專利名稱：經(jīng)遺傳修飾的微生物的生成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ê徒M合物總體上涉及微生物的工業(yè)應(yīng)用，例如酵母。本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N經(jīng)遺傳修飾的微生物，所述修飾能顯著降低微生物在自然界散播的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是其重組的DNA序列在自然界的散播。還提供了生產(chǎn)和利用所述經(jīng)遺傳修飾的微生物的方法。
2.
背景技術(shù)：
重組DNA技術(shù)的發(fā)展使得可以利用原核生物和真核生物來大量生產(chǎn)工業(yè)上有用的產(chǎn)品。在真核生物中，酵母(特別是，屬于酵母菌屬(Saccharomyces)的酵母)被廣泛用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品。一般而言，酵母能夠快速生長，并可以在比細(xì)菌更高的密度下培養(yǎng)，而且不需要在工業(yè)條件下的無菌環(huán)境。此外，酵母比細(xì)菌更易于從培養(yǎng)基中分離，大大簡化了產(chǎn)物的分離和純化過程。由于這些特性，酵母(特別是帶有重組DNA序列的經(jīng)遺傳修飾的酵母)被用作表達(dá)有用產(chǎn)物的宿主，并且此類酵母的應(yīng)用也已經(jīng)建立。但是，在工業(yè)中應(yīng)用經(jīng)遺傳修飾的酵母存在潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)檫@些酵母和/或它們含有的重組DNA序列的散播可能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)帶來不可預(yù)知的影響。因此，需要有一種酵母，其適用于工業(yè)應(yīng)用，但是其在自然界中散播和繁殖的風(fēng)險(xiǎn)降低，特別是其重組DNA序列在自然界中的散播的風(fēng)險(xiǎn)降低。
3.發(fā)明概述本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的經(jīng)遺傳修飾的微生物的生成方法，例如經(jīng)遺傳修飾的酵母菌株的生成方法。本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ò?，在?jīng)遺傳修飾的單倍體微生物細(xì)胞，如酵母細(xì)胞中，功能性破壞一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因和/或一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因，以及誘導(dǎo)所述經(jīng)遺傳修飾的單倍體微生物細(xì)胞形成穩(wěn)定的二倍體，由于缺乏孢子形成能力和/或交配能力，該二倍體不能有效地進(jìn)行有性繁殖并且其生命周期被限制在二倍體狀態(tài)。按照本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄟM(jìn)行遺傳修飾的微生物，如酵母菌株， 具有工業(yè)用途，如用于工業(yè)發(fā)酵，并且可提供的優(yōu)勢(shì)有，在自然界中通過與野生型微生物交配而導(dǎo)致散播和繁殖的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┑慕?jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞包含在一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因中的功能性破壞，其中由于所述一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因的所述破壞，使得所述酵母細(xì)胞缺乏孢子形成能力；在一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因中的功能性破壞，其中由于所述一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因的所述破壞，使得所述酵母細(xì)胞缺乏內(nèi)源性的交配能力；以及一個(gè)或多個(gè)整合的異源目標(biāo)核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞是異宗配合的(ho)。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞是二倍體細(xì)胞，其中一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因的兩個(gè)拷貝和/或一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因的兩個(gè)拷貝都被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的二倍體細(xì)胞除其交配型等位基因以外是純合的。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞是單倍體細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的單倍體細(xì)胞進(jìn)一步含有編碼同宗配合(HO)蛋白質(zhì)的重組質(zhì)粒。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的單倍體細(xì)胞包含一個(gè)或者多個(gè)重組質(zhì)粒，其編碼一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因，所述信息激素應(yīng)答基因在所述酵母細(xì)胞中被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，可用于實(shí)踐本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ǖ慕?jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，釀酒酵母細(xì)胞是Baker’ s酵母、Mauri、Santa Fe、CBS 7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS 7963、CBS 7964、ΙΖ-1904、ΤΑ、BG-1、CR-I、SA-1、 Μ-26、Υ-904、ΡΕ-2、ΡΕ-5、VR-1、BR-1、BR-2、ΜΕ-2、VR-2、ΜΑ-3、ΜΑ-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-1 或AL-I菌株。在一些具體的實(shí)施方式中，釀酒酵母細(xì)胞是ΡΕ-2菌株。另外一些具體的實(shí)施方式中，釀酒酵母細(xì)胞是CAT-I菌株。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞中，被破壞的一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因選自下組IME1、ΙΜΕ2、NDT80、SPOl 1、SP020、AMAl、Η0Ρ2 和 SP021。在一些具體的實(shí)施方式中，IMEl基因被破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞中，被破壞的一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因選下組STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STEl 1。在一些具體的實(shí)施方式中，STE5基因被破壞。在一些具體的實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞包含STE5基因和IMEl基因兩者的功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的酵母的單倍體細(xì)胞包含基因STE5的功能性破壞和編碼STE5蛋白的重組質(zhì)粒。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝司哂墟咦有纬烧系K和交配能力障礙的二倍體酵母菌株的產(chǎn)生方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)獲得第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙，并且含有整合在染色體上的編碼目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列；(b)獲得第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，其中所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙，具有與所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞相反的交配型，并且含有整合在染色體上的編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的異源核苷酸序列；(c)用一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，所述質(zhì)粒編碼的蛋白能夠互補(bǔ)于所述第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞的內(nèi)源性交配障礙；(d)將所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞與第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞交配，從而形成經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞；并且(e)從所述經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞中清除所述一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒，其中產(chǎn)生的經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙。在一些實(shí)施方式中，所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞和所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞由于一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因被功能性破壞而具有內(nèi)源性交配障礙。在一些這樣的實(shí)施方式中，步驟(C)包括用一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，該質(zhì)粒編碼在所述第一或第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞中被功能性破壞的所述信息素應(yīng)答基因的功能性拷貝。在一些實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因選自下組STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11。在一些實(shí)施方式中，所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞和所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞由于STE5 基因被功能性破壞而具有內(nèi)源性交配障礙。
在一些實(shí)施方式中，所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞和所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞由于一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因被功能性破壞而具有孢子形成障礙。 在一些這樣的實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因選自下組ME1、IME2、NDT80、 SPOlU SP020、AMAU H0P2和SP021。在一些實(shí)施方式中，所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞和所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞由于IMEl基因被功能性破壞而具有孢子形成障礙。在具體的實(shí)施方式中，所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞和所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞由于STE5基因被功能性破壞而具有交配障礙，并且由于IMEl基因被功能性破壞而具有孢子形成障礙。在一些實(shí)施方式中，所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞是通過在第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞的種群中誘導(dǎo)交配型轉(zhuǎn)換而得到。在某些這樣的實(shí)施方式中，所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞是異宗配合的(ho)，而所述種群的交配型轉(zhuǎn)換的誘導(dǎo)是通過用編碼同宗配合(HO)蛋白的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，其中所述 HO蛋白的表達(dá)能誘導(dǎo)經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)換交配型。在其他實(shí)施方式中，所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞是通過在所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞中利用重組DNA技術(shù)改變其交配型位點(diǎn)而得到。在一些實(shí)施方式中，用整合構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，該整合構(gòu)建體包含作為整合序列的側(cè)接有同源序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼的交配型不同于第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞的交配型，所述同源序列同源于與第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞中的交配型位點(diǎn)側(cè)接的核苷酸序列。通過同源重組將整合序列整合后，由插入序列編碼的交配型位點(diǎn)替換了第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞中的交配型位點(diǎn)，從而產(chǎn)生第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，用編碼α交配型(MAT alpha)的整合構(gòu)建體，將第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞的交配型從a轉(zhuǎn)換為α。在一些實(shí)施方式中， 整合構(gòu)建體包含SEQ ID Ν0:155。在其他實(shí)施方式中，用編碼a交配型(MATA)的整合構(gòu)建體，將第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞的交配型從α轉(zhuǎn)換為a。在一些實(shí)施方式中，整合構(gòu)建體包含SEQ ID NO :1560在另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的異宗配合 (ho) 二倍體酵母細(xì)胞的生成方法，該方法包括(a)獲得第一經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞，其中所述第一經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞包含(i)整合在染色體上的編碼目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列；和(ii)在STE5基因和IMEl基因中的功能性破壞； (b)用含有編碼同宗配合(HO)蛋白的多核苷酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第一經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞的種群，其中所述HO蛋白的表達(dá)能誘導(dǎo)第一經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)換交配型，從而獲得第二經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞，其中所述第二經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞的交配型與所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞相反，并且包含(i)整合在染色體上的編碼所述目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列；和(ii) 在STE5基因和IMEl基因中的功能性破壞；(c)用編碼STE5基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述第一和第二經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞；(d)將第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞與第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞交配，從而形成經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞；并且(e) 從經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞中消除所有的質(zhì)粒，其中獲得的遺傳學(xué)修飾的異宗配合二倍體酵母細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙。
本申請(qǐng)還提供了由本申請(qǐng)所述方法生成的經(jīng)遺傳修飾的異宗配合酵母細(xì)胞，其缺乏孢子形成和內(nèi)源性交配能力。本申請(qǐng)還提供了ΜΑΤ α /a ste5/ste5imel/imel 酵母細(xì)胞。
4.


圖1顯示第I階段破壞構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)和通過同源重組整合了破壞序列后的靶位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。圖2顯示第II階段破壞構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)和通過同源重組整合了破壞序列后的靶位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。圖3顯示第III階段破壞構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)和通過同源重組整合了破壞序列后的靶位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。圖4顯示第I階段標(biāo)記物循環(huán)構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)和通過同源重組整合了該構(gòu)建體后的靶位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。圖5顯示第II階段標(biāo)記物循環(huán)構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)和通過同源重組整合了該構(gòu)建體后的靶位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。圖6顯示第III階段標(biāo)記物循環(huán)構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)和通過同源重組整合了該構(gòu)建體后的靶位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。圖7顯示STE5破壞構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)和通過同源重組整合了破壞序列后的靶位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。圖8顯示IMEl破壞構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)和通過同源重組整合了破壞序列后的靶位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。圖9比較了經(jīng)遺傳修飾的具有內(nèi)源性交配障礙的單倍體Y1915細(xì)胞和經(jīng)遺傳修飾的內(nèi)源性交配正常的Y1912細(xì)胞的交配能力。圖10比較了經(jīng)遺傳修飾的具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的二倍體Y1979 細(xì)胞和無遺傳修飾的孢子形成正常和內(nèi)源性交配正常的Y1198細(xì)胞的孢子形成能力。圖11比較了經(jīng)遺傳修飾的具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的二倍體Y1979 細(xì)胞和無遺傳修飾的孢子形成正常和內(nèi)源性交配正常的Y1198細(xì)胞在土壤中的存活情況。
5.
