專利名稱：一種分泌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的大腸桿菌及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分泌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的大腸桿菌及其應用，屬于分子生物學 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TransglutaminaseEC 2. 3. 2. 13 全稱 R-glutaminyl-p印tide amine-Y-glutayle-transferase簡稱TGase)，又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或谷氨酰胺酰-肽 Y -谷氨酰胺?；D(zhuǎn)移酶，具有多種催化功能。它能夠通過催化蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)形成 ε-(Y-谷氨?；?賴氨酸共價鍵，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間發(fā)生交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸 之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解。具體包括(1)可催化蛋白質(zhì)以及肽鍵 中谷氨酰胺殘基的Y-羧酰胺基和伯胺之間的酰胺基轉(zhuǎn)移反應；( 當?shù)鞍踪|(zhì)中的賴氨酸 殘基的氨基作為?；荏w時，蛋白質(zhì)在分子內(nèi)或分子間形成谷氨?；?賴氨 酸共價鍵；C3)當不存在伯胺時，水會成為?；荏w，其結(jié)果是谷氨酰胺殘基脫去氨基生成 谷氨酸殘基(Yokoyama et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004,81 (3)，523-532)。TGase 具有的獨特催化功能，使其在許多領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。目前該酶廣泛用于食品工業(yè)，改 善各類食品蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和營養(yǎng)價值，應用范圍包括肉制品、水產(chǎn)品、乳制品、植物蛋 白制品、可食性包裝等。由于獨特的催化特性，TCase在一些非食品領(lǐng)域也具有很大的應用 前景，包括組織工程、紡織與皮毛加工、蛋白質(zhì)工程等。TCase廣泛分布于動物，植物及微生物中。第一種微生物來源的TGase在 Streptomycesmobaraensis中獲得。之后，又陸續(xù)分離到其它微生物來源的TGase。 Streptomyces來源的TCase是一種活性不依于Ca2+的酶；在液體培養(yǎng)基中它以酶原形式 (pro-TGase)分泌，通過切除N-端酶原區(qū)，產(chǎn)生活性TGase。一種金屬蛋白酶和一種氨肽酶 參與了 Sti^ptomyces來源的pro-TCase活化過程。本研究室最近的研究發(fā)現(xiàn)，除了金屬蛋 白酶，還有一種內(nèi)源的絲氨酸蛋白酶參與了吸水鏈霉菌來源的pro-TCase活化。這些研究 為其在異源系統(tǒng)中表達活性TCase提供了重要的基礎資料。itL TGase M^l^^iiT S. lividans,E. coli,Corynebactetium glutamicum, methylotropic yeasts.在這些表達系統(tǒng)中，由于大腸桿菌表達系統(tǒng)相對簡單，便宜并可高 密度發(fā)酵培養(yǎng)，TCase在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達受到廣泛關(guān)注?？傮w上，在大腸桿菌中表達 TGase的策略有三種(1)融合或未融合額外序列的TCase成熟酶在大腸桿菌中表達；(2) pro-TGase在大腸桿菌中表達后，在體外切割獲得活性TGase ； (3) pro-TGase與活化蛋白酶 在大腸桿菌中共表達。對于第一個表達策略，單獨表達成熟酶基因常常導致低水平的蛋白 質(zhì)表達，然而在TGase N-端融合可增加表達量的T7基因前導肽導致TGase包涵體的形成。 第二個表達策略的結(jié)果表明，S. mobaraensis來源的pro-TCase在pET表達系統(tǒng)中獲得了 可溶表達且表達量較高。重組的pro-TGase可被dispase、cath印sin B及trypsin等蛋白 酶進行活化(Marx et al. 2008. Enzyme. Microb. Technol. 42 (7)，568-575)。對于第三個策 略，最近研究人員建立了一個pro-TGase與活蛋白酶的共表達系統(tǒng)。通過這種策略，可以在胞內(nèi)利用PET表達系統(tǒng)直接表達具有活性的TGase。盡管pro-TGase已在大腸桿菌中成功 表達，但是pro-TCase在腸桿菌中分泌的策略還未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種分泌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的大腸桿菌，是將谷氨酰胺轉(zhuǎn)酶酶原 基因TG3989 (GenBankNO :HM231108)導入大腸桿菌BL21 (DE3)得到的重組大腸桿菌。所述分泌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的大腸桿菌的構(gòu)建方法1)根據(jù)包含吸水鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原基因的TG3989的序列 (GenBankNO. :HM231108)，設計PCR引物，以吸水鏈霉菌基因組DNA為模板，擴增谷氨酰胺轉(zhuǎn) 胺酶酶原基因ProTG ；幻谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原基因連接至大腸桿菌表達載體pET_22b(+)，Nco I-BamH 位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，命名為pETproTG，，并測序確證基因無突變， pET-22b(+)含有pelB信號肽，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原在此信號肽的作用下進行分泌；3)將谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的表達質(zhì)粒pETproTG轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到含 有表達質(zhì)粒的工程菌，命名為BL21 (DE3)/pETproTG。