專利名稱：誘導(dǎo)性多能干細胞的制備方法以及用于制備誘導(dǎo)性多能干細胞的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及誘導(dǎo)性多能干細胞的制備方法以及用于制備誘導(dǎo)性多能干細胞的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
胚胎干細胞來源于早期胚胎的內(nèi)細胞團，在體外培養(yǎng)中能夠自我更新、保持多能性并具有向三個胚層細胞分化的能力。隨著1981年小鼠胚胎干細胞和1998年人的胚胎干細胞的建系成功[1，2]，再生醫(yī)學(xué)的研究真正地拉開了序幕。胚胎干細胞的應(yīng)用前景主要是用于移植治療，以胚胎干細胞作為起始細胞，通過體外培養(yǎng)及定向分化，可以為臨床治療提供大量的組織和器官的移植材料。通過對于胚胎干細胞自我更新和定向分化機制的研究， 許多特異性的細胞類型(例如，神經(jīng)細胞、心肌細胞等)已經(jīng)具備了成熟的分化方法的檢測標(biāo)準(zhǔn)，這些研究為帕金森氏病、老年癡呆癥、心肌損傷、糖尿病、肝硬化等疾病的治療帶來了希望。然而，胚胎干細胞真正從體外研究到進入臨床應(yīng)用還面臨許多技術(shù)和倫理問題，比如，如何獲得無免疫排斥的胚胎干細胞？如何獲得病人自身的胚胎干細胞？等等。2006年，Yamanaka實驗室首先報道可以利用過表達0ct4、Sox2、Klf4和c_Myc四種轉(zhuǎn)錄因子使小鼠的成纖維細胞逆分化成具有胚胎干細胞特性的細胞，并將其命名為誘導(dǎo)性多能干細胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCells) [3]。在這篇發(fā)表在《Cell》 雜志上的文章中，研究人員最初是選取了 M個與胚胎干細胞信號調(diào)控相關(guān)的基因作為候選基因，以逆轉(zhuǎn)錄病毒為基因轉(zhuǎn)染載體，用混合有多種不同基因的病毒感染小鼠成纖維細胞，最終以細胞形態(tài)學(xué)特征、胚胎干細胞特定基因的表達以及畸胎瘤的形成等指標(biāo)作為iPS 細胞多能性的鑒定指標(biāo)。他們在實驗中最終將M個候選基因減少到0ct4、Sox2、Klf4和 c-Myc這四個轉(zhuǎn)錄因子。雖然在這篇文章中，研究人員最終沒有得到嵌合體小鼠，但是直接從已分化的細胞得到干細胞為胚胎干細胞領(lǐng)域甚至生命科學(xué)領(lǐng)域都帶來了概念性的革新。 iPS細胞誘導(dǎo)技術(shù)的出現(xiàn)也引起了人們對其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的極大關(guān)注，因為我們可以病人的體細胞為來源得到病人特異的iPS細胞，這種iPS細胞又可以分化為具有功能的細胞、組織和器官，用于疾病治療。這樣的應(yīng)用方式可以避免免疫相容性和倫理問題。2007年，三個不同的實驗室均發(fā)表文章報道獲得了具有種系嵌合能力的小鼠iPS 細胞W-6]。在此之后，也陸續(xù)有實驗室報道獲得了人的iPS細胞[7，8]。2009年，研究人員首次利用iPS細胞通過四倍體囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，證明了 iPS細胞具有真正的全能性[9]。iPS作為誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細胞的一種技術(shù)，在臨床疾病治療方面的應(yīng)用價值是巨大的，因為它不像傳統(tǒng)的核移植或者細胞融合等獲取干細胞的方式那樣需要人的卵子或人的胚胎干細胞，并且它由成體細胞重編程為干細胞的特性避免了免疫排斥使得自體移植變得更加可行；另一方面，iPS對于干細胞自我更新機制的研究、干細胞信號調(diào)控的研究以及很多疾病的研究都有很大意義。但是，iPS細胞的應(yīng)用仍然有兩大問題，安全問題和誘導(dǎo)效率問題。在生物安全問題方面，最初實驗體系中過表達的外源基因中含有兩個癌基因(c-Myc和Klf-4)，并且外源基因的導(dǎo)入方式是逆轉(zhuǎn)錄病毒，病毒在基因組中有多個拷貝的插入也會導(dǎo)致基因突變及癌變。