專(zhuān)利名稱(chēng)：一種假單胞菌脂肪酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種編碼假單胞菌I^seudomonas sp脂肪酶WJLIPASE1的基因。本發(fā) 明還涉及所述基因在脂肪酸代謝和生產(chǎn)生物柴油方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物(酶)法生產(chǎn)生物柴油是以油脂為原料，在常溫常壓下利用脂酶(脂肪酶) 作為催化劑合成而得，具有條件溫和、甲醇用量少和能耗低、環(huán)保性能好等優(yōu)點(diǎn)。
由于生物(酶)法生產(chǎn)生物柴油必須添加甲醇或乙醇，另外，在生物(酶)法合成 柴油的同時(shí)，會(huì)得到附產(chǎn)品甘油，而酶在甲醇或乙醇等中容易失活，并且甘油也會(huì)在一定程 度上影響酶活性。因此目前的脂肪酶活性較低。
所以需要開(kāi)發(fā)能夠提高酶活性的脂肪酶。
在對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的分析中，至今尚未發(fā)現(xiàn)假單胞菌I^seudomonas sp脂肪酶在生 產(chǎn)生物柴油有關(guān)的任何報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從假單胞菌I^seudomonas sp中克隆出一種脂肪酶蛋白基因。該 基因的核苷酸序列編碼的脂肪酶蛋白可用于生產(chǎn)生物柴油.
本發(fā)明從假單胞菌I^seudomonas sp獲得了如SEQ ID NO 1所示序列的DNA分 子，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)由SEQ ID NO :1編碼的蛋白具有脂肪酶的功能。所述脂肪酶蛋白命名為 WJLIPASE1，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
從公共數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank和Swissprot中已釋放的脂肪酶基因序列，用ClustalW進(jìn) 行多序列比對(duì)，利用生物信息軟件分析脂肪酶的轉(zhuǎn)脂位點(diǎn)保守區(qū)和蛋白的穩(wěn)定化和折疊的 結(jié)構(gòu)功能區(qū)域，選擇假單胞菌I3Seudomonas sp提取RNA，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒) 進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，獲得脂肪酶蛋白基因，將脂肪酶基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌(pET22 a/b系列表 達(dá)載體)，獲得高效產(chǎn)生脂肪酶的大腸桿菌菌株。使得其重組蛋白含量達(dá)到30%以上，發(fā)酵 液酶活達(dá)可達(dá)8620U/ml以上，純化后制得酶活可高達(dá)^K)00U/g的粉狀脂肪酶。利用該酶 生產(chǎn)生物柴油應(yīng)用試驗(yàn)，使可使生物柴油含量>98.5%，總回收率> 92.6%。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了 一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有 WJLIPASE1蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO. 1中從 核苷酸第133-1980位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中 度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第133-1980位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述 的序列編碼具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO. 1中從核苷酸第133-1980位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的W幾IPASEl相關(guān)蛋白質(zhì)多肽，它包括 具有SEQ ID NO. 1氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生 物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO. 1序列的多肽。
在本發(fā)明還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是原核或真核細(xì)胞。在實(shí) 例中該宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
在本發(fā)明中，DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出 來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨 其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“WJLIPASE1蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有WJLIPASE1蛋 白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3中第133-1980位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。 該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO. 3序列的編碼框第133-1980位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè) 密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所 以與SEQ ID NO. 3中第133-1980位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出 SEQ IDN0.3所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與 SEQ ID NO. 3中從核苷酸第133-1980位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括 與SEQ ID NO. 3中從核苷酸第133-1980位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少 80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的假單胞菌I^seudomonas sp脂肪酶相同功能的 蛋白的SEQ ID N0. 3中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若 干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插 入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為30個(gè)以?xún)?nèi)， 更佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，最佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“假單胞菌I^seudomonas sp WJLIPASE1蛋白或多肽”指具有 WJLIPASE1蛋白活性的SEQ ID N0. 3序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然假單胞菌 Pseudomonas sp脂肪酶相關(guān)相同功能的、SEQ ID N0. 4序列的變異形式。這些變異形式包括 (但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)) 氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè) 以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或 相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添 加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括假單胞菌I^seudomonas sp脂肪酶相關(guān)蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的假單胞菌I^seudomonas sp WJLIPASE1多肽的變異形式包括同源序 列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與假單 胞桿菌脂肪酶相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗假單胞菌I^seudomonas sp W幾IPASEl多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“假單胞菌I^seudomonas sp WJLIPASE1保守性變異多肽”指與SEQ ID N0. 3的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì) 相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn) 生。
表1氨基酸替換表
權(quán)利要求
1.一種假單胞菌I^seudomonas sp脂肪酶基因，其堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種脂肪酶基因，其堿基序列中含有SEQ ID NO. 1所示序列中第133-1980位的核苷酸。
3.一種脂肪酶基因，其堿基序列與SEQ ID NO. 1所示序列中第133-1980位的核苷酸至 少有70%的同源性；或者能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO. 1中第133-1980位的核苷酸 序列雜交。
4.一種脂肪酶蛋白，其特征是含有SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列的多肽、或其保守性變 異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.權(quán)利要求1所述的脂肪酶基因轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，包括原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1 3中任一所述基因在脂肪酸代謝中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1 3中任一所述基因在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明從假單胞菌Pseudomonas sp中獲得了如SEQ ID NO1所示序列的基因，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該基因編碼的蛋白具有脂肪酶的功能，可用于生產(chǎn)生物柴油。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102031264SQ20101054860
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者王勁 申請(qǐng)人:西南科技大學(xué)