本發(fā)明還提供了一種大腸桿菌基因工程菌BL21 (DE3)/pETproTG用于生產(chǎn)谷氨酰 胺轉(zhuǎn)胺酶的方法。解決上述問題的技術(shù)方案為將蛋白酶添加于大腸桿菌基因工程菌BL21(DE3)/ pETproTG發(fā)酵液。大腸桿菌基因工程菌BL21(DE3)/pETproTG的發(fā)酵培養(yǎng)是將甘油管保存的菌液 100 μ 1接種至裝有25ml含100 μ g/ml羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中， 200rpm，37°C培養(yǎng)過夜得到種子培養(yǎng)液，按3%的接種量將種子培養(yǎng)液接種至裝有25ml含 100 μ g/ml羧芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中。為了提高基因工程菌對于谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的分泌，在上述TB液體培養(yǎng)基中 分別加入葡萄糖或乙醇，其中優(yōu)選加入0.5% (w/v)葡萄糖。所述蛋白酶可以為dispase，cath印sin B，胰蛋白酶等，在本表達體系中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原被分泌至胞外，可以在胞外進行酶原的活 化，在工業(yè)生產(chǎn)中具有較高的可行性。


圖1添加物對BL21 (DE3)/pETproTG分泌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的影響，0. 4mM IPTG 20°C誘導表達50h，取發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE檢測。M 蛋白質(zhì)標準分子量；1 無添加物；2 添加甘氨酸；3 添加葡萄糖；4 添加乙醇 圖2谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的活化過程SDS-PAGE分析。M 蛋白質(zhì)標準分子量；1-8 :0、5、10、15、30、60、120及18011^11活化圖3谷氨酰胺轉(zhuǎn)
胺酶酶原的活化反應過程中的酶活力
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明，下列實施例用于說明目的而非用于限制本
4發(fā)明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊 所述的條件進行操作。材料和試劑所用限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，PCR試劑，DNA Marker等均購于TaKaRa寶生物 公司；pET-22b(+)載體，JM109購自Novogen公司；引物，質(zhì)粒提取試劑盒購于上海生工生 物工程公司；電轉(zhuǎn)儀購自Bio-Rad公司；其他試劑均為國內(nèi)或國外購買的分析純試劑。吸水鏈霉菌Gti^ptomyces hygroscopicus)WSH03-13，巳在中國專利 ZL03152956. 9公開，授權(quán)公告號CN 1208452C,授權(quán)公告日2005年6月四日。實施例1分泌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的重組大腸桿菌的構(gòu)建根據(jù)包含吸水鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)酶酶原基因TG3989 (GenBankNO HM231108)，設計PCR引物，以吸水鏈霉菌基因組DNA為模板，擴增谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原 基因，并連接至大腸桿菌表達載體pET-22b(+) (Novogen)Nco I-BamH位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109 (Novogen)，提取質(zhì)粒，命名為pETproTG，，并測序確證基因無突變。pET_22b (+)含有 PelB信號肽，谷氨酰胺轉(zhuǎn)酶酶原在此信號肽的作用下進行分泌；將谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達 質(zhì)粒pETproTG轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到含有表達質(zhì)粒的工程菌，命名為BL21 (DE3) / pETproTGοPCR引物如下PTG 1 :5’ -ATATGACCATGGCCAGCGGCG GCGACG-3’PTG2 :5’ -GAATTCGGATCCTTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3’PCR反應條件PCR反應條件50μ 1反應體系，95°C變性lmin，65°C退火30s，72°C 延伸1. 5min, 35個反應循環(huán)。實施例2培養(yǎng)大腸桿菌BL21 (DE3) /pETproTG分泌酶原1.將甘油管保存的BL21(DE3)/pETproTG菌液100 μ 1接種至裝有25ml含100 μ g/ ml羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)過夜得到種子培養(yǎng) 液；2.按3%的接種量將種子培養(yǎng)液接種至裝有25ml含100 μ g/ml羧芐青霉素的TB 液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37°C培養(yǎng)0D_至1. O ；3.加入終濃度為0. 4mM IPTG，降溫至20°C培養(yǎng)50h ；取發(fā)酵液IOOOOrpm離心lOmin，取上清液進行SDS-PAGE分析(圖1)，發(fā)酵上清液 含有大量的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶原(pro-TCase，43. 6kDa)。實施例3提高大腸桿菌BL21 (DE3) /pETproTG酶原表達量培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基組成同實施例2，在TB液體培養(yǎng)基中按終濃度0. 5%分別添 加甘氨酸、葡萄糖以及乙醇，取上清液進行SDS-PAGE分析，發(fā)酵上清液谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶原 含量提高，其中，添加0. 5% (w/v)葡萄糖的效果最好(圖1)。