因此，研究人員正在致力于優(yōu)化iPS技術(shù)使其應(yīng)用的安全性增加，例如，減少轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目[10，11]，或者使用非整合到基因組的基因轉(zhuǎn)染方法[12]，還有直接添加透膜的轉(zhuǎn)錄因子蛋白的形式進行重編程[13]。但是，這些方法會導(dǎo)致iPS細胞的誘導(dǎo)效率更加低下， 目前iPS細胞的形成效率一般都低于1 %，這對iPS細胞的發(fā)展和應(yīng)用造成了巨大障礙。因此，尋找能夠提高iPS細胞誘導(dǎo)效率的培養(yǎng)條件、方法或小分子化合物，對推動iPS細胞的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用將有巨大幫助。

發(fā)明內(nèi)容
因此，針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明人進行了廣泛和深入的研究，最終完成本發(fā)明。為了提高iPS細胞的誘導(dǎo)效率，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)性多能干細胞的制備方法，該方法包括以下步驟步驟1，將一個或多個干細胞多能性因子導(dǎo)入體細胞；步驟2，使用添加了鋰鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟1中導(dǎo)入了干細胞多能性因子的體細胞；以及步驟3，鑒定誘導(dǎo)性多能干細胞克隆。優(yōu)選地，所述方法進一步包括將報告基因?qū)塍w細胞以此通過報告基因來指示所述誘導(dǎo)性多能干細胞的產(chǎn)生及其產(chǎn)生效率。且更優(yōu)選地，所述報告基因為0ct4-GFP或 Nanog-GFP，且更優(yōu)選為 0ct4_GFP。優(yōu)選地，在步驟1中，將所述干細胞多能性因子的cDNA以病毒感染方式導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細胞。優(yōu)選地，在步驟1中，所述干細胞多能性因子可選自0ct4、Sox2、Soxl、Klf4、Klf2、 Klf5、Nanog、c-Myc、L-Myc、N-Myc、Lir^8和Esrrb中。且更優(yōu)選地，所述干細胞多能性因子可包括0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc。且更優(yōu)選地，所述干細胞多能性因子可包括0ct4、Sox2 和 Klf4。優(yōu)選地，在步驟2中，所述鋰鹽包括氯化鋰、碳酸鋰、醋酸鋰、溴化鋰、門東氨酸鋰、 Y亞麻酸鋰、肝素鋰、硫酸鋰、硝酸鋰等所有包含鋰離子的化學(xué)品。更優(yōu)選地，在步驟2中，所述鋰鹽為氯化鋰。優(yōu)選地，所述鋰鹽的工作濃度為0. l_40mM。更優(yōu)選地，所述鋰鹽的工作濃度為 0. 5-20mM。且更優(yōu)選地，所述鋰鹽的工作濃度為Ι-lOmM。且更優(yōu)選地，所述鋰鹽的工作濃度為5-10mM。且最優(yōu)選地，所述鋰鹽的工作濃度為10mM。步驟2中使用的培養(yǎng)基可為添加有15%胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子 (LIF)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和β-巰基乙醇的DMEM(DulbCC0’ s Modified Eagle's Medium) (mES培養(yǎng)基)以及添加有15%替代血清、lOOOU/mL白血病抑制因子(LIF)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和β-巰基乙醇的Knockout DMEM (KSR 培養(yǎng)基)。優(yōu)選地，所述步驟2具體包括如下步驟
