶進行不同類型與不同位點單 堿基突變的納米金顏色檢測的紫外可見吸收譜圖和納米金顏色反應的照片。納米金溶液與 鹽孵育5min后測定吸收光譜及拍攝照片。圖9 (A)和(B)本發(fā)明一個實施例中使用DSN進行堿基突變的納米金顏色檢測的 紫外可見吸收譜圖和納米金顏色反應的照片。納米金溶液與鹽孵育anin后測定吸收光譜 及拍攝照片。圖中‘‘ AuNP “ or" AuNPs “指金納米顆粒，通常是球形的，典型的尺寸為直徑 I-IOOnm.“Α”代表吸光值，“ λ ”代表波長。PM代表完全互補靶標，IMM代表單堿基突變靶標，N代表完全不互補靶標。
dNMP是單核苷酸dAMP，dGMP, dCMP和dTMP的混合物。
具體實施例方式下面通過實施例的描述，進一步闡述本發(fā)明的實質(zhì)性特點和顯著的進步。在具體描述實施例前先描述使用的材料、來源及制備方法HAuC14從ACROS ORGANIC購買。檸檬酸三鈉從國藥集團化學試劑公司購買。AMP, TMP，CMP，GMP從上?？笊锛夹g(shù)有限公司購買。DNS核酸酶從Evrogen JSC (Moscow, Russia)購買。Sl核酸酶從TaKaRa生物技術(shù)公司(大連)購買。所有DNA從TaKaRa (大連) 購買。13納米的金顆粒(AuNP)按照經(jīng)典的檸檬酸鈉還原法制，最終的濃度大約是12士 InM。 直接用于實施例2-9中。為敘述方便特將實施例2-9涉及的表1-4集中列出。本發(fā)明中使用的部分核酸探針序列列于表1，單堿基突變靶標的序列見表2-4 表 1
權(quán)利要求
1.一種利用核酸酶反應進行DNA單堿基突變顏色檢測的方法，其特征在于利用結(jié)構(gòu)專 一的核酸酶，選擇性地將單鏈或者雙鏈DNA降解為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定納米金的單核苷酸和短鏈DNA， 從而實現(xiàn)單堿基突變的顏色檢測，無需通過精確控溫、水解或者超聲處理；所述的專一的核 酸酶是指單鏈DNA的Sl核酸酶或雙鏈DNA的DSN核酸酶。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將完全互補靶標、單堿基突變靶標或不互補靶標與探針按照等摩爾比混合在雜交 緩沖溶液中，混合后的濃度在0. 1 μ Μ-50 μ M的范圍內(nèi)；(2)加入濃度為1-10U/10μ L的核酸酶，并在30°C溫度下保持5-60min時間；(3)將反應溶液與納米金溶液混合；反應溶液中核酸探針與納米金的摩爾比大于 100 1 ；(4)加入含氯化鈉的磷酸鹽溶液，通過溶液顏色變化來半定量進行DNA檢測，或由 520nm和650nm紫外可見吸收定量分析。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于當使用單鏈DNA專一的Sl核酸酶時，在加入 相同鹽溶液時，含有互補雙鏈DNA的納米金溶液為藍色，而含有單堿基突變的DNA的納米金 溶液為紅色。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于當使用雙鏈DNA專一的DSN核酸酶時，在加入 相同鹽溶液時，含有完全互補雙鏈DNA的納米金溶液為紅色，而含有單堿基突變DNA的納米 金溶液為藍色。
5.按權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的納米金溶液中納米金呈球形，直徑 為 l-100nm。
6.按權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于可選擇性地檢測合成靶標中任意位置的單堿基突變。
7.按權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于可以檢測出長達SObp的靶標中的單堿基突變。
8.按權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述單堿基突變的位置接近端部或在中間。
9.按權(quán)利2所述的方法，其特征在于步驟2中所保持的時間為30min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用核酸酶反應進行DNA單堿基突變顏色檢測的方法。其特征在于利用結(jié)構(gòu)專一的核酸酶(以單鏈DNA專一的S1核酸酶和雙鏈DNA專一的DSN核酸酶為例)，選擇性地將單鏈或者雙鏈DNA降解為能夠更好穩(wěn)定納米金的單核苷酸(dNMP)和短鏈DNA，從而方便地實現(xiàn)單堿基突變的顏色檢測，無需通過精確控溫、水解或者超聲處理。本發(fā)明提供的檢測方法可以高選擇性地檢測16bp合成靶標中任意位置的單堿基突變，可以檢測的靶標長度超過80bp，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK102041312SQ201010507529
公開日2011年5月4日 申請日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者劉美英, 婁新徽, 袁敏, 趙建龍 申請人:中國科學院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所