具體實(shí)施例方式
5. 1術(shù)語在本申請(qǐng)中，術(shù)語“異源”指自然界中通常沒有的。術(shù)語“異源核苷酸序列”指在自然界的某給定細(xì)胞中通常沒有的核苷酸序列。由此，異源核苷酸序列可以是(a)對(duì)其宿主細(xì)胞而言是外來的(即對(duì)細(xì)胞而言是“外源的”)；(b)在宿主細(xì)胞中天然存在(即，“內(nèi)源的”)，但是在該細(xì)胞中存在的數(shù)量反常(即，多于或少于在該宿主細(xì)胞中天然存在的數(shù)量)；或(C)在宿主細(xì)胞中天然存在，但是位于其天然位點(diǎn)之外。在本申請(qǐng)中，靶基因，例如信息素應(yīng)答基因或孢子形成基因，“被功能性破壞”或 “功能性破壞”，是指改變靶基因以降低在宿主細(xì)胞中靶基因編碼的蛋白的活性。在一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞中靶基因編碼的蛋白的活性被消除。在一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞中靶基因編碼的蛋白的活性降低。為實(shí)現(xiàn)靶基因的功能性破壞，可以通過刪除全部或部分基因，從而使基因表達(dá)消除或降低，或基因產(chǎn)物的活性消除或降低。實(shí)現(xiàn)靶基因的功能性破壞還可以通過突變基因的調(diào)控元件，例如基因的啟動(dòng)子，從而使表達(dá)消除或降低，或突變基因的編碼序列，從而使基因產(chǎn)物的活性消除或降低。在一些實(shí)施方式中，靶基因的功能性破壞導(dǎo)致靶基因的全部開放閱讀框被去除。在本申請(qǐng)中，“內(nèi)源性交配”和“內(nèi)源性交配能力，，是指具有相反交配型，即a交配型和α交配型，的單倍體微生物細(xì)胞，在不存在異源基因表達(dá)，例如，信息素應(yīng)答基因的異源拷貝的表達(dá)或任何能夠誘導(dǎo)這些單倍體之間交配的基因的表達(dá)，的情況下形成二倍體細(xì)胞的能力。在本申請(qǐng)中，“內(nèi)源性交配障礙”是指相對(duì)于野生型單倍體微生物細(xì)胞種群而言， 微生物細(xì)胞的內(nèi)源性交配能力被削弱到足以抑制該微生物細(xì)胞的單倍體在種群內(nèi)交配的程度。在一些實(shí)施方式中，抑制包括，相對(duì)于野生型單倍體微生物細(xì)胞種群的交配率而言， 單倍體微生物細(xì)胞種群的交配率降低至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %，60 %、65 %、70 %、 75%、80%、85%、90% 或 95%。在本申請(qǐng)中，“孢子形成障礙”是指相對(duì)于野生型二倍體微生物細(xì)胞種群而言，二倍體微生物細(xì)胞的孢子形成活性被削弱到足以抑制該微生物細(xì)胞二倍體在種群內(nèi)形成孢子的程度。在一些實(shí)施方式中，抑制包括，相對(duì)于野生型二倍體微生物細(xì)胞種群而言，二倍體微生物細(xì)胞的種群的孢子形成率降低至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、65 %、 70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“互補(bǔ)”基因是指一種基因，其能夠替代被功能性破壞的基因的功能，例如被功能性破壞的孢子形成基因或信息素應(yīng)答基因。在一些實(shí)施方式中，互補(bǔ)基因和被破壞的基因的功能機(jī)制不必相同。在一些實(shí)施方式中，可以用異源基因互補(bǔ)被功能性破壞的靶基因，例如孢子形成基因或信息素應(yīng)答基因，所述異源基因產(chǎn)生的蛋白同源于被破壞的基因所編碼的蛋白，或者產(chǎn)生的蛋白所提供的表型通過其他機(jī)制產(chǎn)生例如孢子形成或交配。
5. 2經(jīng)遺傳修飾的微生物及其生成方法本申請(qǐng)?zhí)峁┝税?jīng)遺傳修飾的微生物例如經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞(如經(jīng)遺傳修飾的釀酒酵母細(xì)胞)的組合物，以及生成該組合物的方法和材料，所述經(jīng)遺傳修飾的微生物在孢子形成和/或內(nèi)源性交配能力上具有功能性障礙。本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄖ袛嗔宋⑸锏挠行苑敝逞h(huán)，以使微生物在自然界中的散播最小化，并且使得經(jīng)遺傳修飾的微生物和自然界中不缺乏散播能力的野生型微生物之間，遺傳物質(zhì)交換的可能性最小化。很多真菌細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞，可有性繁殖也可無性繁殖。無性繁殖僅涉及一個(gè)母細(xì)胞，并且使得種群快速增長。與之相反地，有性繁殖涉及配子的生成和融合，通過細(xì)胞間的橫向基因轉(zhuǎn)移，更快地產(chǎn)生基因多樣性。有性繁殖的真菌細(xì)胞在其生命周期中具有兩種細(xì)胞狀態(tài)，一種是二倍體細(xì)胞狀態(tài)和另一種是單倍體細(xì)胞狀態(tài)。二倍體真菌細(xì)胞通常很穩(wěn)定，一般保持在二倍體狀態(tài)，除非受到一種或多種的具體環(huán)境刺激(例如，營養(yǎng)饑餓)。當(dāng)遇到一種或多種此類刺激時(shí)，二倍體細(xì)胞形成孢子，以產(chǎn)生四個(gè)單倍體的孢子(名為四分體)。當(dāng)恢復(fù)到適宜環(huán)境時(shí)，這些單倍體孢子出芽產(chǎn)生四個(gè)單倍體細(xì)胞(兩個(gè)是a交配型， 兩個(gè)是α交配型)，這些單倍體細(xì)胞可以和其他具有相反交配型的單倍體細(xì)胞交配，從而再次形成二倍體細(xì)胞。
二倍體真菌細(xì)胞的孢子形成能力和單倍體真菌細(xì)胞的交配能力依賴于特定基因產(chǎn)物的功能。在酵母細(xì)胞中這些基因產(chǎn)物是孢子形成基因的產(chǎn)物，例如IME1、IME2、NDT80、 SP011、SP020、AMA1、H0P2和SP021基因，以及信息素應(yīng)答基因產(chǎn)物，例如STE5、STE4、STE18、 STE12、STE7 和 STEll 基因。在一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝私?jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞，其具有孢子形成障礙和 /或內(nèi)源性交配障礙，并且包含整合在染色體上的編碼目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中至少一個(gè)孢子形成基因和/ 或至少一個(gè)信息素應(yīng)答基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中一個(gè)或多個(gè)以下的孢子形成基因被功能性破壞IME1、IME2、NDT80、SPOl 1、SP020、AMAl、H0P2和SP021。 在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中IMEl基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中IME2基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其NDT80基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中SPOll基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中SP020 基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中 AMAl基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞， 其中H0P2基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中SP021基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中多于一個(gè)的選自下組的孢子形成基因被功能性破壞IME1、IME2、NDT80、 SPOl 1、SP020、AMAl、H0P2和SP021。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中多于二個(gè)的選自下組的孢子形成基因被功能性破壞IME1、IME2、NDT80、 SPOl 1、SP020、AMAl、H0P2和SP021。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中多于三個(gè)的選自下組的孢子形成基因被功能性破壞IME1、IME2、NDT80、 SPOl 1、SP020、AMAl、H0P2和SP021。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中多于四個(gè)的選自下組的孢子形成基因被功能性破壞IME1、IME2、NDT80、 SP011、SP020、AMA1、H0P2 禾口 SP021。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中一個(gè)或多個(gè)以下的信息素應(yīng)答基因被功能性破壞STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STEl 1。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中STE5基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中STE4基因被功能性破壞。 在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中STE18基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中STE12基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中STE7基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中STEll 基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中多于一個(gè)的選自下組的信息素應(yīng)答基因被功能性破壞STE5、STE4、STE18、STE12、STE7、和 STEll0在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中多于二個(gè)的選自下組的信息素應(yīng)答基因被功能性破壞STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STEl 1。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中多于三個(gè)的選自下組的信息素應(yīng)答基因被功能性破壞STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STEl 1。在一些實(shí)施方式中， 經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中多于四個(gè)的選自下組的信息素應(yīng)答基因被功能性破壞STE5、STE4、STE18、STE12、STE7 和 STEl 1。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中至少一個(gè)孢子形成基因和至少一個(gè)信息素應(yīng)答基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中IMEl基因和 STE5基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞， 其中IME2基因和STE5基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中NDT80基因和STE5基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中SPOll基因和STE5基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中SP020基因和STE5基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中AMAl基因和 STE5基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中H0P2基因和STE5基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中S0P21基因和STE5基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中IMEl基因和 STE4基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞， 其中IME2基因和STE4基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中NDT80基因和STE4基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中SOPll基因和STE4基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中S0P20基因和STE4基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中AMAl基因和 STE4基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中H0P2基因和STE4基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中S0P21基因和STE4基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中IMEl基因和 STE18基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞， 其中IME2基因和STE18基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中NDT80基因和STE18基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中SOPll基因和STE18基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中S0P20基因和STE18基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中AMAl基因和STE18基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中H0P2基因和STE18基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中S0P21基因和STE18基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中IMEl基因和 STE12基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞， 其中IME2基因和STE12基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中NDT80基因和STE12基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中SOPll基因和STE12基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中S0P20基因和STE12基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中AMAl基因和STE12基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中H0P2基因和STE12基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中S0P21基因和STE12基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中IMEl基因和 STE7基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞， 