將步驟1中制備的導(dǎo)入了四因子(0ct4、Sox2、Klf4和c_Myc)或三因子(0ct4、 Sox2、Klf4)的小鼠胚胎成纖維細胞在第二天消化并接種到飼養(yǎng)層細胞中使用mES培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在第三天使用添加了鋰鹽的mES培養(yǎng)基培養(yǎng)，在第六天換為添加鋰鹽的KSR培養(yǎng)基培養(yǎng)，在第八天換為KSR培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；以及挑選具有良好干細胞形態(tài)或0ct4_GFP陽性的克隆進行傳代。“良好干細胞樣形態(tài)”是指與小鼠干細胞形態(tài)相似的克隆?！?ct4_GFP陽性”是指轉(zhuǎn)基因0ct4-GFP報告基因陽性的克隆。0ct4是干細胞特異性基因，其表達比較真實地表征小鼠胚胎成纖維細胞已經(jīng)重編程為干細胞。步驟3中，鑒定誘導(dǎo)多能性干細胞克隆包括AP染色，內(nèi)源0ct4表達檢測，熒光定量PCR檢測多能性標(biāo)志物表達水平，外源病毒基因的沉默，畸胎瘤的形成，嵌合體的形成， 以及是否有生殖系傳遞(germ line transmission)。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，所述體細胞來自哺乳動物的體細胞。且更優(yōu)選地，所述哺乳動物選自小鼠、大鼠、兔、豬、羊、牛、猴或人。此外，本發(fā)明提供了一種用于制備誘導(dǎo)性多能干細胞的培養(yǎng)基，其進一步包含鋰
Τττ . ο優(yōu)選地，所述鋰鹽包括氯化鋰、碳酸鋰、醋酸鋰、溴化鋰、門東氨酸鋰、Y亞麻酸鋰、 肝素鋰、硫酸鋰、硝酸鋰等所有包含鋰離子的化學(xué)品。且更優(yōu)選地，所述鋰鹽為氯化鋰。優(yōu)選地，所述鋰鹽的工作濃度為0. l_40mM。更優(yōu)選地，所述鋰鹽的工作濃度為 0. 5-20mM。且更優(yōu)選地，所述鋰鹽的工作濃度為Ι-lOmM。且更優(yōu)選地，所述鋰鹽的工作濃度為5-10mM。且最優(yōu)選地，所述鋰鹽的工作濃度為10mM。鋰鹽濃度超過40mM時，長期培養(yǎng)將導(dǎo)致細胞死亡；鋰鹽濃度低于0. ImM時，不能顯著增加iPS細胞的誘導(dǎo)效率。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為添加了鋰鹽的mES培養(yǎng)基和添加了鋰鹽的KSR培養(yǎng)基。本發(fā)明的鋰鹽能高效產(chǎn)生iPS細胞。流式細胞計數(shù)實驗計算效率顯示添加鋰鹽的實驗組比對照組提高約5倍(轉(zhuǎn)導(dǎo)四因子實驗)和60倍(轉(zhuǎn)導(dǎo)3因子實驗)。在iPS誘導(dǎo)過程中添加鋰鹽也可以加快重編程的過程，添加鋰鹽的實驗組在感染第8天即可檢測到 0ct4-GFP陽性的克隆，而對照組一般要到10天以后才能檢測到0ct4-GFP陽性的克隆。利用鋰鹽誘導(dǎo)的iPS細胞具有良好的全能性，轉(zhuǎn)導(dǎo)四因子或三因子的iPS克隆均能形成嵌合體小鼠，其中四因子iPS的嵌合體小鼠實現(xiàn)了生殖系傳遞，并產(chǎn)下后代。本發(fā)明提供的高效誘導(dǎo)iPS細胞的方法對推動iPS的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用有著重要的意義。


圖1為利用添加鋰鹽的干細胞培養(yǎng)基促進iPS細胞的形成的實驗操作流程圖。圖2顯示了添加鋰鹽的干細胞培養(yǎng)基提高四因子(0Ct4、SOX2、Klf4、C-MyC)誘導(dǎo) iPS效率并加快iPS誘導(dǎo)進程。A為顯示感染后第10天96孔板內(nèi)一孔的代表性圖像的照片，其中，IOmM LiCl處理的孔中出現(xiàn)較多的Oct-GFP陽性克??；B為顯示對Oct-GFP陽性克隆的統(tǒng)計數(shù)據(jù)的圖，在感染后第8天，LiCl處理的孔中即能觀察到10個左右Oct-GFP陽性克隆，而對照孔則沒有 ’第10天，LiCl處理的孔中的Oct-GFP陽性克隆數(shù)能達到20個左右。*，ρ < 0. 05 ；C為顯示添加不同濃度LiCl的Oct-GFP陽性克隆的統(tǒng)計數(shù)據(jù)的圖，可以觀察到明顯的劑量效應(yīng)，其中LiCl濃度為IOmM時效果最為顯著。*，ρ < 0. 05圖3顯示了流式細胞儀檢測鋰鹽提高四因子誘導(dǎo)iPS效率。A為顯示了感染后第 12天細胞消化后經(jīng)流式細胞儀分析的GFP陽性細胞百分比的圖；B為顯示了 3次獨立實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)的圖。#*，p<0.001。圖4顯示了添加鋰鹽的干細胞培養(yǎng)基提高三因子(0ct4、Sox2、Klf4)誘導(dǎo)iPS效率。