實施例4應用大腸桿菌BL21 (DE3) /pETproTG生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶a.添加4ul活化蛋白酶dispase (上海生工)溶液(2. %ig/ml，^Ucas/ml)至 200ul上述添加葡萄糖的發(fā)酵上清液，37°C反應池。b.于0、5、10、15、30、60、120及180min移取活化應液樣品。IOul樣品與 SDS-PAGE5X上樣緩沖液以1 4比例混合，用于SDS-PAGE檢測。40ul樣品直接用于酶活力檢測。結(jié)果如圖2、圖3所示，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原6kDa)在30min內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化為谷 氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(37. 8kDa)，相應檢測到活化反應液中到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活力隨時間的上升， 最高活力達到4. 5U/ml。活化反應持續(xù)池未檢測到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的持續(xù)降解，酶活力達 到最高值后未發(fā)生明顯下降。雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。序列表<110>江南大學<120> 一種分泌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的大腸桿菌及其應用<160>2<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>27<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>根據(jù)基因序列設計用于擴增<400>1atatgaccat ggccagcggc ggcgacg27<210>2<211>36<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>根據(jù)基因序列設計用于擴增<400>2gaattcggat ccttacgacc agccctgctt cacctc 3權(quán)利要求
1.一種分泌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的大腸桿菌，是將吸水鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)酶酶 原基因?qū)氪竽c桿菌得到的基因工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述大腸桿菌，是將吸水鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)酶酶原基因?qū)?大腸桿菌BL21(DE3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述大腸桿菌，是將吸水鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)酶酶原基因連 接至大腸桿菌表達載體pET-22b (+)，得到表達質(zhì)粒pETproTG，將pETproTG轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述大腸桿菌，其特征在于，構(gòu)建方法如下1)根據(jù)包含吸水鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原基因的TG3989的序列，設計PCR引 物，以吸水鏈霉菌基因組DNA為模板，擴增谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原基因proTG ；2)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原基因連接至大腸桿菌表達載體pET-22b(+)，NcoI-BamH位點， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，命名為pETproTG.，并測序確證基因無突變，pET-22b(+)含 有pelB信號肽，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原在此信號肽的作用下進行分泌；3)將谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的表達質(zhì)粒pETproTG轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得到含有表 達質(zhì)粒的工程菌。
5.一種促進權(quán)利要求1所述大腸桿菌分泌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的方法，其特征在于， 在液體培養(yǎng)基中加入葡萄糖或乙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，在液體培養(yǎng)基中加入0.5%的葡萄糖。
7.一種應用權(quán)利要求1所述大腸桿菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶方法，其特征在于，將蛋白 酶添加于重組菌的發(fā)酵液中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述大腸桿菌的應用，其特征在于，所述蛋白酶為dispase， cathepsin B或月夷蛋白Si。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分泌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的大腸桿菌及其應用，屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。是將谷氨酰胺轉(zhuǎn)酶酶原基因TG3989(GenBank NOHM231108)導入大腸桿菌BL21(DE3)得到的重組大腸桿菌，在本表達體系中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原被分泌至胞外，可以在胞外進行酶原的活化，為谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種新方法。
文檔編號C12N9/10GK102120978SQ20101058154
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者劉松, 堵國成, 張東旭, 陳堅 申請人:江南大學