其中IME2基因和STE7基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中NDT80基因和STE7基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中SOPll基因和STE7基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中S0P20基因和STE7基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中AMAl基因和 STE7基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中H0P2基因和STE7基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中S0P21基因和STE7基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中IMEl基因和 STEll基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞， 其中IME2基因和STEll基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中NDT80基因和STEll基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中SOPll基因和STEll基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中S0P20基因和STEll基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中AMAl基因和STEll基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中H0P2基因和STEll基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其中S0P21基因和STEll基因被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其包含一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因的被功能性破壞的染色體拷貝和一個(gè)或多個(gè)重組質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含所述一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因編碼序列的功能性的染色體外拷貝。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其包含功能性破壞的STE5基因以及重組質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有STE5基因編碼序列的功能性的染色體外拷貝。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其包含功能性破壞的STE4基因以及重組質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有STE4基因編碼序列的功能性染色體外拷貝。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其包含功能性破壞的STE18基因以及重組質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有STE18基因編碼序列的功能性染色體外拷貝。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其包含功能性破壞的STE12基因以及重組質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有STE12基因編碼序列的功能性染色體外拷貝。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞， 其包含功能性破壞的STE7基因以及重組質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有STE7基因編碼序列的功能性染色體外拷貝。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，其包含功能性破壞的STEll基因以及重組質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有STEll基因編碼序列的功能性染色體外拷貝的重組質(zhì)粒。在另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝私?jīng)遺傳修飾的二倍體真菌細(xì)胞，其具有孢子形成障礙和/或內(nèi)源性交配障礙，并且包含整合在染色體上的編碼目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列的兩個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是二倍體酵母細(xì)胞，其中至少一個(gè)孢子形成基因的兩個(gè)拷貝和/或至少一個(gè)信息素應(yīng)答基因的兩個(gè)拷貝都被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是二倍體酵母細(xì)胞，其中一個(gè)或多個(gè)以下的孢子形成基因的兩個(gè)拷貝都被功能性破壞IME1、IME2、NDT80、SPOl 1、SP020、AMAl、 H0P2和SP021。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是二倍體酵母細(xì)胞，其中IMEl 基因的兩個(gè)拷貝都被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是二倍體酵母細(xì)胞，其中一個(gè)或多個(gè)以下的信息素應(yīng)答基因的兩個(gè)拷貝都被功能性破壞STE5、STE4、 STE18、STE12、STE7和STEl 1。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是二倍體酵母細(xì)胞，其中STE5基因的兩個(gè)拷貝都被功能性破壞。在其他一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是二倍體酵母細(xì)胞，其中至少一個(gè)孢子形成基因的兩個(gè)拷貝和至少一個(gè)信息素應(yīng)答基因的兩個(gè)拷貝都被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞是二倍體酵母細(xì)胞，其中IMEl基因的兩個(gè)拷貝和STE5基因的兩個(gè)拷貝都被功能性破壞。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的二倍體真菌細(xì)胞除了其交配型等位基因以外是純合的。例如，如果經(jīng)遺傳修飾的二倍體真菌細(xì)胞形成孢子，則產(chǎn)生的四個(gè)單倍體真菌細(xì)胞除了交配型等位基因以外，在遺傳上是完全相同的。在這樣的情況下，兩個(gè)單倍體細(xì)胞是a 交配型而另外兩個(gè)是α交配型。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的二倍體真菌細(xì)胞不包含提供其抗生素化合物抗性的異源基因。本申請(qǐng)?zhí)峁┑慕?jīng)遺傳修飾的二倍體真菌細(xì)胞具有多重安全保護(hù)，防止其含有的異源核苷酸序列出現(xiàn)不希望的繁殖。首先，二倍體真菌細(xì)胞通常非常穩(wěn)定，并且在二倍體狀態(tài)下不能與其他真菌細(xì)胞交配。其次，本申請(qǐng)?zhí)峁┑亩扼w真菌細(xì)胞具有孢子形成能力障礙， 因此，即使在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境刺激下，也僅具有微乎其微的或者沒有形成孢子的能力。第三，即使在罕見的情況下生成了孢子，產(chǎn)生的單倍體真菌細(xì)胞所具備的交配能力也是有障礙的。 綜上，本申請(qǐng)?zhí)峁┑慕?jīng)遺傳修飾的真菌細(xì)胞所具有的孢子形成缺陷和交配缺陷的特性，顯著地降低了異源核苷酸序列向野生型真菌細(xì)胞遷移的可能性。在另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝嗽诖嗣枋龅慕?jīng)遺傳修飾的二倍體真菌細(xì)胞的生產(chǎn)方法，在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)獲得第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞，其中所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙，并且含有整合在染色體上的編碼目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列；(b)獲得第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞，其中所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙，具有與第一遺傳修飾單倍體真菌細(xì)胞相反的交配型，并且含有整合在染色體上的編碼所述目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列；(c)用一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞，所述質(zhì)粒編碼的蛋白能夠互補(bǔ)于所述第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞的內(nèi)源性交配障礙；(d)將所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞與第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞交配，從而形成經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞；并且(e)從所述經(jīng)遺傳修飾的二倍體真菌細(xì)胞中清除一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒，其中所述生成的經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙，并且包含整合在染色體上的編碼所述目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列的兩個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方式中，第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞由于一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因被功能性破壞而具有內(nèi)源性交配障礙。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法中的步驟(C)包括，用一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞，所述質(zhì)粒編碼在所述第一或第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞中被功能性破壞的一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因的功能性拷貝。在一些實(shí)施方式中，第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，并且一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因選自下組STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STEl 1。在一些實(shí)施方式中，第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞是由于STE5基因被功能性破壞而具有內(nèi)源性交配障礙的單倍體酵母細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞由于一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因被功能性破壞而具有孢子形成障礙。在一些實(shí)施方式中，第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞是單倍體酵母細(xì)胞，且一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因選自下組IME1、IME2、NDT80、SPOl 1、SP020、AMAl、H0P2 和 SP021。在一些實(shí)施方式中，第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞是由于IMEl基因被功能性破壞而具有孢子形成障礙的單倍體酵母細(xì)胞。在具體的實(shí)施方式中，第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞是由于STE5基因被功能性破壞而具有內(nèi)源性交配障礙，并且由于IMEl基因被功能性破壞而具有孢子形成障礙的單倍體酵母細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞是通過在第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞的種群中誘導(dǎo)交配型轉(zhuǎn)換而得到。在一些實(shí)施方式中，第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體真菌細(xì)胞是異宗配合(ho)的單倍體釀酒酵母細(xì)胞，并且所述異宗配合(ho)的單倍體釀酒酵母細(xì)胞的種群的交配型轉(zhuǎn)換的誘導(dǎo)是通過用編碼功能性同宗配合(HO)蛋白的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，其中HO蛋白的表達(dá)能夠誘導(dǎo)單倍體釀酒酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)換交配型，從而生成第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體釀酒酵母細(xì)胞。異宗配合(ho) 的單倍體釀酒酵母細(xì)胞的特征在于，幾乎不會(huì)發(fā)生自發(fā)的交配型轉(zhuǎn)換(概率僅為10-6)。通過瞬時(shí)表達(dá)HO蛋白，單倍體釀酒酵母細(xì)胞發(fā)生自發(fā)的交配型轉(zhuǎn)換的概率升高到每次細(xì)胞分裂時(shí)可發(fā)生一次，這提供了具有相反交配型的單倍體細(xì)胞種群，其能夠互相交配從而產(chǎn)生二倍體釀酒酵母細(xì)胞。