A為顯示了對Oct-GFP陽性克隆的統(tǒng)計數(shù)據(jù)的圖，在感染后第14天，5mM或IOmM的LiCl 均能顯著提高iPS誘導(dǎo)效率；B為顯示了感染后第16天細胞消化后流式細胞儀檢測GFP陽性細胞百分比的圖。*，ρ < 0. 05，**，ρ < 0. 01。圖5顯示了堿性磷酸酶染色及免疫熒光染色。上半部分顯示在iPS細胞系具有類似胚胎干細胞的形態(tài)，強烈的表達0ct4-GFP，堿性磷酸酶染色呈陽性并且均一。下半部分為干細胞特異性蛋白Nanog和SSEA-I的免疫熒光染色，iPS細胞系表達這兩種干細胞特異性蛋白。圖6顯示了熒光定量PCR檢測干細胞特異基因的表達和外源病毒基因的沉默。A、 以小鼠胚胎成纖維細胞為陰性對照，小鼠胚胎干細胞系E14細胞為陽性對照，檢測干細胞特異基因的表達。所有四因子及三因子加鋰鹽誘導(dǎo)的iPS克隆均高表達干細胞特異基因， 包括內(nèi)源0ct4、內(nèi)源S0X2、Nan0g和Rexl ；B、以病毒感染后4天的小鼠胚胎成纖維細胞為陽性對照，ES細胞為陰性對照，檢測外源病毒基因的沉默。所有四因子及三因子加鋰鹽誘導(dǎo)的iPS克隆均顯示良好的外源病毒基因沉默。圖7顯示了四因子加鋰鹽誘導(dǎo)的iPS形成畸胎瘤實驗。由組織結(jié)構(gòu)判斷，iPS細胞系能夠分化形成三個胚層的特有組織，左側(cè)為屬于外胚層的表皮樣結(jié)構(gòu)，中間為屬于中胚層的軟骨樣及肌肉樣結(jié)構(gòu)，右側(cè)為屬于內(nèi)胚層的消化道管腔結(jié)構(gòu)。圖8顯示了四因子加鋰鹽誘導(dǎo)的iPS細胞形成嵌合體及生殖系傳遞實驗。左側(cè)為 4因子加鋰鹽處理得到的iPS細胞系具有生殖系傳遞能力，右側(cè)為3因子加鋰鹽處理得到的 iPS細胞系具有嵌合體形成能力。
具體實施例方式定義和技術(shù)除非另外指明，本發(fā)明的實驗使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)和重組DNA傳統(tǒng)技術(shù)，其屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍。參見例如，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，分子克隆實驗指南，第三版 0002) ；Current Protocols inMolecular Biology (F. Μ. Ausubel 等人編著(1987))；叢書 Methods inEnzymology(酶學(xué)方法)(Academic Press, Inc.)； PCR2 :A Practical Approach (PCR 實驗方法)(Μ. J. MacPherson, B. D. Hames 禾口 G. R. Taylor 編著，(1995)) ；Antibodies, A Laboratory Manual and Animal Cell Culture(抗體實驗手冊及動物細胞培養(yǎng))(R. I. Freshney編著，(1987)) ；Handbook of StemCells (干細胞手冊)，卷2(W. French等人編著)。除非另外說明，本文中所用的術(shù)語均具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的含義，為了便于理解本發(fā)明，將本文中使用的一些術(shù)語進行了下述定義。本文所述的“誘導(dǎo)性多能干細胞”(iPS細胞)是這樣的細胞，其來源是體細胞通過導(dǎo)入干細胞多能性因子在體外重編程而成。這樣的細胞在胚胎干細胞(EQ培養(yǎng)條件下，與 ES細胞在細胞形態(tài)、生長特性、特異性基因表達、DNA甲基化方式等性質(zhì)均與小鼠ES細胞非常相似，而且在畸胎瘤形成、嵌合體動物形成和生殖系傳遞等方面也與小鼠ES細胞非常相似。本文所述的“誘導(dǎo)體細胞重編程的干細胞多能性因子”是維持干細胞多能性的關(guān)鍵因子，通過向體細胞導(dǎo)入這些因子可以誘導(dǎo)體細胞重編程為干細胞。已有多篇文獻報導(dǎo)了多個這樣的可以誘導(dǎo)重編程的因子[14-18]。優(yōu)選地，所述的多能性因子包括選自0ct4、 Sox2 (或 Soxl)、Klf4 (或 Klf2 或 Klf5)、Nanog、c_Myc (或 L-Myc 或 N-Myc)、Lin28 及 Esrrb 中的一個或多個。上述干細胞多能性因子可以根據(jù)需要來源于任何物種，優(yōu)選為小鼠的干細胞多能性因子。本文所述的“誘導(dǎo)重編程”(有時也僅被簡化為“誘導(dǎo)”)是指將體細胞去分化為多能性干細胞的過程。優(yōu)選地，通過將維持干細胞多能性所需的多能性因子的cDNA導(dǎo)入體細胞可以誘導(dǎo)體細胞去分化為多能干細胞。其中，優(yōu)選地，所述的多能性因子包括選自0ct4、 Sox2 (或 Soxl)、Klf4 (或 Klf2 或 Klf5)、Nanog、c_Myc (或 L-Myc 或 N-Myc)、Lin28 及 Esrrb 中的一個或多個。將所述干細胞多能性因子的cDNA導(dǎo)入體細胞的方法可采用多種方法，包括病毒感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、粒子轟擊、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入表達、穿膜蛋白、藥物誘導(dǎo)等的各種將DNA轉(zhuǎn)入細胞的方法。優(yōu)選地，使用包含cDNA的病毒載體進行轉(zhuǎn)染。所述病毒載體包括慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等多種病毒載體。優(yōu)選地，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(PMX載體)。本文所述的“培養(yǎng)基”可為添加有15%胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子 (LIF)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和β-巰基乙醇的DMEM(DulbCC0’ s Modified Eagle's Medium) (mES培養(yǎng)基)以及添加有15%替代血清、lOOOU/mL白血病抑制因子(LIF)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和β-巰基乙醇的Knockout DMEM (KSR 培養(yǎng)基)。本發(fā)明所述的“報告基因”是指能夠指示細胞已經(jīng)轉(zhuǎn)變到類似胚胎干細胞的階段， 包括利用轉(zhuǎn)基因或同源重組手段加入一段熒光蛋白序列或針對抗生素的抗性基因序列，這段序列處于胚胎干細胞特異表達的一些基因的啟動子控制下，故而可以在細胞到達類似胚胎干細胞狀態(tài)時激活這段熒光蛋白或抗性基因的表達，從而使這個細胞具有某些可以被檢測的特征。本實施例中使用的小鼠胚胎成纖維細胞為0G2(0ct4-GFP+勺細胞，分離自純合 0G2(0ct4-GFP+/+)雄鼠與1 母鼠交配產(chǎn)生的13. 5天的胚胎。本發(fā)明所述的檢測細胞多能性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括AP染色，細胞熒光染色，熒光定量PCR分析干細胞特異基因表達及病毒基因的沉默，分析體內(nèi)分化為畸胎瘤的能力，嵌合鼠的形成及生殖系的傳遞。實施例下列實施例舉例說明了發(fā)明人的標(biāo)準(zhǔn)實驗室實踐，用于示范本發(fā)明的模式，而不應(yīng)將本發(fā)明理解為限定于這些實施例的范圍。本發(fā)明中所用技術(shù)概述除了特別說明，本說明書中提及的各種物質(zhì)均購自Invitrogen。反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)以及產(chǎn)生iPS細胞的實驗過程如下
從Addgene公司購置包含小鼠0ct4、Sox2、Klf4、c_Myc的cDNA的反轉(zhuǎn)錄病毒載體 (pMXs)。使用Fugene HD (羅氏)按其產(chǎn)品說明書進行轉(zhuǎn)染至PlatE細胞以產(chǎn)生病毒，48小時后收集病毒上清液并且過濾，補充1，5_ 二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(8mg/ L)后感染小鼠胚胎成纖維細胞。添加病毒上清液的當(dāng)天被定義為第0天。將病毒感染后的成纖維細胞培養(yǎng)在mES培養(yǎng)基中，在感染后14-18天G因子感染實驗)或20-M天(3因子感染實驗)挑取iPS集落，這是基于Oct-GFP的表達和典型的干細胞形態(tài)來挑取的。