在另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N缺乏孢子形成和內(nèi)源性交配能力的經(jīng)遺傳修飾的異宗配合(ho) 二倍體酵母細(xì)胞的生成方法，該方法包括(a)獲得第一經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞，其中所述第一經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞包含(i)整合在染色體上的編碼目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列；和(ii)在一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因和一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因中的功能性破壞；(b)用編碼同宗配合(HO)蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第一經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞的種群，以生成第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，其中HO蛋白的表達(dá)能夠誘導(dǎo)第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)換交配型，從而獲得第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，其中第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞與第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞交配型相反，并且包含(i)整合在染色體上的編碼所述目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列；和(ii)在一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因和一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因中的功能性破壞；(C)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，所述質(zhì)粒編碼在所述第一和第二單倍體酵母細(xì)胞中被功能性破壞的一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答蛋白；(d) 將第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞與第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞交配，從而形成經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞，該細(xì)胞除交配型等位基因以外是純合的；并且(e)從經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞中消除所有的質(zhì)粒，以生成經(jīng)遺傳修飾的異宗配合二倍體酵母細(xì)胞，其中生成的經(jīng)遺傳修飾的異宗配合二倍體酵母細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙，并且包含整合在染色體上的編碼所述目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列的兩個(gè)拷貝。W056] 雖然在本申請(qǐng)?zhí)峁┑牟⑶以谙旅娓鼮樵敿?xì)描述的方法中，各個(gè)步驟是以連續(xù)的順序展現(xiàn)的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，在不擴(kuò)大本發(fā)明的范圍的前提下，若干步驟的順序可以互換、合并或重復(fù)。因此，在一些實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的異宗配合(ho)的缺乏孢子形成和內(nèi)源性交配能力的二倍體酵母細(xì)胞的生成是通過首先用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞，所述質(zhì)粒編碼在所述經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞中被功能性破壞的一個(gè)或多個(gè)信息素基因，然后用編碼同宗交配(HO)蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化該細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的異宗配合(ho)的缺乏孢子形成和內(nèi)源性交配能力的二倍體酵母細(xì)胞的生成是通過同時(shí)用兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞，一個(gè)質(zhì)粒編碼在所述經(jīng)遺傳修飾的異宗配合單倍體酵母細(xì)胞中被功能性破壞的一個(gè)或多個(gè)信息素基因，另一個(gè)編碼同宗交配(HO)蛋白。 5. 2. 1微生物的選擇可用于實(shí)踐本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ǖ奈⑸锇ㄕ婧藛渭?xì)胞生物，特別是真菌，尤其特別是酵母。在一些實(shí)施方式中，可用于本申請(qǐng)方法的酵母包括已經(jīng)保藏在微生物保藏機(jī)構(gòu) (如IFO，ATCC等)的酵母，和屬于下列屬的酵母芽孢酵母屬、神食酵母屬、節(jié)束酵母屬、 Arxiozyma屬、棉阿舒囊霉屬、Babjevia屬、本森頓酵母屬、葡萄藻屬、Botryozyma屬、酒香酵母屬、布勒彈孢酵母屬、布勒擔(dān)孢酵母屬、假絲酵母屬、固囊酵母屬、棒孢酵母屬、隱球酵母菌屬、產(chǎn)黑色素酵母屬(CystofilcAasidium)、德巴利酵母屬、德克酵母屬、擬雙足囊菌屬、芽生裂殖酵母屬、Eeniella屬、Endomycopsella屬、Eremascus屬、假囊酵母屬、擔(dān)孢酵母屬、Fellomyces屬、線黑粉酵母屬、Galactomyces屬、地霉屬、季氏酵母屬、有孢漢遜酵母屬、漢遜酵母屬、Hasegawaea屬、Holtermannia屬、Hormoascus屬、生絲畢赤酵母屬、伊薩酵母屬、克勒克酵母屬、Kloeckeraspora屬、克魯維酵母屬、Kondoa屬、Kuraishia屬、克氏擔(dān)孢酵母屬、白冬孢酵母屬、油脂酵母屬、路德酵母屬、馬拉色菌酵母屬、梅奇酵母屬、木拉克酵母屬、Myxozyma屬、拿遜酵母屬、Nakazawaea屬、榛針孢酵母屬、Ogataea屬、卵孢酵母屬、菅囊酵母屬、Phachytichospora屬、法夫酵母屬、畢赤酵母屬、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、 酵母屬、類酵母屬、復(fù)膜孢酵母屬、Saitoella屬、Mkaguchia屬、Satumospora屬、裂芽酵母屬、殖酵母屬、許旺酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬、原孢酵母屬、冠孢酵母屬、梗孢酵母 M>Sterigmatosporidium M>Symbiotaphrina 屬、合$由酵母屬、Sympodiomycopsis 屬、有 包圓酵母屬、Trichosporiella屬、絲孢酵母屬、三角酵母屬、Tsuchiyaea屬、Udeniomyces屬、 Waltomyces屬、威克酵母屬、擬魏克酵母屬、擬威爾酵母屬、Yamadazyma屬、亞羅酵母屬、接合囊酵母屬、接合酵母屬、接合擬威爾酵母屬和配合酵母菌屬。
在一些實(shí)施方式中，所述微生物是釀酒酵母、畢式酵母、粟酒裂殖酵母、布魯塞爾德克酵母(Dekkera bruxellensis)、乳酸克魯維斯酵母(此前稱為乳酸酵母)、馬克思克魯維酵母、ArMla adeninivorans或多形漢森酵母(現(xiàn)稱為畢赤酵母)。在一些實(shí)施方式中，微生物是假絲酵母屬菌株，如解脂耶氏酵母、吉利蒙假絲酵母、克魯氏假絲酵母、擬熱帶假絲酵母或產(chǎn)朊假絲酵母菌。在具體的實(shí)施方式中，所述微生物是釀酒酵母。在一些實(shí)施方式中，所述微生物是選自下組的釀酒酵母菌株:Baker' s 酵母、CBS 7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS 7963、CBS 7964、IZ-1904、TA、BG-l、CR-l、SA-l、M-26、Y-904、PE-2、PE-5、VR-l、BR-l、BR-2、 ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-I 和 AL-1。在一些實(shí)施方式中，所述微生物是選自下組的釀酒酵母菌株P(guān)E-2、CAT-I、VR-I、BG-I、CR-I和SA-I。在具體的實(shí)施方式中，所述釀酒酵母菌株是PE-2。在另一具體的實(shí)施方式中，所述釀酒酵母菌株是CAT-I。在另一具體的實(shí)施方式中，所述釀酒酵母菌株是BG-I。在一些實(shí)施方式中，所述微生物是適于工業(yè)發(fā)酵的微生物，例如生物乙醇發(fā)酵。在具體的實(shí)施方式中，所述微生物習(xí)慣于生存在高溶劑濃度、高溫、廣泛的底物利用、營養(yǎng)限制、由糖和鹽產(chǎn)生的滲透壓、酸度、亞硫酸鹽以及細(xì)菌污染條件下或上述條件的組合，這些被認(rèn)為是工業(yè)發(fā)酵環(huán)境中的應(yīng)力狀態(tài)。
5. 2. 2微生物的遺傳修飾采用重組質(zhì)?；蛉旧w整合載體產(chǎn)生遺傳修飾的微生物的方法是本領(lǐng)域的公知技術(shù)。例如，可參見Sherman, F. , et al. , Methods Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1978) ；Guthrie, C. , et al. (Eds. )Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology Vol. 194,Academic Press,San Diego (1991) ；Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning__A Laboratory Manual,3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ；and Ausubel et al. , eds. , Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY ；上述文獻(xiàn)公開的內(nèi)容在此參考并入。在一些實(shí)施方式中，微生物被遺傳修飾以包含一個(gè)或多個(gè)異源核苷酸序列，其編碼新的代謝通路中的酶，即，該代謝通路產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在微生物中不會(huì)內(nèi)源性產(chǎn)生。在其他實(shí)施方式中，微生物被遺傳修飾以包含一個(gè)或多個(gè)異源核苷酸序列，其編碼微生物內(nèi)源代謝通路中的酶，即，該代謝通路產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在微生物中內(nèi)源性產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的方法需要應(yīng)用重組質(zhì)粒在微生物中瞬時(shí)表達(dá)特定的蛋白，如由信息素應(yīng)答基因之一或HO編碼的特定蛋白。適用于酵母細(xì)胞的重組質(zhì)粒的示例性例子包括CEN/ARS和2 μ質(zhì)粒。在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)的微生物不含有編碼抗生素抗性的異源核苷酸序列。 抗生素抗性標(biāo)記物一般用于構(gòu)建經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞。在本發(fā)明的這些實(shí)施方式中，抗生素抗性標(biāo)記物被用于標(biāo)記在微生物中引入的遺傳修飾，在所有期望的遺傳修飾被引入微生物以后，這些標(biāo)記物被隨之刪除。可選擇地，也可使用其他選擇工具，用于構(gòu)建經(jīng)遺傳修飾的微生物,例如營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)(如 HIS3、LEU2、LYS1、MET15、TRP1、ADE2、URA3 和 LYS2)。
5. 2. 3孢子形成基因和/或信息素應(yīng)答基因的破壞本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒òㄔ诮?jīng)遺傳修飾的微生物細(xì)胞中功能性破壞一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因和/或一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因的破壞產(chǎn)生了缺乏孢子形成能力的經(jīng)遺傳修飾的微生物，特別是缺乏孢子形成能力的經(jīng)遺傳修飾的二倍體微生物。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因被破壞，生成了具有內(nèi)源性交配障礙的微生物細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因和/ 或一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因被破壞，生成了具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的微生物細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，孢子形成基因或信息素應(yīng)答基因的破壞是利用“破壞構(gòu)建體” 來實(shí)現(xiàn)的，破壞構(gòu)建體引入微生物細(xì)胞后，能夠特異性地破壞孢子形成基因或信息素應(yīng)答靶基因，從而使得被破壞的基因喪失功能。在一些實(shí)施方式中，靶基因的破壞阻止了功能性蛋白的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，靶基因的破壞導(dǎo)致被破壞的基因表達(dá)無功能的蛋白。在一些實(shí)施方式中，通過同源重組，在靶基因位點(diǎn)內(nèi)整合“破壞序列”，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)孢子形成的靶基因或信息素應(yīng)答的靶基因的破壞。在這樣的實(shí)施方式中，破壞構(gòu)建體包含破壞序列，其側(cè)接有一對(duì)核苷酸序列，該核苷酸序列同源于靶基因位點(diǎn)的一對(duì)核苷酸序列(同源序列)。 當(dāng)靶基因的靶向部分被破壞構(gòu)建體替換后，破壞序列阻止靶基因表達(dá)功能性的蛋白，或?qū)е掳谢虮磉_(dá)無功能的蛋白?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，來構(gòu)建能夠破壞一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因或信息素應(yīng)答基因的破壞構(gòu)建體。例如，可參見Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning__A Laboratory Manual,3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 禾口 Ausubel et al. , eds. , Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY。在實(shí)施本申請(qǐng)所述的方法時(shí)，可以改變破壞構(gòu)建體的多種參數(shù)，包括但不限于，同源序列的長度；同源序列的核苷酸序列；破壞序列的長度；破壞序列的核苷酸序列；和靶基因的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，每一個(gè)同源序列的有效長度范圍是50到 5000個(gè)堿基對(duì)。在具體的實(shí)施方式中，每一個(gè)同源序列的長度約為500個(gè)堿基對(duì)。有關(guān)基因靶向所需的同源性長度的討論，可參見Hasty et al. ,Mol Cell Biol 11:5586-91(1991)。 在一些實(shí)施方式中，同源序列包含靶基因的編碼序列。在其他實(shí)施方式中，同源序列包含靶基因的上游或下游序列。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)同源序列包含的核苷酸序列同源于位于靶基因編碼序列5’端的核苷酸序列，而另一個(gè)同源序列包含的核苷酸序列同源于位于靶基因3，端的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，破壞序列包含編碼標(biāo)記物的核苷酸序列，其能夠用于選擇包含破壞序列的微生物細(xì)胞。因此，在這樣的實(shí)施方式中，破壞構(gòu)建體具有雙重功能，即，功能性破壞靶基因，并且提供選擇標(biāo)記物，用于鑒定靶基因被功能性破壞的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，將終止密碼子置于編碼選擇標(biāo)記物的核苷酸序列的表達(dá)框內(nèi)且位于其下游，以阻止翻譯連讀，避免產(chǎn)生具有靶基因編碼的野生型蛋白的一定程度活性的融合蛋白。 在一些實(shí)施方式中，破壞序列的長度是一個(gè)堿基對(duì)。插入單個(gè)堿基對(duì)就足以破壞靶基因，因?yàn)樵诰幋a序列中插入單個(gè)堿基對(duì)能夠造成移碼突變，從而阻止功能性蛋白的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，破壞序列的核苷酸序列與位于同源序列之間的靶基因的核苷酸序列有單個(gè)堿基對(duì)的不同。