重編稈效率的定量的實驗過稈如下用于計算重編程效率的主要方法是計數(shù)Oct-GFP陽性克隆1.利用流式細胞儀對四因子感染后10-12天或三因子感染后14-16天的iPS細胞測定Oct-GFP陽性的細胞比例； 2.在原孔中直接用熒光顯微鏡計數(shù)Oct-GFP陽性克隆數(shù)。iPS細胞的鑒定實驗過稈如下進行堿性磷酸酶染色、干細胞標(biāo)記蛋白熒光染色、鑒定多能性基因的表達、病毒基因的沉默、畸胎瘤的形成、嵌合體的形成及生殖系傳遞[19，20]。實施例1 添加了鋰鹽的干細胞培養(yǎng)基能促進四因子誘導(dǎo)的iPS的形成a.將四因子(0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的病毒以等體積混合，感染到6孔板的一孔中共計18萬個0G2小鼠胚胎成纖維細胞中，在371、5%0)2的環(huán)境中培養(yǎng)在添加了 10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。以加入病毒當(dāng)天為第0天，第2天將細胞消化并重懸于mES培養(yǎng)基中，并種在預(yù)先種滿飼養(yǎng)層細胞(放射線處理的小鼠胚胎成纖維細胞)的96孔板中， 每孔5000個細胞，第3天開始使用添加了不同濃度LiCl (0. 6mM, 1. 2mM, 2. 5mM, 5mM, IOmM, 20mM和40mM)的mES培養(yǎng)基，第6天開始換為添加了不同濃度LiCl (0. 6mM, 1. 2mM, 2. 5mM, 5mM, IOmM, 20mM和40mM)的KSR培養(yǎng)基，第8天開始再換為KSR培養(yǎng)基培養(yǎng)，整個過程如圖 1所示。b.使用如a所述的方法，從第8天開始，每天在倒置熒光顯微鏡下觀察并計數(shù) Oct-GFP陽性克隆數(shù)，同時使用熒光顯微鏡拍照。圖2A為第10天時96孔板中代表性的圖片，可以看到IOmM LiCl處理的孔相對于不處理的孔，有更多Oct-GFP陽性的克隆。圖2B 是對Oct-GFP陽性克隆的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。第8天時，對照孔幾乎看不到Oct-GFP陽性克隆，而 IOmM LiCl處理的孔可以觀察到10個左右克隆。而到第10天，IOmM LiCl處理的孔可以觀察到20個左右克隆，其效率是對照組的5-6倍。圖2C是用不同濃度的LiCl (0. 6mM, 1. 2mM, 2. 5mM, 5mM, IOmM, 20mM和40mM)處理之后出現(xiàn)的陽性克隆數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)曲線，其中LiCl濃度為IOmM時效果最為顯著。c.使用如a所述的方法，在第12天消化細胞，利用流式細胞儀檢測Oct-GFP陽性的細胞比例。圖3A為代表性的流式數(shù)據(jù)圖；圖:3B是對3次實驗的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，顯示在四因子誘導(dǎo)條件下，IOmM LiCl處理可提高iPS誘導(dǎo)效率5_6倍。實施例2 添加鋰鹽的干細胞培養(yǎng)基能促進三因子誘導(dǎo)的iPS的形成a.將三因子(0ct4、Sox2、Klf4)的病毒以等體積混合，感染到6孔板的一孔中共計18萬個0G2小鼠胚胎成纖維細胞中，在37°C、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。以加入病毒當(dāng)天為第O天，第2天將細胞消化并重懸于mES培養(yǎng)基中，并種在預(yù)先種滿飼養(yǎng)層細胞(放射線處理的小鼠胚胎成纖維細胞)的96孔板中，每孔 5000個細胞，第3天開始使用添加了不同濃度LiCl (0. 6mM, 1. 2mM, 2. 5mM, 5mM, IOmM, 20mM和40mM)的mES培養(yǎng)基，第6天開始換為添加了不同濃度LiCl (0. 6mM, 1. 2mM, 2. 5mM, 5mM, IOmM, 20mM和40mM)的KSR培養(yǎng)基，第8天開始再換為KSR培養(yǎng)基培養(yǎng)，整個過程如圖1所
7J\ οb.使用如a所述的方法，從第12天開始，每天在倒置熒光顯微鏡下觀察并計數(shù) Oct-GFP陽性克隆數(shù)，同時使用熒光顯微鏡拍照。如圖4A所示，第14天時，與對照組相比， 添加5mM或IOmM LiCl均能夠顯著提高iPS效率，其中添加IOmM LiCl的效率可增加7倍
左右οc.使用如a所述的方法，在第16天消化細胞，利用流式細胞儀檢測Oct-GFP陽性的細胞比例。如圖4B所示，對照組的Oct-GFP陽性的細胞比例僅為0. 24%。而添加IOmM LiCl的實驗組的Oct-GFP陽性細胞比例可達到14. 5%，增加了近60倍。實施例3 添加鋰鹽得到的iPS細胞系具有多能性a.如上所述，用 4 因子(0ct4、Sox2、Klf4、c_Myc)或 3 因子(0ct4、Sox2、Klf4) 感染小鼠胚胎成纖維細胞，在添加LiCl的干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，感染后14天G因子)或 20天(3因子)，根據(jù)克隆形態(tài)及熒光表達挑取具有代表意義的克隆團，經(jīng)過傳代后形成均勻的iPS細胞系。b.對于挑選出來的iPS細胞系進行形態(tài)觀察，并進行干細胞特異性蛋白的染色。 如圖5所示，iPS細胞系具有類似胚胎干細胞的特征形態(tài)，強烈表達Oct-GFP的綠色熒光， 并且堿性磷酸酶(AP)呈陽性。使用針對干細胞特征蛋白的抗體對iPS細胞進行免疫熒光染色，結(jié)果表明iPS細胞系均表達干細胞特異性蛋白Nanog和SSEA-1。c.在提取RNA之前，利用差速貼壁法去除滋養(yǎng)層細胞，使用Trizol (Invitrogen公司)試劑，按照制造商說明提取iPS細胞的總RNA。用I^rimeScriptTM試劑盒(Takara公司)進行逆轉(zhuǎn)錄，并使用JumpMartTMTaq ReadyMix 試劑盒(Sigma公司)，Mx 3000P熒光定量PCR儀(ABI公司)進行Real-Time PCR分析。所有上述PCR條件均使用常規(guī)PCR條件，按照制造商說明進行。其中鑒定iPS特異基因使用的引物列表如表1所示。[表1]
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)性多能干細胞的制備方法，該方法包括以下步驟 步驟1，將一個或多個干細胞多能性因子導(dǎo)入體細胞；步驟2，使用添加了鋰鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟1中導(dǎo)入了干細胞多能性因子的體細胞；以及步驟3，鑒定誘導(dǎo)性多能干細胞克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，進一步包括將報告基因?qū)塍w細胞，以此報告基因來指示所述誘導(dǎo)性多能干細胞的產(chǎn)生及其產(chǎn)生效率。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述報告基因為0ct4-GFP或Nanog-GFP，且優(yōu)選為 0ct4-GFP。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟1中，所述干細胞多能性因子選自0ct4、 Sox2、Soxl、Klf4、Klf2、Klf5、Nanog、c_Myc、L-Myc、N-Myc、Lin28 和 Esrrb 中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，在步驟1中，所述干細胞多能性因子包括0ct4、 Sox2、Klf4 和 c-Myc,或者包括 0ct4、Sox2 和 Klf4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟2中，所述鋰鹽包括氯化鋰、碳酸鋰、醋酸鋰、溴化鋰、門東氨酸鋰、Y亞麻酸鋰、肝素鋰、硫酸鋰、硝酸鋰及其它包含鋰離子的化學(xué)品。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟2中，所述鋰鹽為氯化鋰。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟2中，所述鋰鹽的工作濃度為0.l-40mM, 且優(yōu)選為0. 5-20mM，更優(yōu)選為5-10mM，最優(yōu)選為10mM。