通過用破壞序列替換靶基因序列中的核苷酸序列，可引入單堿基對(duì)替換，從而導(dǎo)致蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)的一個(gè)氨基酸被替換，并且表達(dá)無功能的蛋白。但是，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，采用非常短的破壞序列造成的破壞很容易通過自發(fā)突變回復(fù)為野生型序列，從而導(dǎo)致宿主菌株的交配能力和孢子形成能力恢復(fù)。因此，在具體的實(shí)施方式中，破壞序列長于一個(gè)到幾個(gè)堿基對(duì)。另一個(gè)極端是，過長的破壞序列并不比長度適中的破壞序列具有任何優(yōu)勢(shì)，并且還可能降低轉(zhuǎn)染或靶向的效率。在這里，過長的長度比在靶基因中選定的同源序列之間的距離長很多倍。因此，在某些實(shí)施方式中，破壞序列的長度可以是從2到2000個(gè)堿基對(duì)。在另外的實(shí)施方式中，破壞序列的長度近似地等于與破壞構(gòu)建體中的同源序列相匹配的靶基因位點(diǎn)的區(qū)域之間的距離。在一些實(shí)施方式中，破壞構(gòu)建體是線性DNA分子。在其他實(shí)施方式中，破壞構(gòu)建體是環(huán)狀DNA分子。在一些實(shí)施方式中，環(huán)狀破壞構(gòu)建體包含一對(duì)被破壞序列分隔的同源序列，如上文所述。在一些實(shí)施方式中，環(huán)狀破壞構(gòu)建體包含單個(gè)同源序列。當(dāng)整合到靶基因位點(diǎn)上時(shí)，這樣的環(huán)狀破壞構(gòu)建體變?yōu)榫€性，部分同源序列位于兩端，破壞構(gòu)建體中其余的區(qū)段插入并破壞靶基因，并且不替換靶基因的任何核苷酸序列。在具體的實(shí)施方式中，環(huán)狀破壞構(gòu)建體中的單個(gè)同源序列與位于靶基因編碼序列內(nèi)的序列同源?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的不限的任何方法，將破壞構(gòu)建體引入微生物細(xì)胞。這樣的方法包括但不限于，使細(xì)胞從溶液中直接攝取該分子，或通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法促進(jìn)攝取，采用例如，脂質(zhì)體或免疫脂質(zhì)體；顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；等等。例如，可參見美國專利 5, 272, 065 ；Goeddel et al. , eds,1990, Methods in Enzymology, vol.185, Academic Press, Inc. , CA ；Krieger,1990,Gene Transfer and Expression—A Laboratory Manual, Stockton Press,NY ；Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning__A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY ；and Ausubel et al. , eds. , Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY。轉(zhuǎn)化酵母的具體方法是本領(lǐng)域的公知常識(shí)。參見Hinnen et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USD 75 :1292-3(1978) ；Cregg et al. , Mol. Cell. Biol. 5 3376-3385 (1985)。示例性技術(shù)包括但不限于，原生質(zhì)體法，電穿孔法，PEG1000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化， 和醋酸鋰或氯化鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
5. 2. 3. 1信息素應(yīng)答基因在一些實(shí)施方式中，采用本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的信息素應(yīng)答基因是STE5。STE5基因編碼一種結(jié)構(gòu)蛋白，其在通過酵母交配通路向絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)直接傳遞信號(hào)時(shí)是必需的。例如，可參見Good et al.，Cell Mar 20 ； 136 (6) 1085-97(2009)。代表性的釀酒酵母中的STE5核苷酸序列包括，Genbank登錄號(hào)L23856以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :17、45、73、101和129。代表性的釀酒酵母蛋白序列包括，Genbank 登錄號(hào) AAA35115，以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑?SEQ ID NOS :18、46、74、102 和 130。在一些實(shí)施方式中，采用本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的信息素應(yīng)答基因是STE4。STE4基因編碼G蛋白的β亞基，其與MelSp形成二聚體，以激活交配信號(hào)通路。釀酒酵母中的STE4基因的序列已有描述(Dujon et al.，Nature 387 (6632Suppl) 98-102 (1997))。代表性的釀酒酵母中的STE4核苷酸序列包括，Genbank登錄號(hào) NC_001147. 5，以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS 19、47、75、103和131。代表性的釀酒酵母的
蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào)NP_014855，以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :20、48、76、 104 和 132。在一些實(shí)施方式中，采用本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的信息素應(yīng)答基因是STE18。STE18基因編碼G蛋白、亞基，其與Ste4p形成二聚體，以激活交配信號(hào)通路。釀酒酵母中的STE18基因的序列已有描述(Goffeau et al.，Science 274(5287) 546-547 (1996))。代表性的釀酒酵母中的STE18核苷酸序列包括，Genbank登錄號(hào) NC_001147. 5，以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :21、49、77、105和133。代表性的釀酒酵母的 Stel8蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào)NP_012619，以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :22、50、 78、106 和 134。在一些實(shí)施方式中，采用本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的信息素應(yīng)答基因是STE12。STE12基因編碼一種轉(zhuǎn)錄因子，其由MAP激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)放大激活，并且還激活與交配或假菌絲/侵襲生長通路相關(guān)的基因。釀酒酵母中的STE12基因的序列已有描述 (Goffeau et al. ,Science 274(5287) :546-547 (1996))。代表性的釀酒酵母的 STE12 核苷酸序列包括，Genbank登錄號(hào)NC_001140. 5，以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :23、51、79、107 和135。代表性釀酒酵母的Mel2蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào)NP_011952，以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑?SEQ IDNOS :24、52、80、108 和 136。在一些實(shí)施方式中，采用本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的信息素應(yīng)答基因是STE7。STE7基因編碼轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的MAP激酶，其參與信息素應(yīng)答過程，其間磷酸化Fus3p。 釀酒酵母中的STE7基因的序列已有描述CTeague et al. , Proc Natl Acad Sci U S A. 83(19) :7371-5(1986))。代表性的釀酒酵母的STE7核苷酸序列包括，Genbank登錄號(hào) Z74207,以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :25、53、81、109和137。代表性釀酒酵母的Ste7蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào)CAA98732，以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS J6、54、82、110和 138。在一些實(shí)施方式中，采用本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的信息素應(yīng)答基因是STE11。STEll基因編碼轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的MEK激酶，其參與信息素應(yīng)答過程和假菌絲/侵襲生長通路，其間磷酸化Me7p。釀酒酵母中的STEll基因的序列已有描述(Johnston et al., Nature 387 (6632Suppl)，87-90 (1997))。代表性的釀酒酵母的STEll核苷酸序列包括， Genbank 登錄號(hào) NC_001144. 4，以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑?SEQ ID NOS :27、55、83、111 和 139。代表性釀酒酵母的Mell蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào)NP_013466，以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :28、56、84、112 和 140。
5. 2. 3. 2孢子形成基因在一些實(shí)施方式中，按照本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的孢子形成基因是 IMEl0 IMEl基因編碼一種轉(zhuǎn)錄因子，其激活早期減數(shù)分裂基因轉(zhuǎn)錄，為啟動(dòng)減數(shù)分裂所必需。釀酒酵母細(xì)胞的IMEl基因序列已有報(bào)道。例如，可參見，Smith，H. Ε.，et al.，Mol. Cell. Biol. 10(12) :6103-6113(1990)。代表性的釀酒酵母IMEl核苷酸序列包括，Genbank 登錄號(hào)M37188，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :1、29、57、85和113。代表性的釀酒酵母Lnel 蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào)AAA86790，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :2、30、58、86和114。在一些實(shí)施方式中，按照本發(fā)明提供的方法在酵母細(xì)胞中破壞的孢子形成基因是 IME2。IME2基因編碼參與激活減數(shù)分裂的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。釀酒酵母細(xì)胞的IME2 基因序列已有報(bào)道。例如，可參見，EMBO J. 15 (9) ,2031-2049 (1996)。代表性的釀酒酵母 IME2核苷酸序列包括，Genbank登錄號(hào)NC_001142，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :3、31、59、 87和115。代表性的釀酒酵母Liie2蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào)NP_012429，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑?SEQ ID NOS :4、32、60、88 和 116。在一些實(shí)施方式中，按照本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的孢子形成基因是 NDT80o NDT80基因編碼減數(shù)分裂特異性的轉(zhuǎn)錄因子，其為結(jié)束粗線期以及完全減數(shù)分裂重組所必需。NdtSO蛋白也激活中期孢子形成基因。釀酒酵母細(xì)胞的NDT80基因序列已有報(bào)道。例如，可參見，Goffeau et al.，Science 274(5287) :546-547 (1996)。代表性的釀酒酵母NDT80核苷酸序列包括，Genbank登錄號(hào)NC_001140，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :5、 33、61、89和117。代表性的釀酒酵母Ndt80蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào)NP_011992，和本發(fā)明提供的 SEQ ID NOS :6、34、62、90 和 118。在一些實(shí)施方式中，按照本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的孢子形成基因是 SPOll0 SPOll基因?yàn)闇p數(shù)分裂重組所必需。釀酒酵母細(xì)胞的SPOll基因序列已有報(bào)道。 例如，可參見，Atcheson et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 84 (22)，8035-8039 (1987)。 代表性的釀酒酵母SPOll核苷酸序列包括，Genbank登錄號(hào)J(^987，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :7、35、63、91和119。代表性的釀酒酵母Spoil蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào) AAA65532，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑?SEQ ID NOS :8、36、64、92 和 120。在一些實(shí)施方式中，按照本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的孢子形成基因是 SP020。SP020基因編碼減數(shù)分裂特異性的t-SNARE復(fù)合物的亞基，在孢子形成過程中其為形成前孢子體膜所必需。釀酒酵母細(xì)胞的SP020基因序列已有報(bào)道。例如，可參見，Bowman et al.，Nature 387(6632 Suppl)，90-93 (1997)。代表性的釀酒酵母 SP020 核苷酸序列包括，Genbank登錄號(hào)AF078740，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :9、37、65、93和121。代表性的釀酒酵母Spo20蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào)NP_013730，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS 10、38、66、94 和 122。在一些實(shí)施方式中，按照本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的孢子形成基因是AMA1。AMAl基因編碼減數(shù)分裂后期促進(jìn)復(fù)合物的激活劑。釀酒酵母細(xì)胞的AMAl基因序列已有報(bào)道。例如，可參見，Tettelin et al.，Nature 387 (6632Suppl) :81-84(1997)。 代表性的釀酒酵母AMAl核苷酸序列包括，Genbank登錄號(hào)NC_001139. 8，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑?SEQ ID NOS :11、39、67、95和123。代表性的釀酒酵母Amal蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào) NP_011741，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑?SEQ ID NOS 12、40、68、96 和 124。在一些實(shí)施方式中，按照本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的孢子形成基因是 H0P2。H0P2基因編碼減數(shù)分裂特異性的蛋白，其確保同源染色體間的結(jié)合。釀酒酵母細(xì)胞的H0P2基因序列已有報(bào)道。例如，可參見，Leu et al.，Cell 94(3) :375-386 (1998)。代表性的釀酒酵母H0P2核苷酸序列包括，Genbank登錄號(hào)AF_078740. 1，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NOS :13、41、69、97和125。代表性的釀酒酵母的Hop2蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào) AAC31823，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑?SEQ ID NOS :14、42、70、98 和 126。在一些實(shí)施方式中，按照本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ㄔ诮湍讣?xì)胞中破壞的孢子形成基因是 SP021。SP021基因編碼紡錘體極體的減數(shù)分裂外斑塊的組份，其參與修飾減數(shù)分裂外斑塊， 為前孢子體膜形成所必需。釀酒酵母細(xì)胞的SP021基因序列已有報(bào)道。例如，可參見，Dujon et al. , Nature 387 (6632Suppl) :98-102 (1997)。代表性的釀酒酵母 SP021 核苷酸序列包括，Genbank 登錄號(hào) NC_001147. 5，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑?SEQ ID NOS :15、43、71、99 和 127。代表性的釀酒酵母Spo21蛋白序列包括，Genbank登錄號(hào)ΝΡ_014550，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ IDNOS :16、44、72、100 和 128。 5. 2. 4 二倍體的制備本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒òㄔ趩伪扼w細(xì)胞間誘導(dǎo)交配的步驟，所述細(xì)胞包含在一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因中的功能性破壞和/或在一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因中的功能性破壞。 由所述交配生成的二倍體細(xì)胞是穩(wěn)定的二倍體細(xì)胞，由于細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因被功能性破壞，因而被限制于二倍體狀態(tài)。為了從缺乏交配能力的單倍體細(xì)胞形成二倍體細(xì)胞，將交配障礙的單倍體細(xì)胞用 “交配互補(bǔ)質(zhì)粒”轉(zhuǎn)化，即，包含可以互補(bǔ)于交配缺陷的異源基因的重組質(zhì)粒，所述交配缺陷是由于一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因被功能性破壞而導(dǎo)致。在單倍體細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的異源信息素應(yīng)答基因可以暫時(shí)恢復(fù)細(xì)胞的交配功能，并且使相反交配型的單倍體細(xì)胞能夠形成穩(wěn)定的二倍體細(xì)胞。特別地，由此生成的穩(wěn)定的二倍體細(xì)胞由于是從具有相同的經(jīng)遺傳修飾的種群中的單倍體產(chǎn)生，故除了交配型等位基因外是純合的。因此，在一些實(shí)施方式中，單倍體細(xì)胞包含在STE5基因中的功能性破壞，用包含 STE5編碼序列的交配互補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單倍體細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，單倍體細(xì)胞包含在 STE4基因中的功能性破壞，用包含STE4編碼序列的交配互補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單倍體細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，單倍體細(xì)胞包含在STE18基因中的功能性破壞，用包含STE18編碼序列的交配互補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單倍體細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，單倍體細(xì)胞包含在STE12基因中的功能性破壞，用包含STE12編碼序列的交配互補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單倍體細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，單倍體細(xì)胞包含在STE7基因中的功能性破壞，用包含STE7編碼序列的交配互補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單倍體細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，單倍體細(xì)胞包含在STEll基因中的功能性破壞，用包含STEll編碼序列的交配互補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單倍體細(xì)胞。表達(dá)載體的構(gòu)建技術(shù)以及在含有表達(dá)載體的細(xì)胞中表達(dá)基因的技術(shù)是本領(lǐng)域的公知常識(shí)。例如，可參見，Sambrook et al. ,2001, Molecular Cloning-ALaboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 禾口 Ausubel et al., eds. , Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,NY?？梢允褂帽玖铐撚蚣夹g(shù)人員公知的任何方法，將編碼交配互補(bǔ)基因的質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞中?；谫|(zhì)粒的系統(tǒng)通常需要對(duì)質(zhì)粒施加選擇壓力，以維持細(xì)胞內(nèi)的外源DNA。酵母中的大多數(shù)質(zhì)粒是相對(duì)不穩(wěn)定的，因?yàn)槊看斡薪z分裂后，酵母細(xì)胞通常會(huì)丟失細(xì)胞中10%的質(zhì)粒。因此，在一些實(shí)施方式中，通過允許二倍體細(xì)胞經(jīng)歷足夠的有絲分裂，使得質(zhì)粒在種群中被有效稀釋，由此篩選得到通過單倍體細(xì)胞交配生成的二倍體細(xì)胞，這些單倍體細(xì)胞包含編碼交配互補(bǔ)基因的質(zhì)粒，但其自身并不包含該質(zhì)粒?？蛇x擇地，可以通過選擇質(zhì)粒的缺乏來篩選二倍體細(xì)胞，例如，通過篩選反選擇標(biāo)記物(例如，URA3)，或者將同樣的菌落接種到選擇性培養(yǎng)基及非選擇性培養(yǎng)基上，然后選擇在選擇性培養(yǎng)基上不生長而在非選擇性培養(yǎng)基上生長的菌落。在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒òㄓ镁幋a同宗配合(HO)蛋白的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單倍體異宗配合(ho)酵母細(xì)胞的步驟，其中HO蛋白的表達(dá)能夠誘導(dǎo)單倍體交配型的轉(zhuǎn)換。釀酒酵母的HO基因的序列已有報(bào)道。例如，可參見，Russell et al. , Mol. Cell. Biol. 6(12) :4281-4294(1986) 0代表性的釀酒酵母HO核苷酸序列包括，Genbank登錄號(hào)NC_001136，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID NO 151。代表性的釀酒酵母HO蛋白序列包括，Genbank 登錄號(hào)NP_010054，和本申請(qǐng)?zhí)峁┑腟EQ ID N0:152。 6.實(shí)施例
6. 1實(shí)施例1 經(jīng)遺傳修飾的單倍體細(xì)胞的產(chǎn)生本實(shí)施例描述了一種產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的單倍體釀酒酵母細(xì)胞的示例方法。第I階段破壞構(gòu)建體(圖1 ；SEQ ID NO :141)包含作為破壞序列的編碼選擇標(biāo)記物(hygA，提供對(duì)潮霉素B的抗性)的核苷酸序列；釀酒酵母MEV通路的兩種酶(截短的 HMGl編碼序列，其編碼截短的HMG-CoA還原酶，以及ERG13編碼序列，其編碼HMG-CoA合酶)，和釀酒酵母的另一種酶(ERG10編碼序列，其編碼乙酰乙酰-CoA硫解酶)，置于半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子(釀酒酵母基因GALl和GALlO的啟動(dòng)子)的調(diào)控下；側(cè)接有由釀酒酵母GAL80 位點(diǎn)的上游和下游核苷酸序列組成的同源序列。當(dāng)轉(zhuǎn)入到釀酒酵母宿主細(xì)胞時(shí)，第I階段的破壞構(gòu)建體可以通過同源重組整合到釀酒酵母宿主細(xì)胞基因組的GAL80位點(diǎn)，通過用其中的破壞序列替換GAL80的編碼序列，從而功能性破壞GAL80位點(diǎn)。第I階段破壞構(gòu)建體克隆到 TOPO Zero Blunt II 克隆載體上(Invitrogen, Carlsbad, CA)，產(chǎn)生了質(zhì)粒 TOPO-第 I階段破壞構(gòu)建體。在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂上生長的TOPlO細(xì)胞中擴(kuò)增該構(gòu)建體。第II階段破壞構(gòu)建體(圖2 ；SEQ ID NO :142)包含作為破壞序列的編碼選擇標(biāo)記物(natA，提供對(duì)諾爾斯菌素的抗性)的核苷酸序列，以及釀酒酵母MEV通路中的一些酶 (ERG12編碼序列，其編碼甲羥戊酸激酶，和ERG8編碼序列，其編碼磷酸甲羥戊酸激酶)，置于半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子(釀酒酵母基因GALl和GALlO的啟動(dòng)子)的調(diào)控下；還有釀酒酵母 GAL4基因的編碼序列，置于GAL4oc啟動(dòng)子(GAL4啟動(dòng)子包含除去MIGl結(jié)合位點(diǎn)的突變， 因此使啟動(dòng)子對(duì)葡萄糖的抑制不敏感)的調(diào)控下；側(cè)接有由釀酒酵母LEU2位點(diǎn)的上游和下游核苷酸序列組成的同源序列。當(dāng)轉(zhuǎn)入到釀酒酵母宿主細(xì)胞時(shí)，第II階段的破壞構(gòu)建體可以通過同源重組整合到釀酒酵母宿主細(xì)胞基因組的LEU2位點(diǎn)，通過用其中的破壞序列取代LEU2的編碼序列，從而功能性破壞LEU2位點(diǎn)。第II階段破壞構(gòu)建體克隆到TOPO Zero Blunt II克隆載體上，產(chǎn)生了質(zhì)粒TOPO-第II階段破壞構(gòu)建體。在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂上生長的TOPlO細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad, CA)中擴(kuò)增該構(gòu)建體。第III階段破壞構(gòu)建體(圖3 ；SEQ ID NO :143)包含作為破壞序列的編碼選擇標(biāo)記物(kanA，提供對(duì)G418的抗性)的核苷酸序列；釀酒酵母MEV通路的酶(ERG19編碼序列， 其編碼二磷酸甲羥戊酸脫羧酶)，以及釀酒酵母的兩種酶，其參與將MEV通路的產(chǎn)物IPP轉(zhuǎn)換為FPP (ERG20編碼序列編碼法尼基焦磷酸合酶，和IDI1編碼序列編碼異戊酸焦磷酸脫羥酶)，置于半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子(釀酒酵母基因GAL1、GAL10和GAL7的啟動(dòng)子)的調(diào)控下；還有釀酒酵母CTR3基因的啟動(dòng)子；側(cè)接有酵母ERG9位點(diǎn)的上游和編碼核苷酸序列。當(dāng)轉(zhuǎn)入到釀酒酵母宿主細(xì)胞時(shí)，第II階段的破壞構(gòu)建體可以通過同源重組整合到釀酒酵母宿主細(xì)胞基因組中的ERG9位點(diǎn)的上游，將天然的ERG9啟動(dòng)子替換為CTR3啟動(dòng)子，使得ERG9 (角鯊烯合酶)的表達(dá)可以被銅調(diào)節(jié)。第III階段破壞構(gòu)建體克隆到TOPO Zero Blunt II克隆載體上，產(chǎn)生了質(zhì)粒T0P0-第III階段破壞構(gòu)建體。在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂上生長的T0P10細(xì)胞中擴(kuò)增構(gòu)建體。第I階段標(biāo)記物循環(huán)構(gòu)建體(圖4 ；SEQ ID NO :144)包含編碼選擇標(biāo)記物(URA3，提供在缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長的能力)的核苷酸序列；A. annua的酶(FS編碼序列，其編碼金合歡烯合酶)，置于釀酒酵母GAL7基因的啟動(dòng)子的調(diào)控下；側(cè)接有釀酒酵母GAL80 位點(diǎn)的上游核苷酸序列和釀酒酵母HMGl基因的編碼序列。當(dāng)轉(zhuǎn)入到釀酒酵母宿主細(xì)胞時(shí)， 第I階段標(biāo)記物循環(huán)構(gòu)建體可以通過同源重組整合到已經(jīng)整合的第I階段破壞序列中，從而使選擇標(biāo)記物hphA被替換為URA3。第II階段標(biāo)記物循環(huán)構(gòu)建體(圖5 ；SEQ ID NO 145)包含編碼選擇標(biāo)記物(URA3， 提供在缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長的能力)的核苷酸序列；A annua的酶(FS編碼序列，編碼金合歡烯合酶)，置于釀酒酵母GAL7基因的啟動(dòng)子的調(diào)控下；側(cè)接有釀酒酵母LEU2位點(diǎn)的上游核苷酸序列和釀酒酵母ERG12基因的編碼序列。當(dāng)轉(zhuǎn)入到釀酒酵母宿主細(xì)胞時(shí)，第 II階段標(biāo)記物循環(huán)構(gòu)建體可以通過同源重組整合到已經(jīng)整合的第II階段破壞序列中，從而使選擇標(biāo)記物natA被替換為URA3。第III階段標(biāo)記物循環(huán)構(gòu)建體(圖6 ；SEQ ID NO :146)包含編碼選擇標(biāo)記物 (URA3，提供在缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長的能力)的核苷酸序列；A. annua的酶(FS編碼序列，編碼金合歡烯合酶)，置于釀酒酵母GAL7基因啟動(dòng)子的調(diào)控下；側(cè)接有釀酒酵母ERG9 位點(diǎn)的上游核苷酸序列和釀酒酵母ERG19基因的編碼序列。當(dāng)轉(zhuǎn)入到釀酒酵母宿主細(xì)胞時(shí)，第II階段標(biāo)記物循環(huán)構(gòu)建體可以通過同源重組整合到已經(jīng)整合的第III階段破壞序列中，從而使選擇標(biāo)記物kanA被替換為URA3。表達(dá)質(zhì)粒pAM404(SEQ ID NO :153)編碼β -金合歡烯合酶。