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟2中，所述培養(yǎng)基為mES培養(yǎng)基和KSR培養(yǎng)基，所述mES培養(yǎng)基為添加有15%胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和β-巰基乙醇的DMEM，且所述KSR培養(yǎng)基為添加有15%替代血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和β -巰基乙醇的 Knockout DMEM。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述步驟2進一步包括將步驟1中制備的導(dǎo)入了 0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc四因子或0ct4、Sox2、Klf4三因子的小鼠胚胎成纖維細胞在第二天消化并接種到飼養(yǎng)層細胞中使用mES培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在第三天使用添加了鋰鹽的 mES培養(yǎng)基培養(yǎng)，在第六天換為添加鋰鹽的KSR培養(yǎng)基培養(yǎng)，在第八天換為KSR培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；以及挑選具有良好干細胞形態(tài)或0ct4-GFP陽性的克隆進行傳代。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述體細胞來自哺乳動物的體細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述哺乳動物選自小鼠、大鼠、兔、豬、羊、牛、 猴或人。
13.一種用于制備誘導(dǎo)性多能干細胞的培養(yǎng)基，其進一步包含鋰鹽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的培養(yǎng)基，其中，所述鋰鹽包括氯化鋰、碳酸鋰、醋酸鋰、溴化鋰、門東氨酸鋰、Y亞麻酸鋰、肝素鋰、硫酸鋰、硝酸鋰及其它包含鋰離子的化學(xué)品。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的培養(yǎng)基，其中，所述鋰鹽為氯化鋰。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的培養(yǎng)基，其中，所述鋰鹽的工作濃度為0.l_40mM，且優(yōu)選為 0. 5-20mM，更優(yōu)選為5-10mM，最優(yōu)選為10mM。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基為添加了鋰鹽的mES培養(yǎng)基和添加了鋰鹽的KSR培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)性多能干(iPS)細胞的制備方法，該方法包括以下步驟步驟1，將一個或多個干細胞多能性因子導(dǎo)入體細胞；步驟2，使用添加了鋰鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟1中導(dǎo)入了干細胞多能性因子的體細胞；以及步驟3，鑒定誘導(dǎo)性多能干細胞克隆。此外，本發(fā)明還提供了一種用于制備誘導(dǎo)性多能干細胞的培養(yǎng)基，其進一步包含鋰鹽。本發(fā)明將含有鋰鹽的培養(yǎng)基應(yīng)用于高效產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細胞中。在本發(fā)明中，鋰鹽能夠使小鼠iPS細胞的產(chǎn)生效率提高5-60倍。本發(fā)明提供的高效率誘導(dǎo)iPS細胞的方法對iPS技術(shù)安全性的提高和iPS細胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有重要意義。
文檔編號C12N5/074GK102559587SQ20101059484
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者王荃, 謝欣 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所