插入核苷酸序列是通過合成產(chǎn)生，以青蒿的β-金合歡烯合酶基因(GenBank登錄號(hào)ΑΥ835398)的編碼序列為模板，并優(yōu)化了密碼子以適合在釀酒酵母中的表達(dá)。在含有100ug/mL羧芐青霉素和50ug/mL卡那霉素的5mLYPD培養(yǎng)基中，重懸浮活性PE-2干酵母(1994年分離，受贈(zèng)于Santelisa Vale, Sertaozinho, Brazi 1)，產(chǎn)生起始宿主菌株Y1198。培養(yǎng)物在30°C，200rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)過夜。每IOuL培養(yǎng)物在YPD平板上鋪板，放置干燥。細(xì)胞連續(xù)劃線以產(chǎn)生單菌落，在30°C培養(yǎng)2天。挑選12個(gè)單菌落，在新的 YPD平板上鋪板，在30°C生長過夜。根據(jù)制造商的說明書，使用Bio-Rad CHEF Genomic DNA Plug 試劑盒(Bio-Rad, Hercules, CA)在 Bio-Rad CHEF DR II 系統(tǒng)(Bio-I ad，Hercules, CA)上分析它們的染色體尺寸，以確定菌落的菌種。挑取一個(gè)菌落，作為菌種Y1198保存。通過使菌株Y1198成為單倍體以允許遺傳工程操作，從而生成菌株Y1661、Y1662、 Υ1663和Υ1664。將菌種Υ1198置于滾筒中的玻璃管中，在30°C，5mLYPD培養(yǎng)基中生長過夜。 測量0D600，用含有2%醋酸鉀的5mL YP培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至0D600為0. 2。培養(yǎng)物置于滾筒中的玻璃管中，在30°C生長過夜。再次測量0D600，5，000x g離心2分鐘，收集40D600*mL 的細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用無菌水清洗一次，然后重懸于3mL含有0.02%棉子糖的2%醋酸鉀中。 細(xì)胞放置于滾筒中的玻璃管中，在30°C生長3天。通過顯微鏡證實(shí)孢子的形成。將33yL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至1. 5mL離心管中，14，OOOrpm離心2分鐘。細(xì)胞沉淀重懸于含有2 μ L 10mg/mL Zymolyase IOOT (MP Biomedicals, Solon, OH)的 50 μ L 無菌水中，細(xì)胞在 30°C水浴中培養(yǎng) 10分鐘。離心管轉(zhuǎn)移至冰上，并加入150 μ L冰水。將10 μ L的該混合物加入到12mL YPD 平板上，在Singer MSM 300解剖顯微鏡(Singer，Somerset, UK)下分割四分體。YPD平板在30°C培養(yǎng)3天，之后將孢子接種到新鮮的YPD平板上，30°C生長過夜。通過菌落PCR，分析 8個(gè)四孢子的四分體中每個(gè)孢子的交配型。挑取具有2個(gè)MAI1E^nzfMATa孢子的單個(gè)4孢子四分體，并保存為菌種 Y1661 (MATa)、Y1662 (MATa)、Y1663 (ΜΑΤ α )和 Y1664 (ΜΑΤ α )。為轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，將起始宿主菌株的單菌落接種到25ml酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在30°C，200rpm旋轉(zhuǎn)振蕩器中過夜生長。檢測培養(yǎng)物的0D600， 之后將培養(yǎng)物接種于50ml YPD培養(yǎng)基中，至0D600為0. 15。新接種的培養(yǎng)物在30°C，200rpm 旋轉(zhuǎn)振蕩器中生長，直到0D600為0.7到0.9，此時(shí)用Iyg DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞。將細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基中恢復(fù)4個(gè)小時(shí)，然后將其鋪板到含有選擇劑的瓊脂糖上，以鑒定宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化株。將質(zhì)粒TOPO-第I階段破壞構(gòu)建體用RiieI限制性內(nèi)切酶消化完全，轉(zhuǎn)化菌株 Y1664，生成宿主菌株Y1515。在含有300ug/mL潮霉素B的YPD培養(yǎng)基上，選擇宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化株。通過PCR擴(kuò)增，鑒定包含整合在GAL80位點(diǎn)的第I階段破壞序列的陽性轉(zhuǎn)化株。將質(zhì)粒TOPO-第II階段破壞構(gòu)建體用RiieI限制性內(nèi)切酶消化完全，轉(zhuǎn)化菌株 Y1515，生成宿主菌株Y1762。在含有100Ug/mL諾爾斯菌素的YPD培養(yǎng)基上，選擇宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化株。通過PCR擴(kuò)增，鑒定包含整合在LEU2位點(diǎn)的第II階段破壞序列的陽性轉(zhuǎn)化株。將表達(dá)質(zhì)粒PAM404和質(zhì)粒TOPO-第III階段破壞構(gòu)建體用RiieI限制性內(nèi)切酶消化完全，通過兩個(gè)步驟轉(zhuǎn)化菌株Y1762，生成宿主菌株Y1770。在不含甲硫氨酸和亮氨酸的完全合成培養(yǎng)基(CSM)中，選擇帶有PAM404的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化株。在不含甲硫氨酸和亮氨酸以及含有200ug/mL G418 (Geneticin )的CSM上，選擇帶有pAM404和第III階段破壞構(gòu)建體的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化株，通過PCR擴(kuò)增，鑒定包含整合在ERG9位點(diǎn)的第III階段破壞序列的陽性轉(zhuǎn)化株。通過用URA3敲除構(gòu)建體(SEQ ID NO :154)轉(zhuǎn)化菌株Y1770，生成宿主菌株Y1793。 URA3敲除構(gòu)建體包含URA3位點(diǎn)的上游和下游序列(由釀酒酵母菌株CEN. PK2基因組DNA 生成)。在含有5-F0A的YPD培養(yǎng)基上挑選宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化株。通過用第一階段標(biāo)記物循環(huán)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化菌株Y1793，生成宿主菌株YAAA。在不含甲硫氨酸和尿嘧啶的CSM上挑選宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化株。在YPD培養(yǎng)基中，200rpm旋轉(zhuǎn)振蕩器上， 在30°C過夜培養(yǎng)細(xì)胞，然后把細(xì)胞接種在含有5-F0A的瓊脂上，從而切除URA3標(biāo)記物。用菌落PCR驗(yàn)證標(biāo)記物的切除。通過用第II階段標(biāo)記物循環(huán)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化菌株YAAA，生成宿主菌株YBBB。在不含甲硫氨酸和尿嘧啶的CSM上，挑選宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化株。在YPD培養(yǎng)基中，200rpm旋轉(zhuǎn)振蕩器上，在30°C過夜培養(yǎng)細(xì)胞，然后把細(xì)胞接種在含有5-F0A的瓊脂上，從而切除URA3標(biāo)記物。 用菌落PCR驗(yàn)證標(biāo)記物的切除。通過用第III階段標(biāo)記物循環(huán)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化菌株YBBB，生成宿主菌株Y1912。在不含甲硫氨酸和尿嘧啶的CSM上，挑選宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化株。在YPD培養(yǎng)基中，200rpm旋轉(zhuǎn)振蕩器上，在30°C過夜培養(yǎng)細(xì)胞，然后把細(xì)胞接種在含有5-F0A的瓊脂上，從而切除URA3標(biāo)記物。 用菌落PCR驗(yàn)證標(biāo)記物的切除。
6. 2實(shí)施例2 經(jīng)遺傳修飾的具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的單倍體細(xì)胞的產(chǎn)
生本實(shí)施例描述了一種在經(jīng)遺傳修飾的單倍體釀酒酵母細(xì)胞中，破壞孢子形成基因和信息素應(yīng)答基因，以產(chǎn)生具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的經(jīng)遺傳修飾的單倍體釀酒酵母細(xì)胞的示例方法。STE5破壞構(gòu)建體(圖7 ；SEQ ID NO :147)包含作為破壞序列的編碼選擇標(biāo)記物(URA3，提供在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長的能力)的核苷酸序列，釀酒酵母MEV通路的酶 (截短的HMGl編碼序列，編碼截短的HMG-CoA還原酶)，置于釀酒酵母TDH3基因啟動(dòng)子的調(diào)控下；側(cè)接有由釀酒酵母STE5位點(diǎn)的上游和下游核苷酸序列組成的同源序列。當(dāng)轉(zhuǎn)入到釀酒酵母宿主細(xì)胞時(shí)，可以通過同源重組將STE5破壞構(gòu)建體整合到釀酒酵母宿主細(xì)胞基因組的STE5位點(diǎn)，將STE5的編碼序列替換為破壞序列，從而功能性破壞STE5位點(diǎn)。IMEl破壞構(gòu)建體(圖8 ；SEQ ID NO :148)包含作為破壞序列的編碼選擇標(biāo)記物 (LEU2，提供在不含亮氨酸的培養(yǎng)基上生長的能力)的核苷酸序列，A. annua的酶(FS編碼序列，其編碼金合歡烯合酶)，置于釀酒酵母TDH3基因啟動(dòng)子的調(diào)控下；側(cè)接有由釀酒酵母 IME5位點(diǎn)的上游和下游核苷酸序列組成的同源序列。當(dāng)轉(zhuǎn)入到釀酒酵母宿主細(xì)胞時(shí)，可以通過同源重組將IMEl破壞構(gòu)建體整合到釀酒酵母宿主細(xì)胞基因組的IMEl位點(diǎn)，將IMEl的編碼序列替換為破壞序列，從而功能性破壞IMEl位點(diǎn)。通過用STE5破壞構(gòu)建體(見實(shí)施例1)轉(zhuǎn)化菌株Y1912，生成宿主菌株Y1913。在不含甲硫氨酸和尿嘧啶的CSM上，挑選宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化株。通過PCR擴(kuò)增，鑒定陽性轉(zhuǎn)化株。通過將菌株Y1913從pAM404中恢復(fù)(curing)，并用IMEl破壞構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所獲得的宿主，生成菌株Y1915。在200rpm旋轉(zhuǎn)振蕩器中，在30°C下，將菌株Y1913在非選擇性 YPD培養(yǎng)基中增殖3天。將大約100個(gè)細(xì)胞鋪板到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上，在30°C生長3天，然后將其復(fù)制接種到不含甲硫氨酸和亮氨酸的CSM平板上，繼續(xù)在30°C生長3天。在含有亮氨酸的基本培養(yǎng)基上具有生長能力，且在不含亮氨酸的培養(yǎng)基上無法生長的細(xì)胞被鑒定為恢復(fù)的細(xì)胞。挑選這樣的單一菌落，然后用IMEl破壞構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。在不含甲硫氨酸和亮氨酸的CSM上，挑選宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化株。
6. 3實(shí)施例3 經(jīng)遺傳修飾的具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的二倍體細(xì)胞的產(chǎn)
生本實(shí)施例描述了一種示例方法，用于使具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的經(jīng)遺傳修飾單倍體釀酒酵母細(xì)胞成為二倍體。二倍體宿主菌株Y1979是由菌株Y1915自交配產(chǎn)生的。為了產(chǎn)生相反交配型的細(xì)胞，并使菌株Y1915具有短暫的交配能力，用編碼HO蛋白質(zhì)和諾爾斯菌素抗性標(biāo)記物的質(zhì) Ι ρΑΜΙ 124 (SEQ ID NO :149)和編碼 STE5 和 G418 抗性標(biāo)記物的質(zhì)粒 pAM1758 (SEQ ID NO: 150)共轉(zhuǎn)化菌株。在含有G418和諾爾斯菌素的CSM上挑選宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化株。在非選擇性培養(yǎng)基上重新鋪板陽性轉(zhuǎn)化株，使成單菌落，通過菌落PCR篩選，鑒定對(duì)G418和諾爾斯菌素敏感的二倍體。
6. 4實(shí)施例4 對(duì)孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的證實(shí)本實(shí)施例描述了一種示例的方法，用來證實(shí)經(jīng)遺傳修飾的釀酒酵母細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙。為了證實(shí)菌株Y1915沒有交配能力，將單倍體Y1915細(xì)胞(ΜΑΤ α KarfURA3~ste5) 或者單倍體Y1912細(xì)胞(ΜΑΤ α KansURA3STE5)在YEPD固體培養(yǎng)基上與單倍體Y1792細(xì)胞 (MATa KanE ura3STE5)結(jié)合。交配培養(yǎng)物在30°C培養(yǎng)16小時(shí)。將相同量的每種交配培養(yǎng)物鋪板到不含尿嘧啶且含有G418的CSM固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)物在30°C培養(yǎng)一周。如圖9所示，只有在含有等量的Y179h Y1912交配培養(yǎng)物的平板上可以觀察到菌落生長，而在含有等量的Y179h Y1915培養(yǎng)物的平板上觀察不到。
為了確認(rèn)菌株Y1979沒有孢子形成的能力，菌株Y1979細(xì)胞和菌株Yl 198細(xì)胞在孢子形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中不含非發(fā)酵碳源，如醋酸鉀，其可以誘導(dǎo)天然的釀酒酵母細(xì)胞停止細(xì)胞有絲分裂周期而進(jìn)入減數(shù)分裂和孢子形成)中培養(yǎng)7天。隨后將培養(yǎng)物分成幾份，并用水或乙醚處理15分鐘。通過倒置使懸液均勻，在無菌水中重懸，稀釋，鋪板到 YEPD固體培養(yǎng)基上，生長3天。如圖10所示，95%的菌株Y1198的細(xì)胞形成了四分體孢子， 而同樣的條件下的菌株Y1979的細(xì)胞則沒有。
6. 5實(shí)施例5 對(duì)具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的細(xì)胞在自然界中沒有傳播能力的證實(shí)本實(shí)施例描述了一種示例方法，用以證實(shí)具有內(nèi)源性交配障礙的經(jīng)遺傳修飾的釀酒酵母細(xì)胞沒有孢子形成能力，在自然界中不能傳播。評(píng)估了 Y1979以及其非轉(zhuǎn)基因的等基因系Y1198(PE_2)在土壤中的存活。為此， 在45L燒瓶中加入大約25%的蛭石和75%的甘蔗園土壤(共40L)，并種植了 ISaccharum 屬，RB 86-7515甘蔗植物品種(大約6個(gè)月大)。每盆用5-25-30的氮/磷/鉀混合物施月巴，植物在隔離溫室中生長14天。每盆加入600mL菌株Y1979或菌株Y1198的細(xì)胞懸液。 使用的酵母細(xì)胞的量相當(dāng)于在土壤第一表面的5cm能達(dá)到IO7個(gè)細(xì)胞/g的濃度。按照下面的時(shí)間點(diǎn)收集五個(gè)1. 5cm的土壤核心的樣品t = 0(暴露前)、0(暴露后)、3、7、14、 28,40,60和90天(土壤樣品總體積為44mL，土壤樣品總重量大約50g)。從復(fù)合樣品中分離10克，并重懸于IOOmL蒸餾水中。為了對(duì)存活的酵母進(jìn)行定量，直接在YEPD培養(yǎng)基上鋪板100 μ L水提取物(25mL/板)，培養(yǎng)基用6N硫酸調(diào)節(jié)至pH 5. 5，加入了 0. 05g/L孟加拉玫瑰紅(Sigma#R3877)并含有0. 2g/L氨芐青霉素(SigmaA0166)。將樣品重復(fù)鋪板，按照從I-IO7的一系列稀釋度，或者根據(jù)之前每一次處理中取樣測得的存活數(shù)量來決定接種的稀釋倍數(shù)。鋪板液體后，立即用Drigalski鏟把液體涂開。平板開口放置30分鐘，使液體完全蒸發(fā)，然后蓋上，倒置，在30°C培養(yǎng)48小時(shí)。在可以計(jì)數(shù)的稀釋度中，用菌落計(jì)數(shù)器 (CP600Plus, Phoenix)計(jì)數(shù)每板的菌落數(shù)量，結(jié)果表示為CFU/板。只有總菌落數(shù)在30-300 個(gè)菌落時(shí)，計(jì)數(shù)才有效。如圖11所示(每個(gè)數(shù)據(jù)都是五次重復(fù)的平均數(shù))，Y1979細(xì)胞在土壤中生存力明顯低于未經(jīng)遺傳修飾的且能高效形成孢子和交配的菌株Υ1198的母細(xì)胞。本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均在此參考并入，如同其中的每一篇出版物或?qū)＠暾?qǐng)都被明確地、單獨(dú)地指明參考并入一樣。雖然為了理解清楚，通過例證和實(shí)施例詳盡地描述了上述發(fā)明，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易知道，在不脫離本發(fā)明宗旨或權(quán)利要求保護(hù)范圍的前提下，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行某些改變或修飾。
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，包含(a)在至少一個(gè)孢子形成基因中的功能性破壞；(b)在至少一個(gè)信息素應(yīng)答基因中的功能性破壞；和(c)整合在染色體上的編碼目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列；其中所述經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞為異宗配合的(ho)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞為二倍體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞為二倍體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞除其交配型等位基因以外是純合的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞為單倍體。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞為單倍體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼功能性的同宗配合(HO)蛋白的重組質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，進(jìn)一步包含至少一個(gè)重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒編碼在所述經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞中被功能性破壞的所述至少一個(gè)信息素應(yīng)答基因的功能性拷貝。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述釀酒酵母細(xì)胞是 Baker，s 酵母、Mauri、Santa Fe、ΙΖ-1904、ΤΑ、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Y-904、PE-2、PE-5、 VR-1、BR-1、BR-2、ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-1 或 AL-1 菌株。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述釀酒酵母細(xì)胞是PE-2菌株。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述釀酒酵母細(xì)胞是CAT-I 菌株。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述至少一個(gè)孢子形成基因選自下組IME1、IME2、NDT80、SPOl 1、SP020、AMAl、H0P2 和 SP021。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，所述至少一個(gè)信息素應(yīng)答基因選自下組:STE5、STE4、STE18、STE12、STE7 和 STEl 1。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞包含IMEl基因的功能性破壞。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞包含STE5基因的功能性破壞。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞包含IMEl基因和STE5基因的功能性破壞。
19.根據(jù)權(quán)利要求9所述的經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞包含 STE5基因的功能性破壞和編碼功能性STE5蛋白的重組質(zhì)粒。
20.一種具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞的生成方法，包括(a)用至少一個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，該質(zhì)粒編碼的蛋白能夠互補(bǔ)于所述第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞中的內(nèi)源性交配障礙，其中所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙，并且包含整合在染色體上的編碼目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列，且其中所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙，具有與所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞相反的交配型，并且包含整合在染色體上的編碼目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列；(b)將所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞與所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞交配，從而形成經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞；并且(c)從所述經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞中清除所述一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒，其中所述生成的經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙， 并且包含整合在染色體上的編碼所述目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列的兩個(gè)拷貝。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞和所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞由于至少一個(gè)信息素應(yīng)答基因被功能性破壞，而具有內(nèi)源性交配障礙。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中步驟(a)包括用至少一個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，所述質(zhì)粒編碼在所述第一和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞中被功能性破壞的所述至少一個(gè)信息素應(yīng)答基因的功能性拷貝。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述信息素應(yīng)答基因選自下組STE5、STE4、 STE18、STE12、STE7 和 STEl 1。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述信息素應(yīng)答基因選自下組STE5、STE4、 STE18、STE12、STE7 和 STEl 1。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述信息素應(yīng)答基因是STE5。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述信息素應(yīng)答基因是STE5。
27.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞由于至少一個(gè)孢子形成基因被功能性破壞，而具有孢子形成障礙。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述孢子形成基因選自下組IME1、IME2、 NDT80、SPOl 1、SP020、AMAl、H0P2 和 SP021。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述孢子形成基因是IMEl。
30.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞和第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞由于STE5基因被功能性破壞而具有內(nèi)源性交配障礙，并且由于IMEl基因被功能性破壞而具有孢子形成障礙。
31.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞是通過在第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞的種群中誘導(dǎo)交配型轉(zhuǎn)換而得到。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞的種群是異宗配合的(ho)，并且其交配型轉(zhuǎn)換的誘導(dǎo)是通過用編碼功能性的同宗配合(HO)蛋白的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，其中所述HO蛋白的表達(dá)能夠誘導(dǎo)所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)換交配型。
33.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述釀酒酵母細(xì)胞是Baker’s酵母、IZ-1904、 TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Y-904、PE-2、PE-5、VR-1、BR-1、BR-2、ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、 CAT-I、CB-I、NR-I、BT-I 或 AL-1 菌株。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述釀酒酵母細(xì)胞是PE-2菌株。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述釀酒酵母細(xì)胞是CAT-I菌株。
37.以權(quán)利要求20-36任一項(xiàng)的方法生成的具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的二倍體酵母細(xì)胞。
38.一種具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的經(jīng)遺傳修飾的異宗配合(ho)的二倍體酵母細(xì)胞的生成方法，包括(a)用編碼功能性同宗配合(HO)蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第一經(jīng)遺傳修飾的異宗配合的單倍體酵母細(xì)胞的種群，以生成第一經(jīng)遺傳修飾的的單倍體酵母細(xì)胞，其中HO蛋白的表達(dá)能夠誘導(dǎo)所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)換交配型，從而獲得與所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞交配型相反的第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞，其中所述第一經(jīng)遺傳修飾的異宗配合的單倍體酵母細(xì)胞包含整合在染色體上的編碼目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列以及在STE5基因和IMEl基因中的功能性破壞；(b)用編碼STE5蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述第一和所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞， 所述轉(zhuǎn)化使得所述第一經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞與所述第二經(jīng)遺傳修飾的單倍體酵母細(xì)胞交配，從而生成經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞；并且，(c)從所述經(jīng)遺傳修飾的二倍體酵母細(xì)胞中清除所有的質(zhì)粒，以生成經(jīng)遺傳修飾的異宗配合的二倍體酵母細(xì)胞，其中產(chǎn)生的經(jīng)遺傳修飾的異宗配合的二倍體酵母細(xì)胞具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙，并且包含整合在染色體上的編碼所述目標(biāo)蛋白的異源核苷酸序列的兩份拷貝。
39.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的異宗配合(ho)的二倍體酵母細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述釀酒酵母細(xì)胞是Baker’s酵母、Mauri、 Santa Fe、IZ-1904、TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Y-904、PE-2、PE-5、VR-1、BR-1、BR-2、ME_2、 VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-I 或 AL-I 菌株。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述釀酒酵母細(xì)胞是PE-2菌株。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述釀酒酵母細(xì)胞是CAT-I菌株。
43.由權(quán)利要求38-42任一項(xiàng)的方法生成的具有孢子形成障礙和內(nèi)源性交配障礙的異宗配合的(ho) 二倍體酵母細(xì)胞。
44.一種 MATa/a ste5/ste5 imel/imel 酵母細(xì)胞。
全文摘要
本申請(qǐng)?zhí)峁┝私?jīng)遺傳修飾的微生物的生成方法，例如經(jīng)遺傳修飾的酵母菌株，所述微生物的一個(gè)或多個(gè)信息素應(yīng)答基因和一個(gè)或多個(gè)孢子形成基因中含有功能性的破壞，以及由此方法產(chǎn)生的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞，如經(jīng)遺傳修飾的二倍體和單倍體酵母細(xì)胞，其缺乏孢子形成能力和內(nèi)源性交配能力。
文檔編號(hào)C12R1/865GK102482636SQ201080024339
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月1日
發(fā)明者J·A·尤伯薩克斯 申請(qǐng)人:阿邁瑞斯公司